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01/07/2018 1 Cultura de Secreção Vaginal e Uretral Prof a Kêsia xisto PRINCIPAIS AGENTES ETIOLÓGICOS Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Chlamydia trachomatis Gardnerella vaginalis Treponema pallidum (soro) Haemophilus ducreyi Trichomonas vaginalis Candida albicans Outras bactérias que podem provocar infecções do trato genitalStreptococcus agalactiae Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulase negativos Enterococcus faecalis Escherichia coli Microbiota Os microrganismos que colonizam o trato genital feminino incluem lactobacilos, difteróides, Gardnerella vaginalis, estafilococos coagulase negativos, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp., estreptococos alfa e gama hemolíticos, Escherichia coli e leveduras. A uretra masculina normalmente contém relativamente poucos microrganismos encontrados na pele, tais como: estafilococos, micrococos, corynebactérias e estreptococos alfa hemolíticos 01/07/2018 2 Neisseria gonorrhoeae Coleta do material A coleta da amostra é de grande importância para a determinação do diagnóstico laboratorial, em particular para pesquisa de Neisseria , isto porque o gonococo é sensível à dessecação e não suporta bem a refrigeração. Por esta razão a amostra deve ser mantida em meio de transporte adequado ou processada logo após sua colheita. Diagnóstico laboratorial Secreção endocervical A paciente não deverá está usando medicamento vaginal há pelo menos 24 horas. Não estar fazendo uso de antibióticos. É utilizado um espéculo vaginal e sob visualização direta o cervix é limpo com uma gaze e o corrimento é obtido neste local com auxílio de swabs. O primeiro swab é utilizado para a bacterioscopia. O segundo swab é colocado em meio de transporte ou semeado diretamente no meio thayer Martin. Secreção endocervical 01/07/2018 3 Secreção uretral No homem Deve ser colhida preferencialmente antes da primeira micção e pelo menos quatro horas após a última. A coleta deve ser feita a partir do corrimento uretral induzido por massagem da uretra. Caso não seja obtido nenhum corrimento, um swab fino pode ser introduzido até 2 cm da uretra distal e girado suavemente. Pode-se usar também a própria alça bacteriológica para raspagem da uretra. São realizadas duas coletas que serão utilizadas para a bacterioscopia e colocada em meio de transporte ou semeada diretamente no meio thayer Martin. Secreção uretral Na mulher A parte externa da uretra deve ser limpa com algodão. Com o auxílio de um swab , o corrimento é estimulado porpressão e massagem da uretra contra a sínfise púbica,obtendo-se assim a amostra. Caso não se obtenha nenhum corrimento, a coleta deverá serfeita no interior da uretra, com a alça bacteriológica. São realizadas duas coletas que serão utilizadas para abacterioscopia e colocada em meio de transporte ou semeadadiretamente no meio thayer Martin. Bacterioscopia Exame direto a fresco Não é feito para diagnóstico de Neisseria é utilizado principalmente para visualização de Trichomonas vaginalis. A visualização de Trichomonas móveis pelo exame direto a fresco é positiva em cerca de 50-70% dos casos confirmados em cultura. Observa-se também a presença de Candida spp Bacterioscopia Exame direto pelo método de Gram Devem ser preparados logo após a colheita do exsudato, usando um swab ou alça bacteriológica. Deve-se girar o swab sobre a lamina, em vez de esfrega-los, o que permite a distribuição das células sem que se rompam. Devem ser secados naturalmente e fixados imediatamente pelo calor e corados pelo método de Gram. 01/07/2018 4 Relato bacterioscópico Quantificar no material analisado a presença ou ausência de diplococos Gram-negativos com características de Neisseria em: raros (+) poucos (++) moderados (+++) muitos (++++) descrever se o microrganismo são extra-celulares ou intra-celulares, quantidade de neutrófilos e de células epiteliais. Identificação Bacteriana Cinco requisitos básicos devem ser observados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae Semeadura imediata no meio de transporte ou Thayer Martin modificado Atmosfera de CO2 em torno de 5 a 10% Teor de umidade em 90% Incubação a 35°C ± 2 graus Meios adequados Meios de cultura Para transporte: Amies Contém fosfatos inorgânicos e carvão ativado além de solução salina balanceada. Essas caracteristicas deram ao meio uma eficácia superior ao meio de Stuart. -Prazo máximo 8 horas Meios de cultura Para isolamento: Agar Thayer- Martin modificado Base agar GC, 5 a 10 % de sangue de carneiro, isovitalex e VCNT (Vancomicina, Colistina, Nistatina e trimetoprim) -isovitalex (suplemento de enriquecimento) Contem; vitamina B12, l-glutamina, adenina, guanina, ac. Paraminobenzóico, l-cistina, dextrose, nitrato férrico, tiamina, cisteina, cocarboxilase. Agar chocolate enriquecido 01/07/2018 5 Meios de cultura Para oxidação dos Açúcares ( glicose, maltose, lactose, sacarose) Cystine Tripcase agar (CTA) Concentração dos açúcares por tubo 1% Meio semi sólido: contendo 0,25 % de agar, cistina, peptona e vermelho de fenol como indicador Diagnóstico Presuntivo Oxidade positiva Coloração de Gram Diplococos Gram negativos Intra ou extra celulares Catalase positiva Diagnóstico Confirmatório Semeio em Agar chocolate enriquecido Colônias pequenas e brilhantes, viscosas e fortemente aderidas ao meio Oxidação dos açúcares (CTA) Oxida apenas a glicose Pesquisa de beta-lactamase ou Penicilinase Método cromogênico - nitrocefin (cefinase). A pesquisa deve ser feita para cepas resistentes a penicilina. Fundamento: Os testes cromogênicos detectam a capacidade da beta lactamase de hidrolisar o anel beta lactâmico de uma cefalosporina cromogênica, levando a mudança de cor pela ruptura do anel. A cefalosporina cromogênica pode ser encontrada na forma líquida, em discos ou em fitas 01/07/2018 6 Ureaplasma urealyticum / Mycoplasma hominis Coleta do material Mulher: Fundo do saco posterior ou canal endocérvico. Remover o excesso de secreção Introduzir o Swab no fundo do saco, girando o mesmo varias vezes Homem: Não deverá urinar até uma hora antes da coleta. Uretra Remover o excesso de muco e secreção Introduzir o Swab de 2 a 3 cm na uretra fazendo movimentos rotatórios por 1 a 2 segundos Transporte do material Obs.: Os swabs devem conter alginato de cálcio, caso não seja processado imediatamente e mantidos em refrigeração (4oC). Nunca devem ser colocados a temperatura ambiente. Meio de transporte Ideal Devem conter: proteinas, extrato de levedura, NaCL, cisteina, soro de cavalo, e uma mescla de antibióticos Diagnóstico laboratorial Kits estão disponíveis no comércio como Mycoplasma IST® 2 bioMérieux , Mycofast® Internacional Mycrobio. Cultura utilizando o meio agar A-7 diferencial de Shepard modificado por Silva - Mycogen 01/07/2018 7 Cultura com o meio Mycogen Semear a amostra logo após a colheita com o próprio swab. Caso não seja possível utilizar o meio de Stuart. Quando o Swab estiver no meio de Stuart , fazer o esgotamento do mesmo nas paredes do tubo , evitando conduzir excesso de meio de transporte para a placa. Deslizar o Swab suavemente, girando ao mesmo tempo. Incubar a placa em jarra com vela por 48 horas a 35- 37°C. Avaliação do resultado Microscopia Colocar a placa invertida no platô do microscópio. Utilizar a objetiva de 10X Identificar as colônias: M. hominis - forma de ovo frito U. urealyticum - granulações escuras com aspecto de “bom-bril” . Fazer a contagem (varredura) Contagem igual ou superior a 50 colônias equivale a 105 UFC/ mL Ureaplasma urealyticum / Mycoplasma hominis Característicasgerais: São membros da classe Mollicutes, familia Mycoplasmataceae. É uma das menores bactérias conhecidas que causam doenças em humanos. Não possuem parede celular. Contém colesterol na composição de sua membrana Tem forma cocóide Causa de UNG A uréia é fator de crescimento para U. urealyticum e a arginina para M. hominis Características Estruturais de Mycoplasma 01/07/2018 8 Chlamydia trachomatis Amostras - Endocervical - Uretral e urina (homens) Coleta endocervical Remover o excesso de muco da região endocervical Introduzir o Swab no canal endocervical, rodar e esfregar firmemente na parede do canal por 15 a 30 segundos Retirar sem tocar na superfície vaginal Colocar no tubo de extração Realizar o teste imediatamente Coleta uretral masculina O paciente não deve urinar pelo menos uma hora antes da coleta Usar Swabs com ponta de fibra ou escova citológica Introduzir o Swab 2-3 cm da uretra, rodar por 10 segundos Retirar o Swab e coloca-lo no tubo de extração Realizar o teste imediatamente Obs.: Caso não seja possível realizar o teste imediatamente após a coleta, o swab deve ser colocado em um tubo de transporte seco. Podendo ser armazenado de 4 a 6 horas a temperatura ambiente ou 24 a 72 horas em geladeira. Chlamydia trachomatis Características gerais São intracelulares obrigatório Forma ovóide que varia em tamanho durante o ciclo reprodutivo Possui estrutura semelhante às de bactéria Gram negativa A parede celular não contém ácido murâmico Agente etiológico da Uretrite ou cervicite inespecífica, ou Uretrite não gonocócica (UNG) Adesinas fixam-se a receptores nas membranas celulares do hospedeiro Têm um ciclo vital exclusivo 01/07/2018 9 Ciclo Evolutivo da Chlamydia Diferenças básicas do corpúsculo elementar e do corpúsculo reticular Corpúsculo Elementar Corpúsculo Reticular 300-400nm 800-1000nm Forma infectante Forma replicativa, metabolicamente ativa e não infectante Resiste ao meio extracelular Intracelular Diagnóstico Laboratorial a cultura, Imunofluorescência direta (DFA), o enzimaimunoensaio (EIA), a sonda de DNA e as técnicas de amplificação de ácidos nucléicos, diagnóstico indireto através da pesquisa de anticorpos Imuno Rápido Chlamydia É um teste imunocromatográfico de detecção de antigeno, utilizando anticorpos específicos (um conjugado a um corante e outro ligado a fase sólida) Princípio: Após a extração da amostra se a Chlamydia trachomatis (antígeno) estiver presente se ligará ao conjugado anticorpo corante formando um complexo antígeno anticorpo. Este complexo flui pela área absorvente da placa teste indo se ligar ao anticorpo na área da reação 01/07/2018 10 - Um diagnóstico é definitivo quando a cultura é positiva ou - um teste não-cultural é confirmado por um segundo teste não cultural. A associação de duas técnicas não-culturais positivas é aceita como padrão-ouro expandido. De acordo com o Guia da Prática Clínica, publicado pelo CDC (Centers for Disease Control) Haemophilus ducreyi Diagnóstico Laboratorial Coleta: Raspado da lesão ou da secreção da lesão Microscopia pelo método de Gram ( bacilos Gram negativos/ variavel em cadeias ou cardume de peixe ) Catalase negativa Cultura em Agar chocolate acrescido de 1% de Iso VitaleX® ou fator VX líquido e 3µg/mL de vancomicina Crescimento é estimulado por 5 -10% de CO2 a35± 2 graus por um período de até 7 dias Cerca de 2/3 dos isolados de Haemophilus ducreyi produzem ß- lactamase Haemophilus ducreyi Características gerais Cocobacilos Gram negativos (Variável) pleomórficos em cadeias ou cardume de peixe Sensíveis a dessecação Requer fator X (hemina) Agente etiológico do cancro mole também conhecido como cancróide, ou cancro venéreo simples. 01/07/2018 11 Complicações/Consequências Formação dos bubões Período de Incubação 2 a 5 dias Tratamento Teraciclina, eritromicina, sulfa ou combinação trimetoprim/sulfametoxazol Associações com outras DSTs AIDS Sífilis Trichomonas vaginalis Diagnóstico Laboratorial Exame direto a fresco: visualização de trofozóitos móveis. Coloração de Gram. Exame colpocitológico pelo Papanicolau. Isolamento em meios de cultura específicos (Roiron, Kupferberg, Diamond). Pesquisa pela metodologia de sondas de DNA . Trichomonas vaginalis Características gerais: Protozoário Possui quatro flagelos anteriores e uma membrana ondulante. Agente etiológico da Tricomoníase vaginal ou uretral doença mais comum causada por protozoário do trato urogenital do homem e da mulher. Se alimenta de bactérias e secreções celulares. 01/07/2018 12 Candida albicans Diagnóstico Laboratorial Exame direto a fresco: Hidróxido de potássio a 10 % Cultura: Meio padrão Agar sabouraud Identificação de espécies CHROMagar CANDIDA® Candida albicans Características gerais Levedura. Dimórfica podendo formar pseudomicélio ou um micélio verdadeiro. Agente etiológico da candidíase vulvo-vaginal (80- 92%). Causas mais freqüente de infecção genital. Cresce no pH normal da vagina. Não é uma doença de transmissão exclusivamente sexual. Fatores que predispõem ao aparecimento da infecção Diabetes melitus. Gravidez. Uso de contraceptivos (anticoncepcionais) orais. Uso de antibióticos . Medicamentos imunosupressivos (que diminuem as defesas imunitárias do organismo) Obesidade, uso de roupas justas etc. 01/07/2018 13 Gardnerella vaginalis Diagnóstico Laboratorial Microscopia exame direto ou esfregaços corados. Aparecimento de ”Clue cell” (células-guia). Cultura - usa-se o agar sangue humano que é um meio semelhante ao Thayer-Martin sem os inibidores (vancomicina, colistina, nistatina) ou agar vaginalis. A incubação deve ser a 35oC ± 2 graus em um ambiente de 5% de CO2 por um período e 48 horas. Ascolônias se apresentam pequenas e hemolíticas (hemolisam sangue humano mas não sangue de carneiro). Outras características bioquímicas importantes: oxidase negativa, catalase negativa, hidrolise do hipurato positiva, produção de ácido (más não de gás) a partir de glicose. Diferença entre vaginose e vaginite Vaginite verdadeira infecção dos tecidos vaginais Vaginose as lesões dos tecidos não existem ou são muito discretas, caracterizando-se apenas pelo rompimento do equilíbrio microbiano vaginal normal Características Laboratoriais Para o Diagnóstico de Vaginose Bacteriana Critérios adotados Teste ou método usado Característica de VB Descarga purulenta Observação visual Homogenia, branco acinzentada, aderente pH do fluido vaginal Papel de pH >4,5 Odor de Peixe Misturar com algumas gotas de KOH a 10% e verificar o odor ( teste da amônia) Odor devido a produtos da descarboxilaçào da lisina (cadaverina) ou ornitina (putrescina), ou a presença de trimetilamina ”Clue cell” Exame direto a fresco ou Gram Células escamosas do epitélio vaginal cobertas com bactérias 01/07/2018 14 Critério Interpretativo Observar na coloração de Gram o número de ”Clue cell” presentes com o seguinte critério interpretativo: 0-3 = Normal 4-6 = microbiota vaginal alterada 7-10 = vaginose bacteriana Gardnerella vaginalis Características gerais Cocobacilo pleomórfico. Gram negativo a Gram variável. Anaerobio facultativo. Parte da flora vaginal normal de 20 a 40% das mulheres saudáveis. Desequilíbrio dessa flora, ocorre um predomínio dessa bactéria (segundo alguns autores em associação com outros germes como bacteróides, mobiluncus, micoplasmas etc) Agente etiógico da vaginose bacteriana (vaginite inespecífica) Morfologia, coloração de Gram, principal característica Agente etiológico Morfologia Coloração de Gram Característica Neisseria gonorrhoeae* Cocos Gram negativo Forma de rim intra ou extra celular Chlamydia trachomatis Cocóides(inclusões citoplasmática) Não é utilizada Intra celularNão possui peptideoglicano Mycoplasma hominis Cocos Não se cora Sem parede Ureaplasma urealyticum Cocos Não se cora Sem parede *No inicio da doença intracelular, com o progredir da infecção aumenta o número de gonococos extracelulares **Parede celular semelhante às de uma Gram negativa porém possuemcadeias laterais mais curtas ***Forma pleiomórfica reação Gram positiva ocasional; parede celularestruturalmente semelhante à de uma Gram positiva, porém é tão fina queocasiona uma reação de coloração Gram negativa Morfologia, coloração de Gram, principal característica Agente etiológico Morfologia Coloração de Gram Característica Haemophilus ducreyi** Cocobacilos/ bacilos Gram variavel Cardume de peixe Gardnerella vaginalis*** Cocobacilos/ bacilos Gram negativo (variável) Células guia (Clue cells) Candida albicans Levedura Trichomonas vaginalis Parasito 01/07/2018 15 Agente etiológico / requerimento de oxigênio Agente etiológico Requerimento de oxigênio Neisseria gonorrhoeae Aeróbio Chlamydia trachomatis Anaeróbio facultativo Mycoplasma hominis Anaeróbio facultativo Ureaplasma urealyticum Anaeróbio facultativo Haemophilus ducreyi Anaeróbio facultativo Gardnerella vaginalis Anaeróbio facultativo Agente etiológico/Doença/Complicação Agente etiológico Doença Complicações Neisseria gonorrhoeae Gonorréia DIP, Infertilidade,parto prematuro, aborto espontâneo Chlamydia trachomatis UNG Infertilidade, gravidez ectopica Mycoplasma hominis UNG DIP, febre pós parto, Infertilidadde(homem) Ureaplasma urealyticum UNG Parto prematuro,aborto espontâneo, ruptura de membrana Agente etiológico/Doença/Complicação Agente etiológico Doença Complicações Haemophilus ducreyi Cancro mole Bubões Gardnerella vaginalis Vaginose bacteriana Infertilidade Candida albicans Candidiase vulvovaginite Trichomonas vaginalis Tricomoniase Uretrite, vulvovaginite Agente etiológico/Período de incubação/ tratamentoAgente etiológico Período de incubação tratamento Haemophilus ducreyi 2-5 dias Eritromicina Gardnerella vaginalis 2-21 dias Metronidazol,clindami cina, eritromicina Candida albicans Variável Cetoconazol Trichomonas vaginalis 10-20 dias Metronidazol 01/07/2018 16 Agente etiológico/diagnóstico laboratorial Agente etiológico Diagnóstico laboratorial Neisseria gonorrhoeae Gram - cultura Chlamydia trachomatis Cultura de células Imunofluorescência direta ELISA Imuno Rápido Chlamydia Mycoplasma hominis Cultura – kits de identificação Meio Mycogen Ureaplasma urealyticum Cultura – kits de identificação Meio Mycogen Agente etiológico/diagnóstico laboratorial Agente etiológico Diagnóstico laboratorial Haemophilus ducreyi Gram-cultura Gardnerella vaginalis Gram Candida albicans Exame direto a fresco Gram Trichomonas vaginalis Exame direto a fresco Gram Antibiograma SENA, K.X.F.R. 01/07/2018 17 Laboratório de Bacteriologia Clínica Finalidade básica Fornecer informações sobre a presença de microrganismos que possam estar relacionados a processos infecciosos. Realizar testes de sensibilidade dos microrganismos isolados das diferentes amostras clínicas. Os testes de suscetibilidade antimicrobiana medem a capacidade de um antibiótico ou outro agente microbiano inibir o crescimento bacteriano “in vitro”. Estes testes devem ser feitos no laboratório clínico por dois motivos principais. Para guiar o clínico na seleção do melhor agente antimicrobiano para o paciente segundo padrões analíticos referendados. Para acumular informações epidemiológicas sobre a resistência de microrganismos de importância em saúde pública dentro da comunidade. Antibiograma Bauer-Kirby modificado) O antibiograma reflete basicamente duas variáveis Droga – eficaz ou não eficaz Bactéria – resistente, sensível, moderadamente sensível Categorias do método de Bauer-Kirby modificado - Suscetível quando a infecção causada pelo microrganismo está propensa a responder ao tratamento com a droga, na dose recomendada. - Suscetibilidade intermediária implica que a infecção devido ao agente isolado pode ser apropriadamente tratada em sítios corpóreos onde a droga é fisiologicamente concentrada ou quando uma alta dosagem da droga pode ser usada. - Resistentes o microrganismo não responde a uma determinada droga, independente da dosagem e da localização da infecção. 01/07/2018 18 Fatores que influenciam o tamanho da zona de inibição no método de difusão em disco - Densidade do inóculo - Sincronização na aplicação do disco - Temperatura de incubação - Tamanho da placa, profundidade do meio de agar e distância entre os discos de antibiótico - Potência dos discos de antibiótico - Meio de cultura apropriado. Preparação do Inóculo A. Método de crescimento -Transferir duas a três colônias bem isoladas e do mesmo tipo morfológico para tubo contendo caldo BHI ou caldo de soja tríptica. -Incubar os tubos a 35º C até alcançar a turbidez necessária ( 2 a 6 horas). B. Método de suspensão direta das colônias -Transferir duas a três colônias bem isoladas e do mesmo tipo morfológico para tubo contendo solução salina até alcançar a turbidez necessária. Densidade do inóculo Padronizar a densidade do inóculo na turbidez equivalente ao tubo 0.5 da escala de McFarland (108 UFC/mL) 01/07/2018 19 Meio de cultura apropriado Microrganismos não fastidiosos Agar Mueller Hinton Microrganismos fastidiosos HTM – Haemophilus spp. GC – Neisseria gonorrhoeae Agar Sangue – Streptococcus spp. Período de Incubação das placas -Incubar as placas por um período de 16 a 18 horas. -Após o período de incubação adequado medir os diâmetros dos halos de inibição em mm. -Interpretar os tamanhos dos halos de inibição classificando os microrganismos como sensíveis, intermediários e resistentes. Para oxacilina e vancomicina a incubação deve ser de 24 horas. Regras para utilização dos antimicrobianos 1. Benzilpenicilina é usada representando todas as penicilinas sensíveis à ß-lactamase (como fenoximetilpenicilina, feneticilina). 2. Oxacilina é o representante de todo o grupo das penicilinas resistentes à ß-lactamase (incluindo meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina). 3. A desvantagem de se utilizar o disco de meticilina como representante das penicilinas resistentes à ß-lactamase é sua grande instabilidade química mesmo em condições convencionais de estocagem. 01/07/2018 20 Regras para utilização dos antimicrobianos 4. Os resultados obtidos no disco tetraciclina podem ser aplicados a clorotetraciclina, oxitetraciclina e outros membros deste grupo. 5. Os resultados com o disco de cloranfenicol podem ser extrapolados ao tianfenicol. 6. Somente um representante de sulfonamidas é necessário em um teste. 7. Ampicilina é o protótipo para o grupo penicilinas de amplo espectro. Como é sensível a ß- lactamase não deve ser usada para testar Staphylococcus produtor de ß-lactamase. Geralmente a susceptibilidade à ampicilina é valida para outros membros do grupo como a amoxicilina. Regras para utilização dos antimicrobianos 8. A cefalotina é testada como representante de todas as cefalosporinas de primeira geração (cefalexina, cefradina, cefaloridina, cefazolina, cefapirina). Podem-se usar ainda representantes de cefalosporinas de 2 e 3 gerações (cefoxitina, cefamandol, cefuroxima,cefotaxima, ceftriaxona). 9. Cefepima e cefpiroma são cefalosporinas de 4 geração muito ativas para Pseudomonas e outros Gram-negativos. 10. AEritromicina é o representante dos Macrolídeos. Regras para utilização dos antimicrobianos 11. O uso de nitrofurantoina esta limitado somente para infecções do trato urinário. 12. Ácido nalidíxico somente para cepas urinárias de Enterobacteriaceae. 13. Carbenicilina somente para cepas urinárias de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp. 14. Azitromicina, Claritromicina, Eritromicina e Clindamicina não devem ser informadas rotineiramente em cepas isoladas do trato urinário. Regras para utilização dos antimicrobianos 01/07/2018 21 Resultados não confiáveis Resultados enganosos perigosos relatados como sensíveis contra microrganismos específicos - Cefalosporinas de primeira e segunda geração e aminoglicosídeos contra Salmonella e Shigella spp. - Todos os agentes antimicrobianos β-lactâmicos (Excetuando-se oxacilina, meticilina, e nafcilina) contra estafilococos resistentes a meticilina. - Cefalosporinas, aminoglicosídeos, clindamicina e sulfametoxazol/trimetoprim contra Enterococcus.
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