PCR Reaçao em cadeia da Polimerase

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PCR - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
 É uma replicação in vitro de DNA. 
 É uma técnica que permite isolar e fazer múltiplas cópias de uma região 
específica do DNA. 
 Amplificação de segmentos específicos de DNA que podem ser observados na 
eletroforese. 
 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
 É uma reação cíclica na qual os produtos de um ciclo são substratos 
para o ciclo seguinte. 
 
Reação em Cadeia da Polimerase 
UM POUCO DE HISTÓRIA... 
 Kary Mullis, geneticista 
Nobel Prize em Química (1993) pelo 
desenvolvimento de um método que 
permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, 
uma grande quantidade de um determinado 
fragmento de DNA 
Seus estudos em 1985 permitiram amplificar 
o DNA 
 Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic 
sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54 
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods 
Enzymol 155: 335-35 
 
 
 
COMPONENTES DA REAÇÃO DE PCR 
Amostra de DNA 
Enzima Taq-polimerase 
Oligonucleotídeos iniciadores – Primers 
dNTPS – Nucleotídeos de DNA 
Tampão 
Cofatotores 
 Enzima termoestável 
 Exibe uma maior atividade em pH 8,5 e Tº ótima a 
72°C. 
 É estável a incubações prolongadas a 95°C. 
 Purificada a partir de Thermus aquaticus. 
 Velocidade da amplificação, média 0.9~1.2kb/min 
(70~75°C) 
 Atividade de exonuclease apenas 5’3’ 
 Sempre acrescenta uma A em cada fragmentos 
finalizados em 3’-dA. 
 ** Requer tampão e cofator 
 
 
TAQ – POLIMERASE 
 São oligonucleotídeos iniciadores. 
 Curtos seguimentos de nucleotídeos de 
composição estabelecida, tamanhos variáveis e 
complementar a uma região de DNA - alvo. 
 Encontra os trechos de DNA a serem 
amplificados na PCR. 
 Se caracteriza como ponto de partida para a 
amplificação 
 
PRIMERS 
Na reação de PCR usamos 1 par de primers 
Região a ser amplificada 
Primer que anela/complementar a fita 3’-5’ 
Primer que anela/complementar a fita 5’-3’ 
PRIMERS 
 
 CRITÉRIOS DE QUALIDADE DE UM PRIMER 
 Tamanho desejado varia entre 18-24pb 
 Quantidade de CG (50-60%) 
 Tm (Temperatura de fusão) 
 
 
 
 
PRIMERS 
 O que a Melting Temperature (Tm)? 
 Temperatura na qual 50% das fitas de DNA a serem amplificadas estão 
desnaturadas. 
Ta: Anneling Teperature 
Regra geral: Ta = Tm-5°C 
Tm = 55-65°C 
dATP, dTTP, dCTP, 
dGTP 
DNTPS 
Desoxinucleotídeos trifosfatados 
• Condições ótimas para a máxima eficiência da enzima. 
 
• Influenciam na cinética de hibridização do DNA. 
 
• Íons de Mg são necessários 
para estimular a Taq-pol. 
 
• 50 mM MgCl2 – diluir para uso. 
COFATORES 
 Mantém o pH ótimo para a atividade da enzima taq-polimerase. 
 
 Tampão 10X: 
 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) 
 500 mM KCl 
 
 Diluir para uso, mas depende do protocolo*** 
 
TAMPÃO 
MASTER MIX DE PCR 
Adicionar os componentes em tubo para Termociclador: 
**** Adicionar igual volume de óleo mineral para termocicladores de 
aquecimento na tampa. 
Preparação em ambientes separados!!! 
1. Extração de DNA 
2. Preparo do Master Mix 
3. Adição da Amostra de DNA ao Master Mix 
4. Amplificação 
5. Eletroforese 
CUIDADO COM A CONTAMINAÇÃO!!! 
 
CUIDADO COM A CONTAMINAÇÃO!!! 
CUIDADO COM A ESTABILIDADE DA REAÇÃO!!! 
 
A preparação do Master Mix 
deve ser realizada em banho-
gelo 
A Taq-pol retirada do freezer 
apenas no momento da 
aplicação 
TERMOCICLADOR 
 É um aparelho que possibilita o 
aquecimento e resfriamento rápido 
das amostras. 
 
 Alterna ciclos de altas e baixas 
temperaturas afim de possibilitar a 
amplificação da amostra de DNA. 
 
 Substitui a enzima helicase.*** 
 
 Reação termodinâmica. 
 Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado 
sejam separadas. 
 A elevação da temperatura entre 90-95 °C promove a separação da fita 
dupla de DNA em duas fitas simples. 
ETAPA DE DESNATURAÇÃO 
ETAPA DE ANELAMENTO 
 Pareamento dos primers. 
 A hibridação dos “primers” descrito como “Annealing”, deve ser feito a 
uma temperatura inferior à da desnaturação (45 a 70 °C). 
 Após annealing dos primers aos segmentos complementares, a taq-
polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas 
simples e tornando-as duplas (extensão). 
 A taq-polimerase inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do 
“primer”, completando a fita simples daí em diante, portanto, sempre na 
direção do fragmento procurado. 
ETAPA DE EXTENSÃO 
PROGRAMA DE CICLAGEM NO TERMOCICLADOR 
RESULTADOS DA PCR – CONVENCIONAL 
 A expressão dos resultados é dado em eletroforese em gel de agarose ou em 
PAGE. 
Figure 1. PCR for the detection of toxR gene, 800bp) unique to 
V. cholerae strain. Lane M: DNA ladder (100 bp); lane 7, negative 
control; lanes 4-6, V.cholerae isolates; lane 8, positive control. 
APLICAÇÕES DA PCR 
 SEXAGEM FETAL 
 
 PERÍODO DE COLETA: A partir da 8º semana de gestação 
 AMOSTRA: Sangue materno/Plasma 
 MÉTODO DE COLETA: Sangue periférico coletado em EDTA 
 GENE-ALVO: DYS14 – Cromossomo Y 
 PRIMERS: Y7: 5’- AACTTCTGGGTGTGAATAAG-3’ 
 Y8: 5’- TTCTACATACAATAATGCAG-3’ 
 AMPLICON: 198 pb 
 INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO: Presença da banda, menino 
 Ausência da banda, menina 
 
APLICAÇÕES DA PCR 
 DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE 
 Mycobacterium tuberculosis 
 AMOSTRA: escarro e outras secreções fluídas 
 MÉTODO DE COLETA: escarro ou punção 
 GENE-ALVO: pcaA 
 PRIMERS: Y7: pcaA -1 (5'- ACGCCGCATTTTGGAAAC -3') 
 pcaA-2 (5'-TTTTCCAGTGTGAACTGGTCG -3') 
 AMPLICON: 824-845 pb 
 INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO: Presença, + para doença 
 Ausência da banda, - para doença 
 
REFERÊNCIAS 
 WATSON, J.D. et al. DNA Recombinante: genes e genomas, 3ª ed., São Paulo: Artmed, 
2009, p. 94-104. 
 
 SOUZA, M.T. et al. Técnicas Básicas em Biologia Molecular- 2. ed. Brasília: UNB, 2016. 
 
 SILVA, A. L. M. et al. Biologia molecular: métodos e interpretação .Rio de Janeiro: Roca, 2015.