Do Isolamento ao Armazenamento de microorganismos versão atualizada

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI 
CÂMPUS ALTO PARAOPEBA 
 
 
 
DO ISOLAMENTO AO ARMAZENAMENTO DE 
MICRO-ORGANISMOS 
 
 
 
 
Relatório apresentado como parte das exigências 
da disciplina Microbiologia Experimental 
sob responsabilidade do prof. José Carlos. 
 
 
 
 
 
 
Alessandra Raphaela Braich Gonçalves – 164250011 
Yuri de Souza - 164250018 
 
 
 
 
 
 
Ouro Branco – MG 
Junho/2018 
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SUMÁRIO 
• Ubiquidade dos microrganismos ...................................................................... 4 
• Introdução ......................................................................................................... 4 
• Objetivo ............................................................................................................ 5 
• Método .............................................................................................................. 5 
• Resultados ......................................................................................................... 6 
• Conclusão ......................................................................................................... 11 
• Isolamento de microrganismos em meio solido ............................................... 12 
• Introdução ......................................................................................................... 12 
• Objetivo ............................................................................................................. 12 
• Método .............................................................................................................. 13 
• Resultados ......................................................................................................... 14 
• Conclusão ...........................................................................................................14 
• Micro cultivo para observação microscopia de fungos ......................................13 
• Introdução ...........................................................................................................13 
• Objetivo ...............................................................................................................13 
• Método .................................................................................................................14 
• Resultados ............................................................................................................14 
• Conclusão .............................................................................................................15 
• Coloração diferencial de Gram ............................................................................16 
• Introdução .............................................................................................................16 
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• Objetivo ...............................................................................................................16 
• Método .................................................................................................................17 
• Resultados ............................................................................................................18 
• Conclusão .............................................................................................................19 
• Armazenamento ....................................................................................................20 
• Referencias bibliográficas ....................................................................................23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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UBIQUIDADE DOS MICROORGANISMOS 
 
Introdução 
Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, em sua maioria fazem parte do 
ecossistema. Podem ser encontrados em todos os lugares, sejam eles solo, água ou na superfície 
interna e externa dos seres vivos. Os microrganismos estão presentes permanente ou 
transitoriamente. Podem ser encontrados também na atmosfera mas sem qualquer atividade, 
pois para que a possam manter necessitam estar em contato com substrato, que é o meio ao qual 
retiram os nutrientes de que necessitam. Quanto mais rico em nutrientes, movimentado e 
populoso for o meio, este apresentará maior concentração de microrganismos, uma vez que 
estes estão presentes em todos os lugares. 
Para se provar a real existência dos microrganismos devemos isolá-los. Para tanto é usado 
placas ou tubos que tenham um meio nutritivo para seu crescimento e desenvolvimento, o qual 
será usado nessa pratica e nas futuras é o PCA (Agar Contagem de Placa), como meio de cultura 
para estes seres PCA ideal para maior crescimento e desenvolvimento contém glicose e extrato 
de levedura, o meio de cultura PCA, Agar simples, é satisfatório para a enumeração de 
bactérias, fungos e das leveduras, visto que os nutrientes fornecidos pela Triptona, que é a 
vitaminas encontradas no extrato da levedura, e a glicose são usados como fonte de energia 
favorecendo assim o crescimento dos microrganismos. 
Objetivos 
Averiguar a presença de microrganismos no ambiente em diferentes locais de coleta. 
Familiarizar-se com a utilização de técnicas assépticas. 
Métodos 
Para a realização dessa aula prática foram feitos 4 tipos de contaminação diferentes, 
identificadas de A a D. 
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Para o procedimento A a placa de AN foi exposta por quinze minutos ao ar do banheiro 
masculino do bloco 4 da UFSJ, campus Alto Paraopeba, para que assim fosse feita a sua 
exposição aos microrganismos presentes no ar desse local e assim sua futura cultivação. Já para 
o procedimento B que é uma exposição à pele, ao cabelo e a saliva foi utilizado uma placa de 
AN também, porem com uma caneta marcadora foi feita uma divisão ao fundo em forma de 
“Y” para assim se observar os microrganismos específicos de cada setor. Para a contaminação 
da placa pela pele o dedo de um dos integrantes da dupla foi passado pela divisão de 1/3 a placa, 
após isso para a contaminação pelo cabelo um fio foi colocado sobre a placa, também 
respeitando o 1/3 da divisão, e por último para a contaminação pela saliva um Swab 
previamente esterilizado e umedecido na boca foi passado de forma a estriar a ultima divisão 
da placa. Para não haver confusão ao observar os resultados foi anotado também ao fundo o 
tipo de contaminação em cada divisão correspondente. O procedimento C tinha como objetivo 
analisar os diferentes tipos de assepsia das mãos, nele foram feitas as mesmas divisões do 
procedimento B (em forma de “Y”) para que em 1/3 seja contaminado com o auxílio de um 
Swab umedecido em salina estéril a palma da mão sem ser lavada, para a segunda divisão lavou-
se as mãos com detergente vigorosamente em todas as superfícies por dois minutos e as secou 
com toalha de papel estéril, e com o auxilio de um novo Swab foi feita a contaminação de outro 
1/3 da placa, e para a ultima parte da divisão as mãos foram novamente lavadas do mesmo jeito 
que procedimento anterior e aplicou-se álcool 70% por um minuto, e contaminou-se a placa 
com o auxilio de um outro Swab. Assim como no procedimento B foram identificados cada 
parte da divisão para uma futura avaliação. O procedimento D foi para observar o isolamento 
de fungos do solo, nele a terra coletada do solo da UFSJ foi diluída em tampão salina ( NaCl a 
0,85%) para a concentração final de 10% m/v. O inoculo da diluição foi espalhado sobre a placa 
de AS com o auxilio de uma alça de Drigausk, previamente banhada em álcool que foi flambada 
e resfriada em seguida, esperou-se três minutos para a absorção do inoculo, a placa foi 
identificada com o nome da dupla.Após todos os procedimentos da aula serem feitos o professor juntamente com o técnico e as 
monitoras incubaram as placas de AN a 37°C por quarenta e oito horas e as de AS a 28°C por 
setenta e duas horas. As placas foram incubadas de forma invertida para que assim seja evitada 
a desidratação do meio e que a agua de condensação caia sobre a superfície do meio. 
 
 
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Resultados 
Após o período de incubação a dupla voltou ao laboratório para observar e anotar a presença e 
a diversidade morfológica das colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do Agar. 
Para a correta analise da colônias microbianas pesquisou-se os diferentes tipos e formas que as 
mesmas poderiam apresentar. A figura abaixo mostra algumas morfologias típicas de colônias 
e suas características como a forma, margem e elevação, a qual foi utilizada para identificação 
das bactéria encontradas. 
 
Figura 1: Caraterísticas das bactérias quanto sua Forma, Elevação e Margem. 
 
Ao se observar a placa do procedimento A notou-se poucas colônias formadas pela exposição 
ao ar do banheiro, isto pode se dar por diversos fatores, tais como: temperatura, pH, pressão 
osmótica e outros. A maioria dos micro-organismos crescem bem nas temperaturas ideias para 
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os seres humanos, entretanto algumas podem crescer nos extremos da temperatura, são eles os 
psicrófilos e os termófilos, que crescem em baixas e em altas temperaturas respectivamente. 
 
Figura 2: Velocidade do crescimento de diferentes tipos de micro-organismos em relação à 
temperatura. 
Os picos de cada curva representa o crescimento ótimo. Cada espécie bacteriana cresce em uma 
temperatura mínima, ótima e máxima especifica. A temperatura mínima de crescimento é a 
menor temperatura que em que determinada espécie pode se desenvolver; a temperatura ótima 
de crescimento é a temperatura ideal para o crescimento; a temperatura máxima de crescimento 
é a temperatura máxima em que o crescimento é possivel (TORTORA et al., 2012). 
O pH se refere a alcalinidade ou a acidez de uma solução, as bactérias crescessem melhor na 
faixa de pH de 6,5 a 7,5. Quando bactérias são cultivadas em laboratório podem produzir ácidos 
que interferem no seu próprio crescimento. 
Os micro-organismos obtêm a maioria dos seus nutrientes da água presente no seu meio 
ambiente, portanto a água é essencial para seu crescimento. Quando uma célula microbiana se 
encontra em um meio hipertônico (onde a concentração de solutos é maior do que no interior 
da célula), a água em seu interior (de 80% a 90% da constituição de micro-organismo é água) 
é perdida para o meio devido a pressão osmótica, a perda dessa água causa uma plasmólise, o 
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encolhimento do citoplasma da célula inibe seu crescimento. Dessa forma adição de sais em 
um meio de cultura pode aumentar a pressão osmótica inibindo o crescimento das células 
microbianas. 
 
 
Figura 3: placa exposta ao ar do banheiro masculino da UFSJ campus Alto Paraopeba. 
No procedimento B o resultado foi como o esperado, as bactérias cresceram de forma uniforme 
nos três tipos diferentes de contaminação. Segundo a literatura a saliva humana contem 
aproximadamente 750.000.000 bactéria/mL, um fio de cabelo contem 1.500.000 bactérias/cm2 
além de alguns tipos de fungos, a palma da mão contem aproximadamente 150 espécies 
diferentes de bactérias, entretanto a mão das mulheres contem uma maior diversidade de 
espécies de bactérias. 
 
 
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Figura 4: placa contendo micro-organismos presentes na mão, cabelo e saliva. 
No procedimento C foi observado um resultado atípico ao qual a mão sem lavar apresentou 
menor numero de bactérias do que a mão lavada e a com antissepsia. Esse erro pode ter ocorrido 
devido a higienização incorreta das mãos, ou a um erro ao ser nomeado cada parte da placa. 
Como dito anteriormente as mãos apresentam cerca de 150 espécies diferentes de bactérias, 
segundo um estudo realizado por pesquisadores da Universidade de Boulder, Colorado 
realizado com 51 participantes, o ato de fazer a lavagem das mãos pode diminuir o numero de 
uma determinada espécie de bactérias sim, mas ao mesmo tempo o aumento de uma outra 
espécie pode ocorrer. 
 
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Figura 5: placa contendo micro-organismos presentes na mão lavada, sem lavar e antissepsia. 
Já no procedimento D não foi possivel fazer uma avaliação pois houve o crescimento de larvas 
durante a incubação. A presença de larvas pode ser justificada pela presença de ovos de insetos 
no solo coletado ou por uma possível contaminação durante o processo. 
 
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Figura 6: placa contendo fungos e larvas coletados do solo. 
 
Conclusão 
Com esta aula prática foi possivel aprender como é feito o isolamento de bactérias e fungos, 
assim como a posterior avaliação dos mesmos. A familiarização das técnicas de assepsia e de 
esterilização de materiais. Os resultados obtidos foram dentro do proposto, apesar de se ter 
algumas falhas que podem ter sido provocadas pela amostra ou pelo procedimento. 
 
 
 
 
 
 
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ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS EM MEIO SÓLIDO 
Introdução 
O isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o organismo de 
interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia através da observação da 
produção de determinado produto ou da morfologia da colônia (STANBURY, WHITAKER E 
HALL, 1995). 
Normalmente, as colônias de microrganismos se originam somente de uma célula ou de esporo 
de microrganismo. Essas colônias apresentam características morfológicas diferentes, as quais 
permitem a distinção entre os microrganismos. No entanto, para conseguir uma visualização 
das colônias independentes no meio sólido, é necessário a distribuição uniforme das bactérias 
sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006) 
Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda 
é possível encontrar uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo 
que muitos podem ser até comercialmente interessantes. A primeira etapa para a utilização de 
um microrganismo de interesse industrial muitas vezes é a etapa de isolamento de uma colônia. 
O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma população 
envolve, em geral, o uso de meios de cultura sólidos e o recurso a técnicas de isolamento de 
colónias. Este método permite obter colónias individualizadas e espacialmente separadas que, 
teoricamente, são originadas a partir de uma única célula, correspondendo, por isso, a uma 
cultura pura de um microrganismo particular. 
 
Objetivos 
Demonstrar métodos mais comuns para isolamento de microrganismos em culturas puras. 
Executar as principais técnicas de isolamento em meio solido. 
Produzir colônias isoladas de bactérias e leveduras (culturas puras) a partir de placas da aula 
anterior. Opcionalmente poderão ser leveduras a partir de fermento biológico comercial. 
 
 
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Métodos 
Para essa aula pratica o isolamento de cultura pura de bactéria e de levedura foi feito por 
esgotamento em estrias. Dentre os métodos de isolamento mais utilizados estão o método de 
Estriamento e o método Pour Plate. O método de estriamento consiste em mergulhar uma 
alça de inoculação estéril dentro de uma cultura mista, que contém mais de um tipo de 
microrganismo e é semeada em estrias na superfície de um meio nutritivo. Ao longo da 
estria as bactérias são depositadas quando a alça entra em contato com o meio e as últimas 
células depositadas na alça são afastadas o suficiente para crescer em colônias isoladas 
(TORTORA, 2005). O método deestriagem escolhido foi o de estria composta, para realizar a 
estriagem composta deve-se dividir a placa em quatro quadrantes imaginários, com os 
quadrantes em mente, deve-se espalhar o inóculo no primeiro quadrante utilizando a alça de 
repicagem em movimentos de zig-zag. 
 
 
Figura 7: ilustração demonstrando o processo de esgotamento por estrias composta. 
 
Para realizar esta pratica é necessário primeiramente esterilizar a alça de repicagem, flambando-
a e resfriando-a, com o auxílio da mesma coletou-se uma colônia previamente crescida em uma 
placa, esta foi então levada a uma nova placa de AN onde foi estriada. Flambou-se novamente 
a alça e a mesma foi resfriada encostando-a na superfície do Agar, girando a placa noventa 
graus tocou-se o final das estrias do primeiro quadrante e deslizou-se várias vezes no mesmo 
movimento de zig-zag até o outro extremo do segundo quadrante. O mesmo processo repetiu-
se para os dois quadrantes restantes, sendo que no último as estrias devem ser mais espaçadas. 
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Com as estrias feitas, identificou-se a placa com o nome da dupla e a mesma foi encubada de 
forma invertida por vinte e quatro horas. Após isso, coletou-se a colônia isolada e a transferiu 
para um tubo de meio liquido preparado previamente em aula e este foi encubado por mais vinte 
e quatro horas. 
 
Resultados 
Após o tempo de incubação foi observado que o estriamento foi feito adequadamente devido 
ao correto resultado obtido. O primeiro quadrante por ser feito com a cultura bacteriana original 
foi o que mais apresentou micro-organismos sendo impossível obter uma cultura pura, os 
demais quadrantes apresentavam um numero bem menor ao se comparar com o primeiro, sendo 
obtida a cultura pura no ultimo quadrante, centro da placa. Uma colônia visível teoricamente 
vem de um único esporo ou célula vegetativa ou de um grupo dos mesmos microrganismos 
juntos em agregados ou cadeias. As colônias microbianas frequentemente têm aparência 
diferente, o que permite distinguir um microrganismo do outro (TORTORA et al, 2006). 
 
Conclusão 
Diante dos resultados obtidos os objetivos propostos nesta aula foram alcançados de maneira 
satisfatória. Com a realização do estriamento composto foi obtida uma colônia pura, assim 
como a familiarização com os procedimentos para a realização da mesma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MICRO CULTIVO PARA OBSERVAÇÃO MICROSCOPICA DE 
FUNGOS 
 
Introdução 
Os fungos apresentam um conjunto de características próprias que permitem sua diferenciação 
das plantas: não sintetizam clorofila, não tem celulose na sua parede celular, exceto alguns 
fungos aquáticos, e não armazenam amido como substância de reserva. Estes organismos se 
alimentam por absorção e apresentam glicogênio ou lipídeos como material de reserva 
energética . A presença de substâncias quitinosas na parede da maior parte das espécies fúngicas 
e a sua capacidade de depositar glicogênio os assemelham às células animais. São seres vivos 
eucarióticos, com um só núcleo, como as leveduras, ou multinucleados, seu citoplasma contém 
mitocôndrias e retículo endoplasmático rugoso, são heterotróficos e nutrem-se de matéria 
orgânica morta. 
Uma das etapas fundamentais para a identificação, conhecimento das exigências nutricionais e 
os produtos metabólicos desses micro-organismos é isolamento de fungos. Os métodos 
utilizados para o isolamento e cultivo de fungos dependem muito do seu habitat natural, uma 
vez que é esse o meio original no qual suas necessidades nutricionais são supridas. Geralmente 
empregam-se meios sólidos acidificados, com pH em torno de 4 e 5, com o objetivo de inibir o 
crescimento de bactérias. Em alguns casos, utilizam-se antibióticos antibacterianos adicionados 
ao meio. 
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema importância, uma vez 
que a identificação dos micro-organismos isolados depende, em grande parte, do conhecimento 
de suas características morfológicas (tais como tipo de micélios e de esporos sexuados e 
assexuados). Macroscopicamente, os fungos são divididos em e em leveduriformes. No estudo 
macroscópico, é importante a análise das características das colônias, como verso e reverso, 
pigmentação, bordas , superfície, textura ou consistência, velocidade de crescimento, 
topografia, aspecto, diâmetro da colônia. Microscopicamente, o corpo dos fungos 
multicelulares apresenta uma organização formando longos micélios, a observação 
microscópica visa observar as estruturas vegetativas e as estruturas reprodutoras. 
 
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Objetivo 
Familiarizar-se com a técnica do microcultivo de fungos e sua classificação a partir de 
observação microscópica do material cultivado. 
 
Método 
Para realizar o microcultivo primeiramente esteriliza-se uma espátula, mergulhando-a no álcool 
contido em um bequer de 100 mL e flambando-a no bico de Bunsen, apenas por tempo 
suficiente para a queima do álcool. Com a espátula esterilizada, um cubo de Agar de 
aproximadamente 1,5 centímetros de lado é cortado de uma placa AS e é colocado sobre o Agar 
não partido. Utilizando uma alça de repicagem previamente esterilizada e resfriada, ao ser 
colocada sobre a chama do bico de Bunsen até obter a cor rubro no metal e posteriormente 
colocada em contato com a superfície do Agar, coleta-se uma amostra de fungo filamentoso 
previamente cultivado e o mesmo é inoculado na lateral do cubo de Agar cortado. Após a 
inoculação é necessário colocar uma lamínula estéril sobre o cubo de Agar, para isso foi usado 
uma pinça também previamente esterilizada, é importante que o fragmento de Agar seja menor 
que a lamínula. Fechou-se a placa adequadamente e a mesmo foi encubada por sete dias a 25°C. 
 
Resultados 
Ao termino da incubação foi notório o crescimento fúngico sob a lamínula, constatando assim 
o correto desenvolvimento da pratica, foi observado também que em todo o cubo de AS houve 
o crescimento de fungos filamentosos. Foi feito uma lâmina e observou-se suas estruturas no 
microscópio. 
 
Conclusão 
Concluímos que houve crescimento de fungos filamentosos pelo meio da técnica de 
microcultivo em que nos permite usar um cubo de AS e fazer o repique dos quatro lados do 
cubo de Agar. Na microscopia observamos hifas e formação de esporos. 
 
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COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM 
Introdução 
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as 
Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as Gram-
negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta 
por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de 
coloração, o tratamento com álcool-acetonado extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade 
ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o CVI 
pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias 
gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o 
tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o 
complexo CVI não pode ser extraído. Outra explicação baseia-se também em diferenças de 
permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido 
na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição 
do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A 
parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, 
mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitandoa extração do complexo CV-l. 
 
Objetivo 
Familiarizar-se com as técnicas de coloração diferencial de células microbianas para o exame 
microscópico. 
Diferenciar bactérias de acordo com sua resposta à coloração de Gram. 
 
Método 
Para a preparação da lâmina a ser observada no microscópio, primeiramente limpa-se e 
esteriliza-se a mesma flambando-a ao bico de Bunsen. Ao preparar a suspensão é necessário 
que se coloque uma gota de água destilada em cima da lâmina, para que com uma alça de 
repicagem, extrair uma pequena porção de uma cultura previamente cultivada em meio sólido, 
esfregou-se a porção coletada em cima da lâmina em movimentos circulares, com o objetivo de 
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diluir a cultura coletada na gota de água previamente colocada. Fixou-se o esfregaço ao se 
passar a lâmina em cima da chama do bico de Bunsen com a parte contendo o material a ser 
estudado virada para cima. Com o auxílio de um suporte para lâminas dentro de uma bandeja 
plástica iniciou-se a coloração de Gram, primeiramente cobriu-se o esfregaço com corante 
cristal violeta durante um minuto, o excesso do mesmo foi retirado utilizando uma pisseta 
contendo água destilada, logo após a placa foi coberta com uma solução de lugol durante um 
minuto e meio, o excesso foi igualmente lavado. Afim de tirar o excesso de corante, lavou-se a 
lâmina com álcool acetonado até que não se desprendesse mais corante do esfregaço, 
novamente lava-se o excesso utilizando água destilada em uma pisseta. Ainda no processo de 
coloração, cobriu-se a lâmina com solução de safranina durante trinta segundos, o excesso da 
mesma foi retirado com água destilada e a lâmina foi seca utilizando um jato de ar. Ao levá-la 
ao microscópio, uma gota de óleo de imersão foi colocada em cima da mesma e utilizando a 
lente objetiva de imersão 100x foi possível observar os micro-organismos alí contidos. 
Resultados 
Após o termino dos procedimentos práticos foi feita a analise microscópica da amostra, 
primeiramente sem usar o óleo de imersão focalizou a amostra na lente objetiva de 10x, em 
sequência para a objetiva de 20x, focalizou-se novamente e em seguida mudou-se para a 
objetiva de 50x, para a melhor visualização e identificação colocou-se o óleo de imersão e 
usando a objetiva de 100x. 
 
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Figura 8: imagem da lâmina preparada em aula e corada de acordo com a Gram olhada através 
do microscópio. 
Os micro-organismos roxos, com forma de cocos, vistos no microscópio eram gram-positivos 
(Staphylococcus aureus), enquanto os de coloração rosa com forma de bastonetes eram gram-
negativos (Escherichia coli). Essa diferença de cor ocorre, pois as bactérias gram-positivas 
possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua parede celular, enquanto as gram-
negativas possuem uma fina camada desse composto e uma membrana externa, constituída por 
lipopolisacarídeos. Ao corar as bactérias com cristal violeta e lugol, o complexo de cristal 
violeta-iodo é absorvido por ambas, porém, ao serem tratadas com álcool, as espessas paredes 
celulares das bactérias gram-positivas são desidratadas, provocando a contração dos poros do 
peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; enquanto a porção lipídica das 
membranas externas das bactérias gram-negativas se dissolve, deixando o complexo ser 
removido. Ao corar ambas com a safranina, as gram-negativas absorvem esse contracorante por 
estarem incolores, diferentemente das gram-positivas, que não absorvem por já estarem 
coradas. Foi possível a observação de bactérias descoradas em ambos esfregaços. 
 
Conclusão 
A técnica da coloração diferencial de Gram mostrou-se muito eficiente, pois foi possível chegar 
a uma conclusão sobre a forma e o arranjo das bactérias que nos foi proposto analisar. A 
realização de testes básicos para identificação de bactérias, através do método de coloração de 
Gram, permitiu-se concluir que existem diferenças significativas na composição da parede 
celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. O mecanismo de reação de Gram 
demonstrou-se um método eficiente de coloração diferencial, podendo-se, através dos 
resultados obtidos, diferenciar bactérias Gram positivas de Gram negativas, atuando como 
ferramenta auxiliar, na identificação de bactérias fitopatogênicas. 
 
 
 
 
 
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ARMAZENAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS 
1. Método de manutenção a curto prazo 
1.1. Repicagem contínua ou periódica 
A técnica de repique contínuo, também chamado de subcultivo ou de repicagem 
periódica, é um método simples e tradicional de manutenção de culturas em laboratório, 
e por esse motivo é amplamente utilizado. Por ser uma das mais antigas técnicas de 
conservação, tem sido bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, 
principalmente de bactérias (ROMEIRO, 2006). O método consiste na inoculação do 
microrganismo em meio adequado e propício para a seu crescimento, incubação em 
ambiente favorável à multiplicação e estocagem em baixas temperaturas, após sua 
multiplicação. Nesta situação, é aconselhável o armazenamento de culturas sob 
refrigeração (5 a 8°C), em busca da redução do metabolismo dos microrganismos e o 
aumento entre os intervalos de repiques das culturas. Esse método proporciona a 
conservação de leveduras em média de um a três meses e de bactérias em torno de cinco 
a doze meses (GREEN, 2008). 
 
2. Métodos de médio prazo 
2.1. Manutenção em óleos 
A manutenção em óleos é um método simples de conservação consiste na aplicação 
de uma camada de óleo mineral esterilizado sobre a cultura do micro-organismo a fim 
de limitar a quantidade de oxigênio disponível para o mesmo, causando assim uma 
redução no metabolismo e consequentemente na taxa de multiplicação do agente. 
Deve-se multiplicar o microrganismo em meio de cultura dentro de um frasco, por 
exemplo um tubo de ensaio, e em seguida cobrir essa colônia com óleo mineral 
esterilizado. Posteriormente, esse frasco pode ser mantido em temperatura ambiente 
ou em um refrigerador (ROMEIRO, 2006). A manutenção de culturas submersas em 
óleo mineral promove a redução do consumo de oxigênio em torno de 10% em poucas 
horas. Porém, de acordo com a literatura, camadas de óleo superiores a um centímetro 
não devem ser utilizadas visto que pode ocorrer a redução da viabilidade dos 
microrganismos em condições de total exaustão de oxigênio. Os óleos utilizados para 
a conservação de microrganismos devem ser de boa qualidade e pureza, apresentar alta 
viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9 à temperatura de 20ºC e, além disso, 
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não devem conter produtos tóxicos, sendo a parafina e a vaselina os mais 
recomendados (ROMEIRO, 2006). Dados indicam que as bactérias podem ser 
conservadas por períodos de um a sete anos em óleos dependendo da espécie, enquanto 
fungos sobrevivem por um a cinco anos, sendo que as leveduras, especificamente, 
sobrevivem até sete anos (COSTA & FERREIRA, 1991). 
2.2. Manutenção em água esterilizada 
 A preservação em água destilada esterilizada também conhecida pelo método de 
Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em água estéril ou solução 
salina, sendo indicada na preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões 
osmóticas de soluções hipotônicas. O método consiste na transferência de blocos de 
Ágar contendo os microrganismos para um frasco, com a posterior adição de uma 
solução de água esterilizada (COSTA & FERREIRA, 1991). Segundo a literatura 
técnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com cerca de 10 a 15 
dias e visa atingir um estágio de hipobiose, com a diminuição do metabolismo e 
formação do estado latente da célula diante da restrição de fontes nutritivas.Apesar do 
baixo custo e reprodutibilidade, sua aplicação é restrita a microrganismos que tenham 
grande aderência ao Agar, como nota-se em bolores e algumas leveduras. este método 
além de garantir a preservação das características originais da cultura por longos 
períodos, pode promover a ausência de contaminação por ácaros, apresentar baixo 
custo por utilizar somente água destilada e a necessidade de pequeno espaço físico para 
acondicionar os frascos, além de poder ser empregada para grande numero de gêneros 
e espécies de fungos. 
2.3. Congelamento 
O congelamento consiste na conservação de microrganismos em temperaturas 
relativamente baixa, entre -4°C e -20ºC. Apresenta-se como um dos métodos de 
manutenção mais simples e baratos, além de oferecer boa segurança para o 
armazenamento de diversos microrganismos por períodos de alguns meses a dois anos 
(TORTORA et al., 2011). Segundo dados encontrados na literatura, buscando avaliar a 
viabilidade dos microrganismos presentes em uma coleção de cultura semearam um 
total de 328 leveduras do gênero Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rodothorulla 
em caldo cérebro-coração contendo glicerol, mantendo-as sob refrigeração por sete 
dias e posterior congelamento a -20ºC. Após três anos de congelamento observaram 
recuperação de 99% das leveduras e no ano seguinte notaram uma redução de 
22 
 
viabilidade das culturas com 90,6% de recuperação (144 leveduras). Diante dos 
resultados, observou-se que o emprego de 9 baixas temperaturas foi vantajosa por seu 
baixo custo, fácil execução, além de ter favorecido a conservação de quase totalidade 
das leveduras por 48 meses. 
 
3. Métodos de longo prazo 
3.1. Liofilização 
A liofilização é considerada uma das técnicas mais eficientes para a manutenção 
de microrganismos, justamente por garantir viabilidade dos microrganismos por longos 
períodos e ser aplicável para a maioria deles. A técnica se baseia na remoção da água 
intracelular de materiais biológicos congelados, por sublimação, evitando a formação 
de cristais de gelo, que são capazes de provocar danos às estruturas celulares, além de 
poder degradar as enzimas presentes no citosol. A liofilização é constituída por três 
etapas: congelamento, desidratação primaria e desidratação secundária. A água 
congelada expande-se ao cristalizar e no processo de fusão tende a recristalizar e 
aglutinar, formando longos e protuberantes cristais de gelo, capazes de produzir uma 
série de danos mecânicos, bioquímicos e osmóticos à célula. Quanto aos fungos, grande 
parte das coleções de culturas utilizam a liofilização como método de conservação de 
microrganismos, justamente por atingirem uma manutenção de viabilidade de algumas 
espécies por períodos de 17 a 21 anos. 
 
3.2. Criopreservação 
A criopreservação consiste na manutenção de uma variedade de tipos celulares sob 
baixas temperaturas, tendo como principal objetivo a redução de injúrias aos materiais 
biológicos, incluindo células animais e vegetais, bactérias, fungos, vírus e tecidos, 
durante o processo de congelamento e estocagem a frio. Este método compreende a 
manutenção de materiais a baixas temperaturas (-20°C a -80°C em freezers) e ultra 
baixas temperaturas (-150°C a -196 °C em containeres de nitrogênio líquido). No que 
tange a conservação dos microrganismos, a estocagem a baixas temperaturas, apesar 
de eficiente, pode comprometer a qualidade das amostras armazenadas, visto a 
possibilidade de variações de temperatura em freezers. Já os sistemas de nitrogênio 
líquido garantem o armazenamento a temperaturas constantes e por longos períodos. 
 
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 
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de Microbiologia, São Paulo, v.22, n. 3, p. 263-268, 1991. 
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microbiológicas. Ciência Animal, Goiânia, v. 19, n. 2, p.111-122, 2009. Disponível em: 
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Sanvicente, trad) São Paulo: Martins Fontes.1996. 
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Artmed, 2012. 964p. 
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Artmed, p. 964, 2006. 
• TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ed. Porto Alegre: 
Artmed, p. 534, 2005.