Relatório aula 5 Caseína corrigido

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Eduarda Batu
Guilherme Amaral
Julia Emanuelle 
Julia Roberta Kriese
Karina Kerschner 
Laura Jacoby
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DE CASEÍNA 
Relatório de Aula Prática
Cruz Alta – RS, 2018
INTRODUÇÃO E OBJETIVO 
A caseína vem do latim "caseus", queijo é uma proteína do tipo fosfoproteína encontrada no leite fresco, representa cerca de 80% do total de proteínas do leite. Quando coagulada com renina é chamada de caseína de coalho e, quando coagulada através da redução de pH (utilização de ácidos) é chamada "caseína ácida". 
A caseína não coagula com o calor. É precipitada pelos ácidos ou pela renina, uma enzima proteolítica produzida no estômago dos vitelos (bezerros) recém-nascidos (também é produzida por alguns tipos de plantas e micróbios). A enzima tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato, contém um número razoavelmente alto de peptídeos de prolina que não interagem não apresenta nenhuma ponte dissulfeto, como consequência apresenta relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas globulares. Por isso não pode desnaturar, é relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco solúvel em água, é encontrada no leite como uma emulsão de partículas de caseína (micelas de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila (polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de cálcio e interações hidrofóbicas (BRACHT, LUIZA, 2003)
O ponto isoelétrico da caseína é 4.6, é o ponto de pH em que ela precipita (coagulação ácida). A proteína purificada é insolúvel em água enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde, e é usada na produção produtos farmacêuticos (PERES, 2014)
	O objetivo da prática é fazer a extração da caseína, realizar a dosagem quantitativa de caseína no leite e sua caracterização. 
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O leite é uma fonte comum de proteína animal de grande importância na alimentação humana. O leite de vaca contém dois grandes grupos de proteínas: caseínas e as proteínas do soro. As caseínas se subdividem em quatro grupos. Dentre elas, a beta-caseína é a segunda mais abundante no leite de vaca, constituindo até 45% das caseínas totais e contém 209 aminoácidos. (SULIMOVA, 2007) 
Um total de 155 bovinos das raças Caracu, Gir, Holandês e Sindi, foram investigados. O DNA genômico foi obtido a partir de 6-8 folículos (pêlo com bulbo/amostra) coletados da cauda. O protocolo de extração utilizado foi o método salino, que consistiu em incubar as amostras.
A técnica de PCR-RFLP empregada no presente estudo permitiu conhecer a variabilidade genética de bovinos em relação ao gene ß-caseina. O produto de 325pb obtido por PCR, após hidrólise com a enzima de restrição NsiI, revelou dois padrões de restrição.	Considerando que a ß-caseina do tipo A1 está relacionada a processos alérgicos e intolerância alimentar, doenças coronarianas, entre outras, além de, não ser adequada ao processo de fabricação de queijos nobres, recomenda-se a identificação prévia e/ou a seleção precoce de reprodutores com genótipos A2, a fim de agregar valor nutricional ao leite, e implementar o programa de melhoramento genético (HANUSOVÁ, 2010)
A primeira prova do controle de qualidade do leite é o alizarol, às vezes substituída pela prova do álcool. Deve ser realizada sempre que ocorrer a mistura de leites durante a cadeia produtiva, como nos resfriadores comunitários, na coleta pelos caminhões tanque e na recepção pela indústria. O objetivo é verificar a estabilidade da caseína. 
Um grande número de amostras de leite instável sem acidez adquirida foi detectado nesse estudo. Das 53 amostras instáveis ao alizarol apenas 16 possuíam acidez acima de 18° Dornic, o restante das 37 amostras apresentou acidez Dornic entre 14 e 18ºD. (LIMA, LARA, 2015)
Outros fatores além da acidez reduzem a estabilidade da caseína quando se utilizam graduações alcoólicas maiores na prova do álcool ou do alizarol. O aumento da graduação alcoólica na prova do álcool leva ao descarte desnecessário de leite pela indústria. A prova do álcool na graduação de 68% (v/v) se mostrou eficiente na avaliação da estabilidade térmica do leite. Contudo, para avaliar a qualidade do leite outras provas são necessárias como CCS, CBT, acidez Dornic entre outras. (LIMA, LARA, 2015)
3. MATERIAIS E MÉTODOS
 
Materiais
Solução de leite + Água destilada
Solução de ácido acético 
Solução de éter etílico
Solução de etanol absoluto 
Béqueres
Espectrofotômetro
Solução Reagente de Biureto
Centrifuga
Solução de Hidróxido de sódio 2N
Solução padrão de albumina 10 mg/ml reagente de biureto
Métodos 
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO: em um béquer de 100 ml que tinha 10 ml de leite foi colocado 40 ml de agua destilada, após foi retirado 1 ml e realizado a reação com biureto ( 4 ml de biureto + 1ml da amostra) e então analisado. Depois foi observado o pH e então acrescentado gota a gota de ácido acético 5% até que formasse precipitação onde o pH estava perto de 4,6. Foi deixado em repouso por 5 minutos, agitado e retirado 10ml. Após isso foi centrifugado a 3000rpm por 10 minutos e recolhido o sobrenadante, determinando assim o teor de proteínas no sobrenadante. Foi adicionado depois 2ml de éter etílico e com um bastão homogeneizado , centrifugado a 3000rmp por 2 minutos e desprezado o sobrenadante ,adicionamos novamente o éter etílico homogeneizado e centrifugado e desprezado o sobrenadante. Por fim foi adicionado 2ml de hidróxido de sódio 2 N e redissolvido o precipitado complementando com agua destilado para ter um volume final igual 5 ml. Realizado então a dosagem de proteína. 
DOSAGEM: foi retirado 0,2ml de amostra e acrescentado 0,8ml de água, 4 ml do reagente de biureto e feito a leitura em branco em 540nm. Determinando assim a concentração de caseína através das curva de calibração e depois calculado a concetração de caseína em 100ml de leite. 
4. RESULTADO E DISCUSSÃO
 	Leite é um líquido com alto valor nutritivo constituído por água carboidratos, gorduras, proteínas, minerais e vitaminas. Este nutriente apresenta benefícios na proteção, construção ou fortalecimento dos organismos. Em geral, as proteínas são macromoléculas orgânicas formadas por aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Elas apresentam diversas funções no organismo como: estrutural, hormonal, enzimática, imunológica, nutritiva e de transporte citoplasmático. As proteínas constituem 3,5% do leite sendo que cerca de 80% destas pertencem ao grupo das caseínas, existindo cinco compostos derivados desta substância: αs1, αs2, β, k, λ, sendo que estas se encontram organizadas em gotículas, denominadas micelas de caseína. A absorção da caseína é lenta devido à formação de um gel no intestino em presença da mesma, tendo eficiência na redução do catabolismo muscular (evitando a quebra da massa magra) e na estimulação da síntese proteica. 
As amostras foram analisadas e separadamente feito o teste de absorbância determinada pelo espectrofotômetro que exibiu os seguintes resultados: 
Amostra 1- somente biureto, [1,227]
Amostra 2 – com sobrenadante [0,608]
Amostra 3 – amostra final [0,523]
	Abaixo estão os cálculos para descobrir a concentração de proteína de acordo com a fórmula: absorbância total (o valor medido pelo espectrofotômetro), divido pela absorbância do padrão e multiplicado pelo valor de Fc que é 3,8.
Segue os resultados respectivamente com o número da amostra:
ABT/ABP X FC= 1,227/0,245 X 3,8= [19,03] concentração de proteína na amostra.
ABT/ABP X FC= 0,608/0,245 X 3,8 = [9,43] concentração de proteína na amostra.
ABT/BP X FC = 0,523/0,245 X 3,8 = [8,11] concentração de proteína na amostra 
	
De acordo com o gráfico acima, é possível analisar uma curva em decrescimento, ou seja, conforme foram feitas as adições de reagentes e soluções acaseína se mostrou menor, como resulta o espectrofotômetro e a partir dos cálculos realizados.
	O reagente de Biureto é usado pelo fato de que a espectrofotometria é baseada na absortividade de moléculas no espectro visível, ou seja, a substância em questão deve encontrar-se em meio colorido para que seja possível a análise espectrofotométrica. Por isso utilizamos sempre um tubo com solução incolor, geralmente contendo somente água destilada para fazer a calibração do espectrofotômetro.
5. CONCLUSÃO
	As proteínas apresentam solubilidades variadas em função do pH e cada uma delas possui ponto isoelétrico próprio, no qual a estrutura apresenta a menor solubilidade em água. Pelos resultados obtidos, até este momento, pode-se afirmar que o ponto isoelétrico da caseína se encontra entre o pH 4 e 5, o valor é semelhante ao encontrado em literatura que é de pH=4,7, comprovando a eficiência das etapas de separação descritas pelo método com o auxílio da centrifugação. 
Através deste experimento tivemos a oportunidade de analisar a importância da caseína no leite, esta que atua principalmente como um agente emulsificante e tem por função manter unidas as moléculas de água e de gordura que o compõem. Além disso a grande variedade de aminoácidos confere à caseína um importante valor nutritivo, sendo, por isso, classificada como proteína nutriente ou de armazenamento.
REFERÊNCIAS 
Métodos de Laboratório em Bioquímica - Bracht, Adelar - Iwamoto, Emy Luiza Ishii . 1. ed. São Paulo: Manole, 2003.
POLIMORFISMO DO GENE ß-CASEÍNA EM BOVINOS (Lima A.C.J., Lara M.A.C.), disponível em: http://www.iz.sp.gov.br/pdfs/1450267879.pdf, acessado em 28 de Abril de 2018.
Polimorfismo alélico do gene da kappa-caseína (CSN3) em raças bovinas da Rússia e seu valor informativo como marcador genético. (Sulimova GE , Azani Abani M , Rostamzadeh J , Mohammad Abani MR , Lazebnyĭ OE ), disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17333943, acessado em 28 de Abril de 2018.
Extração, Purificação e Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína do Leite
 Andrade, J.; Calixto, C.; Gabriel, J.; Gomes, L; Silva, T.; Palumbo, M., disponível em: http://www.abq.org.br/cbq/2012/trabalhos/14/557-14229.html, acessado em 28 de Abril de 2018.