AULA 6 Imunofluorescência Direta e Indireta

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Profª Drª Mariane Arnoldi da Silva
Imunofluorescência Direta e Indireta
Imunofluorescência
 Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade
específica com o antígeno.
 Os fluorocromos são substâncias que absorvem luz de um
comprimento de onda menor e, quando excitados com luz UV,
emitem luz de um comprimento de onda maior, sendo este
fenômeno denominado FLUORESCÊNCIA.
Fluoresceína e a rodamina B
Imunofluorescência Direta
 Este teste é utilizado na pesquisa e na localização de antígenos em
células ou tecidos (monocamada), através de um anticorpo
específico marcado com um fluorocromo (conjugado).
 O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo
estável.
 O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o
preparado é observado em microscópio de fluorescência.
Apresenta uma elevada sensibilidade e especificidade 
Imunofluorescência Direta
Aplicação: para a pesquisa de Clamídia, Treponema, Legionela, 
Herpes, CMV
Imunofluorescência Indireta
 Teste empregado na rotina laboratorial para a detecção de anticorpos
no soro e fluídos biológicos.
 Utilizando diluições seriadas do soro é possível determinar o título
de anticorpos presentes na amostra, que será a máxima diluição em
que se observa fluorescência.
 É sensível, específica e reprodutível.
Ex.: FTA-ABS, Toxoplasma, Diagnóstico para doença de Chagas, 
Rubéola, Citomegalovírus.
Imunofluorescência Indireta
Sistema Avidina - Biotina
TÉCNICA DE AMPLIFICAÇÃO
AVIDINA = é uma glicoproteína derivada da albumina do ovo e possui uma alta afinidade
pela biotina. A avidina pode ser saturada com moléculas de fluoresceína sem perder sua
capacidade de ligação à biotina, fornecendo um conjugado cuja fluorescência específica é
bem intensa.
Sistema Avidina - Biotina
Após a reação do antígeno com o anticorpo não-marcado, a biotina
marcada com o segundo anticorpo, é adicionada.
Como muitas moléculas de biotina podem se ligar a um anticorpo, a
adição da avidina marcada resulta de uma amplificação da fluorescência.
Sistema Avidina - Biotina
CITOMETRIA DE FLUXO
Princípios
A citometria de fluxo 
direta utiliza anticorpos 
monoclonais 
conjugados com um 
marcador fluorescente 
e um fotômetro para 
medir a energia luminosa 
emitida pelas células. A 
análise simultânea de 
marcadores de 
superfície, volume e 
tamanho celular é então 
permitida.
Princípios
1. Incubar a amostra do paciente com um ou dois tipos de AC
monoclonais;
2. Na forma indireta = os anticorpos monoclonais podem ou não estar
conjugados a uma marcador;
3. Amostras são colocadas numa câmara de fluxo rodeada por um
fluído isotônico pressurizado. (diferença de pressão do fluido e da
amostra cria um fluxo laminar – células fluem em um sentido único, o
que permite a análise individual);
4. Cada célula passa um feixe de luz originado de uma lâmpada de
laser ou mercúrio.
5. Dispersão da luz detectada a 0º ou 360º da fonte de luz é
proporcional ao tamanho da célula;
6. Dispersão da luz num ângulo de 90º é proporcional as propriedades
da estrutura interna da célula (Ex.: granularidade).
USO
É o melhor método para a análise de células T e B, além de 
outros marcadores celulares, podendo ser executada de forma 
direta ou indireta. 
REPRESENTAÇÃO GRÁFICA