BROMATOLOGIA - PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

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Bromatologia - Profa.Ionara F. R. Vieira
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DISCIPLINA BROMATOLOGIA
Michelle Melo
PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
Bromatologia - Profa.Ionara F. R. Vieira
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PROTEÍNAS
DEFINIÇÃO
Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn).
Polímero de alto peso molecular
Unidade básica: aminoácidos
IMPORTÂNCIA
nutricional
propriedades sensoriais
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Unidades estruturais básicas das proteínas
PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS (aa)
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PROTEÍNAS
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PROTEÍNAS
São polímeros de aminoácidos. 
Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente nas proteínas.
Diferem com o tipo, número e seqüência de aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional.
Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.
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Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.
Aminoácidos essências (lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo organismo humano.
Proteínas alimentares são digeríveis, não tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas moleculares, atributos nutricionais e propriedades físico-químicas.
PROTEÍNAS NO ALIMENTO
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Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos. 
Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, freqüentemente determinam sua textura, por exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe. 
PROTEÍNAS
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Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais:
 P.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes.
PROTEÍNAS
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IMPORTÂNCIA
Conhecer o valor nutritivo
Determinação da composição centesimal de um alimento e análise para rotulagem
Estimar rendimento industrial
Avaliar a qualidade (ex.: glúten  qualidade da farinha)
Avaliar a influência nas propriedades sensoriais
MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS 
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MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio:
Kjeldahl **
Dumas **
Destilação direta
B. Métodos químicos e físicos
Reação do Biureto **
Interação proteína-corante (Dye-binding) **
Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente **
Titulação com formol
Espectroscopia no IV ou no UV **
Refratometria
Turbidimetria **
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 É a determinação mais utilizada.
Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio.
Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%. 
%Proteinas = F x %N
Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
Análise de nitrogênio
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Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl. 
Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento.
Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas. 
F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão. 
Proteínas - Kjeldahl
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KJELDAHL
É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado. 
Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.
O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.
 
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MÉTODO KJELDAHL
1a etapa: Digestão
O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). 
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Deixar digerindo em aquecimento até que o conteúdo do balão fique límpido e transparente (azul ou verde claro). 
A digestão termina quando os gases brancos desaparecem e o material contido no tubo de Kjeldahl tornar-se límpido. Isto varia de 1 – 3h, dependendo da amostra.
 Coloque para digerir no bloco digestor com a chapa a 450°C.
Coloque 15mL de água destilada no tubo até dissolver a amostra
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A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20.
 O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim permanece na solução:
CHON (alimento)  (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)
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2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO
Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)
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A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso. 
NH3 + H3BO3  NH4+ + H2BO3- (íon borato) (3)
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Deixe destilar até a cor verde
Coloque 10mL de ácido bórico 3% em um erlenmeyer de 250mL com 3 gotas de indicador misto
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DIGESTOR
DESTILADOR
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MÉTODO KJELDAHL
3a etapa: Titulação 
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico. 
H2BO3- + H+  H3BO3 (4)
A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio.
O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado:
 %Protein = F x %N
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solução de ácido clorídrico 0,1N
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Falhas do processo (Kjeldahl): 
1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). 
	Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.
3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos
5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes
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Bromatologia
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MÉTODO DUMAS (1831)
Também determina N total. 
Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2. 
O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental.
N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final. 
 
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MÉTODO DUMAS
Necessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F.
Problemas: sujeita à erros  pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa. 
Equipamento - melhora precisão; 
- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;
- não necessita de reagentes ou catalisador. 
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TURBIMÉTRICO
Fundamento: medida da turbidez causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico.
 Precipitante + proteína  turbidez
Mede-se o grau de turbidez.
Rápido, simples (proteínas líquidas).
Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas.
A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração. 
As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida. 
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E VISÍVEL
Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas.
Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho.
 Absorbância depende do tipo de proteína. 
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Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas.
Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro. 
Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm.
Determina proteínas.
Teste do Biureto (Riegler, 1914)
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Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas).
 Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul. 
Cor azul  colorímetro (500 a 750 nm)  curva padrão.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Desvantagens: 
É lento: operações múltiplas e período de incubação
Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida
Intensidade da cor depende de cada proteína.
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ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS
Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas.
A proteína é hidrolisada  usando um ácido forte ou enzimas  libera aminoácidos.
Cromatografias separam os aminoácidos  troca iônica, afinidade ou por absorção. 
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UNIFENAS
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