Mapas de restrição e géis de eletroforese in silico

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PARÁ – UFOPA. 
INSTITUTO DE BIODIVERSIDADE E FLORESTAS – IBEF 
PROGRAMA DE BIOTECNOLOGIA – Pnat2012 
MARCADORES MOLECULARES 
 
 
 
 
Enzimas de Restrição e Produção in silico de Géis de Eletroforese. 
JOSE CÁSSIO FIGUEIRA COSTA 
 
 
Atividade presentada como quesito 
avaliativo da disciplina de 
Marcadores Moleculares, ministrado 
pelo Profº Drº Carlos Ivan, docente 
do Curso de Biotecnologia (2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Santarém – Pará 
Outubro de 2014 
 
Enzimas de Restrição e Produção in silico de Géis de Eletroforese. 
Inicialmente, aconselha-se a utlização de sequências de DNA curtas, 
devido a dificuldade de montar um esquema em forma de gel eletroforético, 
podendo gerar géis com bandas desordenadas e imprecisas, visto que dependendo da 
enzima de restrição utilizada, pode haver multiplas clivagens, sendo elas por vezes 
muito próximas (gerando pequenas sequências), ao mesmo passo que pode ocorrer 
clivagens com produtos extensos, tonando a montagem do gel abstruso. 
 
 PASSOS PARA ESCOLHA DA SEQUÊNCIA. 
Entrar no Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 
 
Barra de Pesquisa: Adicionar termo de indexação referente ao gene, sequência, animal, 
planta, microorganismo, etc., de interesse. 
 
Aba Expansiva: Escolha o tipo de dado desejado, assim evitando buscas extensivas. 
 
Selecionar: “Nucleotide”. 
Após escolha do tipo de dado (Banco de dados) e inserção do termo de indexação, 
pesquise (“Search”). 
 
A página de resultados mostrará diversas sequências de nucleotídeos depositados do 
GenBank relacionados ao que foi pesquisado. 
 
Escolha uma sequência de interesse dentre os diversos dados, e clique sobre o título 
com a qual a sequência foi depositada. 
 
Uma página contendo todos os dados referentes à sequência de nucleotídeos, além do 
trabalho do qual tal dado se originou, etc. além da sequência de DNA irão carregar. 
 
 
Como o site comercial da BioLabs utiliza (“Roda”) apenas sequências em formato 
FASTA (>*****) ou o ID da sequência, clique na Aba “Display Settings”. 
 
Selecione o formato (“Format”) “FASTA (text)” e clique em “Apply”. E copie toda a 
sequência (Ctrl + C), ou copie o código dado ao lado de GenBank. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Com a sequência já copiada, inicia-se o segundo passo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 PROCESSO DE BUSCA DE ENZIMAS EM SITE COMERCIAL (NEB 
cutter 2v). 
Acessar o site: http://tools.neb.com/NEBcutter2/ 
É uma página comercial da BioLabs Inc. que indicará enzimas específicas que 
clivam uma sequência de DNA de interesse. 
 
Adicione a sua sequência na área “or paste in your DNA sequence”. E marque a caixa 
“All commercially avaible specificities”. Clique “Submit”. 
 
Uma página contendo um gráfico aparecerá, o qual mostra a sequência de DNA e as 
diversas enzimas que a clivam e o local onde ocorre o “Corte”. 
 
A partir disso, pode-se apurar os dados apresentados definindo em quantos locais a 
enzima deve clivar (Em 1, 2, 3, 4, 5, etc.). 
 
Em “Display” há duas opções ( 2 “Cortes” ou 3 “Cortes”), e em “List” (0 “Corte” ou 1 
“Corte”), esse parâmetro defini a quantidade de produtos que se deseja obter após a 
clivagem. 
Exemplo: Será selecionado uma enzimas de restrição que clivam em dois pontos 
diferentes na sequência. 
 
Gerando 3 sequências com pesos moleculares diferentes, as quais, em eletroforese irão 
formar 3 bandas distintas no gel (Imagem hipotética). 
Enzimas 
 
 
 
 
Logo, foram selecionados 3 enzimas que clivam 1, 2, 3 e 5 vezes a sequência de DNA 
de interesse. 
 
O primeiro foi com apenas 1 “Corte” (“Cutters”). Ao clicar em “1 cutters”, uma página 
mostrará uma lista com as enzimas “lado esquedo” e os locais onde ocorre a clivagem 
“lado direito”. 
 
Selecione 3 enzimas, e observe os tramanhos das sequencias resultantes da clivagem. 
 
Vamos observar: A enzima Accl, cliva entre o nucleotídeo 337/339, gerando duas 
sequencias, visto que a enzyma cliva em apenas 1 ponto. 
 
Devemos levar em consideração: O tamanho total da sequência de DNA. 
Visto que o aplicativo mostrou que a enzima cliva na posição 337, logo esse será o 
produto I, e o segundo produto? Bem, a posição de corte é entre 337 e 339, logo o 
segundo seguimento inicia-se em 339 e se estende até o fim da sequência, assim, ao 
fazermos a diferença (1.329 pb – 339 pb = 990 pb), o resultado é o segundo produto, 
para confirmação, soma-se as bases de ambos os produtos (337 pb + 990 pb = 1.327 
pb), o resultado dará um valor próximo ao total de bases, visto que ao fazermos a 
diferença na área onde ocorreu a clivagem (sequência de reconhecimento) (337 pb – 
339 pb = 2 b), duas bases, nesse caso, não entrou no calculo total. 
EM OUTRO CASO: 
Se a enzima escolhida clivar em 2 partes diferentes da sequência de DNA? 
 
 
Duas clivagens em uma única sequência, gerará 3 produtos (sequências), logo, vamos 
observar a enzima bfuCI. 
 
 
A clivagem gerará 3 sequências, sendo duas pequenas (baixo peso molecular) e uma 
grande (alto peso molecular). Para definir o tamanho de cada sequência, realiza-se o 
mesmo método realizado acima. 
 
 
O produto I possui 66 pb, o produto II inicia em 70 pb e finaliza-se em 1.319 pb, logo, 
faz-se a diferença entre ambos (1.319 pb – 70 pb = 1.249 pb), logo o produto II tem 
1.249 pb e por ultimo o produto III, o qual inicia-se na posição 1.323 pb, logo faz-se a 
diferença com o total (1.323 pb – 1.329 pb = 6 pb), gerando um produto de apenas 6 pb. 
Ao somar (66 pb + 1.249 pb + 6 pb = 1.321 pb), gera valor proximo ao valor total de 
bases da sequência a ser clivada, não entrando no cálculo as bases que ficam entre cada 
clivagem ( 66 pb – 70 pb = 4 b; 1.319 pb – 1.323 pb = 4 b), essa sequência demarca o 
ponto onde a enzima ancora e cliva (sequencia de reconhecimento). 
Esse local onde a enzima clivou, gera ou não “pontas adesivas”. 
 
 
 
 
 
A partir dos produtos (sequencia clivada), produz-se o gel eletroforético. 
 
 
 
 
Base (b) 
Par de Bases (pb) 
Vale lembrar: 
 
 
 A enzima BsiEI, apresenta-se na posição 3’/ 5’, logo os locais onde a enzima 
cliva, aparecem de forma inversa (293/291), diferente da enzima BfuCI na 
posição 5’/ 3’ (66/70) e o “blunt”, corte direto sem formação de “pontas 
colantes”. 
 Logo, se olharmos os locais de corte da enzima bsiEl, observa-se que a posição 
291 pb, é o produto I (Posição 5’), logo, (293 pb – 459 pb = 166 pb), e por 
ultimo, 1.329 pb – 461 pb = 868 pb, ao somar, apresenta valor: 1.325 pb + 4 b 
(local do corte – “ponta colante”) = 1.329 pb. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 DESENHANDO UM GEL ELETROFORÉTICO. 
Com os produtos (sequências resultantes da clivagem) já definidos, pode-se dispor 
essas sequencias em ordem decrescente, sendo que cada “poço” da eletroforese, 
conterá apenas os produtos de uma determinada enzima. 
 PRIMEIRO PASSO: 
Criar um esquema (Utilizar PowerPoint) 
 
 
 
 
SEGUNDO PASSO 
Tabelar as amostras em ordem decrescente (do maior para o menor), sendo que, quanto 
maior o tamanho da sequência, maior é seu peso molecular, valor versamente 
proporcional (nesse caso). 
Enzimas 
Accl bfuCI BsiEI 
Produtos 
(sequências) 
990 pb 1.249 pb 868 pb 
337 pb 66 pb 291pb 
- 6 pb 166 pb 
 
 
 
Placa de corrida da Amostra 
Identificação da Amostra Enzimas de restrição (DNAse) 
Régua de contagem. 
Definir conforme a 
necessidade 
TERCEIRO PASSO 
Disposição das amostras na placa, levando em consideração o seu tamanho (tamanhoda 
sequência) e a régua de contagem (lateral da placa). 
 
 
Adicione e calibre as bandas de forma que se aproxime o máximo do valor na régua, 
porém sempre haverá erro nesse caso, logo, alinhe o mais próximo. Geralmente, 
sequências com tamanhos de valores aproximados, não se percebe a diferença em 
gráficos desenhados desta forma, logo, deve-se extender a régua, de modo que se possa 
diferenciar as sequências, nesse caso não há necessidade, pois este é apenas um tutorial 
básico. 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE 
Encontre na base de dados do NEB cutter, enzimas de restrição que clivem 1 vez, 2 
vezes, 3 vezes e 5 vezes, sendo que serão três enzimas para cada tipo de corte e desenhe 
um gel eletroforético distribuindo todos os produtos (sequências) de acordo com a 
enzima que o produziu. (Escolha uma sequência no NCBI, e identifiqiue devidamente). 
 
Resposta: