Biologia Celular - Cultura de Células

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Cultura de Células
Luana Borba
luanaborba@biof.ufrj.br
biocelxerem2016.2@gmail.com
Senha: biocelxerem
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
POLO DE XERÉM
DISCIPLINA: BIOLOGIA CELULAR
2016.2
Por quê cultivar células?
Para estudar as células nós
precisamos cultivá-las!
O que é o cultivo de células?
Cultivar células consiste em manter vivas
células retiradas de um organismo.
etc...
Para que cultivar células?
Cultura de 
células
Bioengenharia
Diferenciação 
celular
Metabolismo 
celular
Interação celular
Terapia celular
Transplantes de 
tecidos
Produção de 
hormônios
Diagnóstico 
laboratorial
Produção de 
vacinas
Estudos de 
análises de 
citotoxicidade
Estudos de 
biocompatibilidade
Breve Histórico
- Início no princípio do século XX com Harrison (1907) e
Carrel (1912) método para estudar o comportamento
de células animais fora do organismo, em um meio
controlado.
Harrison Carrel
Breve Histórico
- Nos primeiros experimentos:
Cultivo de células a partir de tecidos fragmentados
mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais
de onde provinham os tecidos.
Harrison queria provar que as fibras nervosas
eram formadas a partir de células nervosas.
Era necessário observar essas células fora do 
organismo para comprovar sua teoria. 
Breve Histórico
Experimento de Harrison:
Harrison mimetizou as condições básicas necessárias para o
crescimento da célula, utilizando células do tubo medular de um
embrião de sapo e sua linfa fresca.
Harrison teve o cuidado de manter as condições assépticas.
Harrison observou sua preparação ao microscópio todos os dias..
Suas considerações sobre a possibilidade de se manter in vitro
células vivas por mais de uma semana foram um marco para a
cultura de células.
Breve Histórico
Em 1912, Alexis Carrel desenvolveu um modelo a partir de
células cardíacas de embrião de galinha para o cultivo de
células.
Carrel descobriu a necessidade da troca de fonte de nutrientes
contidos nos frascos. Essa renovação constante de nutrientes
em cultivo permitiu que as células pudessem ser cultivadas
por períodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison.
Breve Histórico
- Em 1916, Peton Rous e Fred Jones desenvolveram o método de
subcultivo para explantes empregando tripsina em tecidos de aves
e mamíferos.
- Em 1923, Carrel e colaboradores desenvolveram os primeiros
frascos de cultura, circulares e de vidro, chamados frascos-D.
- Em 1948, Keilova adicionou o uso de antibióticos em culturas
de células.
- Entre 1952-1959, Eagle, Sanford, Leibovity e Dulbecco
desenvolveram os meios básicos para cultivo (Eagles basal
medium, Eagles minimum essential medium, L15, Dulbecco’s
modified Eagle’s medium,...).
Breve Histórico
- Em 1952, George Gey cultivou células de tecido tumoral
humano (carcinoma cervical) estabelecendo a linhagem HeLa,
utilizada até hoje em todo o mundo.
Breve Histórico
Em 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorehead verificaram
que as células param de se proliferar após um número finito de
vezes.
Breve Histórico
Em 1962, Leonard Hayflick desenvolveu a
linhagem de células WI-38, utilizada até hoje
para produção de vacinas.
Em 1962, Nakamura e colaboradores estabeleceram a
linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano
(Cercopithecus aethiops).
Essa célula é uma das poucas, na atualidade, aprovadas para uso
em produção de vacinas pela OMS.
Breve Histórico
Tipos de cultura: cultura primária e secundária
Cultura primária estabelecida a partir do crescimento de células
oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica
ou enzimática.
Essas células possuem as
características do tecido de
origem, podem crescer em
cultura por um determinado
período de tempo e são
denominadas células
primárias.
- Células que ainda não perderam as características do tecido de origem,
mas possuem alta proliferação.
- Podem ser mantidas em cultura por um grande período de tempo (quando
comparado às células primárias).
- Muitas linhagens celulares contínuas podem ser propagadas sem perder
suas características por até oitenta passagens!
Tipos de cultura: linhagem contínua
Essas células são muito utilizadas em
pesquisa e na produção de vacinas, como é
o caso da linhagem MRC-5, oriunda de
tecido de pulmão de feto humano e
utilizada na produção da vacina de rubéola.
Apresentam características genéticas modificadas, deixando de ser
semelhantes morfologicamente e geneticamente ao tecido original.
Isoladas a partir de tumores.
Alta taxa de multiplicação mantidas em cultura indefinidamente.
Exemplos: Linhagem de células epiteliais –HeLa, células de carcinoma
de rato‐ CACO‐2
Tipos de culturas: linhagem transformada
Tipos de culturas: células aderentes e não-aderentes
Células aderentes crescem aderidas a um substrato
Células não-aderentes crescem em suspensão
Exemplos: células hematopoiéticas,
bactérias, fungos, protozoários...
Diferentes tipos celulares podem ser cultivados
Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero
Células podem ser cultivadas em
diferentes superfícies plásticas.
Temperatura: 37°C
Umidade: 95%
CO2: 5%
Condições de esterelidade (capela de
fluxo laminar, materiais
autoclavados, meios filtrados, etc.)
Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero
Obs: O CO2 é importante
para manter o pH 7,0-7,6
Também são adicionados agentes 
tamponantes ao meio de cultura 
Exemplos: bicarbonato de sódio e 
HEPES
A medida que as células crescem em
cultura, ocorre produção de
metabólitos que alteram o pH do
meio. Esta variação pode ser
prejudicial para a célula.
Meio de cultura
É uma mistura de moléculas necessárias à nutrição da célula.
Composição:
◦ água
◦ sais inorgânicos;
◦ açúcares;
◦ aminoácidos;
◦ ácidos orgânicos;
◦ proteínas;
◦ hormônios;
◦ fontes de carbono;
◦ vitaminas;
◦ lipídeos;
◦ fontes de nitrogênio;
◦ micronutrientes (íons orgânicos e minerais), etc.
Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero
+ antibióticos e antifúngicos
O meio de cultura deve ter
osmolaridade e pH adequados para
o tipo celular em estudo.
Meios de cultura mais comuns:
BME – Basal de Eagle
EMEM – Mínimo de Eagle
DMEM – Dulbecco – 4x aminoácidos , vitaminas
GMEM – Glasgow – 2x aminoácidos , vitaminas + glicose e
bicarboanto
RPMI – Roswell Park Memorial
Leibovitz – fibroblastos
Alfa MEM – varios propósitos
Ham´s F10 – embriões de galinha
Ham`s F12 – complexo de suplementos
Ham´s F14 – estudo de neurônios sensoriais
IMDM – Iscove
MCDB – fibroblastos humanos
KO-DMEM
Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero
Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero
Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular
Clonagem reprodutiva e terapêutica
Figura 8.6 Biologia Molecular da Célula, 2008.
Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular
Figura 8.5 Biologia Molecular da Célula, 2008.
Células-tronco
Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular
Produção de células híbridas
Figura 8.7 Biologia Molecular da Célula, 2008.
Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular
Produção de anticorpos
Figura 8.8 Biologia Molecular da Célula, 2008.
https://www.youtube.com/watch?v=z_aK6pH3_G8
Vídeo 1: Cultura de células de mamífero
https://www.youtube.com/watch?v=xJannNQPors
Vídeo 2: Cultivo de bactérias em meiosólido
Bibliografia
Capítulo 8 – Manipulação de proteínas, DNA e
RNA.
Biologia Molecular da Célula (5 edição, 2007 ou 6 edição,
2015).