Micotoxinas - Parte I

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MICOTOXINAS 
Parte 1 
 
 
 
 
 
1 
Universidade Federal do Ceará 
Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem 
DEPARTAMENTO DE FARMÁRCIA 
SETOR DE TOXICOLOGIA 
Disciplina de Toxicologia II 
2 
HISTÓRICO 
• Durante muito tempo: 
 
– Alimentos bolorentos: 
 
 
 
 Problema sensorial Rejeição do produto 
3 
HISTÓRICO 
• Idade média ao início do Século XX: 
 
• Doenças e mortes: 
 
– Ergotismo na Europa; 
 
» 1ª micotoxicose conhecida pelo homem 
(Bíblia); 
» “Fogo de Santo Antônio”; 
» Edema, convulsões. Frio e calor, 
Gangrena necrótica  amputações; 
 
– Aleucia alimentar tóxica na Rússia; 
 (Tricotecenos grupo B) 
Fotomicrografia: 
Claviceps purpurea. 
4 
HISTÓRICO 
• Início Século XX: 
 
– Descoberta da penicilina (1928) e outros antibióticos; 
 
– Epidemias esporádicas com animais de criação. 
 
 
 
5 
HISTÓRICO 
• Década 60: 
 
– Inglaterra: 
 
• Doença “X” dos perus: 
 
Anorexia, apatia, adinamia das asas ÓBITO 
 
 
– Associação causal com ração contaminada. 
 
– Identificação das AFLATOXINAS; 
6 
HISTÓRICO 
 
 
• 1977 - Conferência internacional sobre micotoxinas 
(Food Agriculture Organization – FAO / World Health 
Organization – WHO / United Nations Environment 
Programme - UNEP): Aflatoxinas, OTA, patulina, 
zearalenona, tricotecenos, citrinina e ácido penicílico; 
 
• De 1977 aos dias atuais: identificação e caracterização 
de grande número de micotoxinas. 
7 
MICOTOXINAS 
• Def.: “Agentes químicos produzidos durante 
metabolismo secundário de fungos 
filamentosos, que contaminam alimentos e 
rações animais, produzindo efeitos agudos ou 
crônicos, via de regra, carcinogênicos.” (Mídio) 
 
• Metabolismo secundário: 
 
– Produto não apresenta significado bioquímico específico no 
crescimento e no desenvolvimento do organismo produtor. 
 
– Micromicetos: extenso metabolismo 
secundário. 
Alternaria spp. 
8 
MICOTOXINAS 
• Fonte de exposição: 
 
– Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
• Incontrolável ou difícil controle; 
 
• Vegetais, animais, derivados industrializados; 
• Presentes na alimentação 
humana e animal desde o 
surgimento da produção agrícola 
intensiva; 
9 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Alimentos contaminados por micotoxinas: FATO. 
 
– Pequenas concentrações; sem alteração no odor, 
sabor e aparência  consumo imperceptível. 
 
– Problema ultrapassa a importância meramente 
acadêmica: PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA. 
10 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
Produtos comercializados: interesse econômico quase 
prioritário 
 
 
 
 
 
  IMPORTÂNCIA DADA AO ASSUNTO 
11 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Conhecimento do potencial tóxico têm levado a 
medidas preventivas. 
 
– Resultados: 
 
• Eliminação de epidemias de Ergotismo; 
 
• Controle da Aleucia Tóxica Alimentar (ATA); 
 
• Interesse e contínua vigilância em vários países. 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Amendoim, derivados e similares: 
 
• Importância maior: contaminação por Aflatoxinas. 
 
• Amostras comerciais têm sido analisadas desde 
anos 70: quantidades significativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Cereais e seus produtos: 
 
• Milho: 
 
– Contaminação maior por aflatoxinas (colheita 
em ambiente de alta umidade); 
– Zearalenona bastante frequente; 
– OTA ocasionalmente em seus produtos. 
14 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Cereais e seus produtos: 
 
• Cevada, centeio, aveia: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
•Frequente presença de OTA; 
 
•Alcalóides do Ergot 
(Ergotamina); 
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MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Leguminosas: 
 
• Aflatoxinas detectadas em feijão, grão-de-bico e 
outras leguminosas; 
 
16 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Frutas e sucos de frutas: 
 
• Frutas secas facilmente contaminadas por fungos; 
 
• Figos secos contaminados por aflatoxinas; 
 
• Maçãs, sucos e fermentados (cidra e vinagre) 
contaminados por fungos produtores de patulina: 
frutos parcialmente deteriorados. 
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MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Especiarias e ervas medicinais: 
 
• Fungos isolados: Aspergillus e Penicillium; 
 
• Micotoxinas detectadas: aflatoxinas, 
esterigmatocistina, citrinina, zearalenona, 
tricotecenos (toxina T-2) e OTA. 
 
18 
MICOTOXINAS 
• Contaminantes químicos diretos dos alimentos: 
 
– Leite e derivados: 
 
 
• Aflatoxina M1 detectada desde década de 70; 
 
• Leite materno, de gado, integral, desnatado, pasteurizado, 
UHT, evaporado, queijos, iogurtes, etc. 
 
• Relacionado à alimentação dos animais: teores maiores 
naqueles secretados pelos alimentados com ração (entre 
safras). 
 
19 
MICOTOXINAS 
20 
MICOTOXINAS 
21 
MICOTOXINAS 
22 
MICOTOXINAS 
• Micotoxicose: 
 
– Qualquer enfermidade causada ao homem e animais pela 
exposição às micotoxinas. 
 
– Características: 
 
• Relacionada à alimentação; 
 
• Não contagiosa; 
 
• Não infecciosa; 
 
• Causada pela exposição a micotoxinas. 
Doença de Urov ou Kashin-Beck 
23 
MICOTOXINAS 
• Fungos toxicogênicos: 
 
– Capazes de produzir micotoxinas, em condições favoráveis. 
 
 
 
Ex.: Fungos do gênero Aspergillus. 
 
 
 
 
 
Fotomicrografia: Aspergillus flavus. 
24 
MICOTOXINAS 
• Fungos toxicogênicos: 
 
– Nem todos os fungos são toxicogênicos; 
 
– Nem todos os metabólitos secundários dos fungos 
são tóxicos. 
 
 
 
25 
MICOTOXINAS 
• Fungos toxicogênicos: 
 
– Uma única espécie de fungo é capaz de produzir uma ou várias 
micotoxinas: 
 
Ex.: Aspergillus flavus: esterigmatocistina e aflatoxinas. 
 
 
– Uma mesma micotoxina pode ser produzida por diferentes 
espécies de fungos; 
 
Ex.: Aflatoxina B1 : Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. 
 
 
 
 
 
 
26 
MICOTOXINAS 
• Fungos toxicogênicos: 
 
– Classificação segundo habitat e substrato: 
 
• Fungos de campo; 
 
• Fungos de armazenamento; 
 
• Fungos de decomposição. 
Fusarium spp 
27 
MICOTOXINAS 
• Fungos toxicogênicos: 
 
– Principais gêneros: 
 
• Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus, A. nominus, etc. 
 
• Fusarium: F. moliniforme, F. proliferatum, F. culmorum, etc. 
 
• Penicillium: P. expansum, P. verrucosum, etc. 
 
• Outros: Claviceps, Alternaria, Trichoderma, Trichothecium, 
Myrothecium, dentre outros. 
Aspergillus spp 
em 
Ágar Czapek 
28 
MICOTOXINAS 
• Alimentos contaminados por mais de uma micotoxina: 
 
 
– Efeito aditivo; 
 
– Efeito sinérgico; 
 
– Efeito de potencialização; 
 
– Antagonismo. 
29 
MICOTOXINAS 
• Fatores que favorecem a micotoxigênese: 
 
 
 
– Fatores intrínsecos; 
 
 
 
 
– Fatores extrínsecos; 
 
 
 
 
 
 
30 
MICOTOXINAS 
• Fatores intrínsecos: gênero, espécie e linhagem;– A produção de uma micotoxina não está associada a 
uma única espécie de fungo; 
 
– Dentro de uma espécie micotoxigênica nem todas as 
linhagens o são; 
 
– O potencial de produção varia entre as linhagens de 
uma espécie. 
31 
MICOTOXINAS 
• Fatores extrínsecos: 
 
 
 
– Condições do substrato; 
 
 
 
 
– Condições ambientais; 
 
 
 
 
 
 
32 
MICOTOXINAS 
• Condições do substrato: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Aw 
 
 Teores de lipídeos 
 Teores de carboidratos TOXICOGÊNESE 
33 
MICOTOXINAS 
• Condições ambientais: 
 
– Temperatura ótima de micotoxigênese sempre 
ligeiramente mais baixa que temperatura ótima para 
desenvolvimento do fungo; 
 
– Temperatura pode afetar estabilidade química da 
micotoxina produzida; 
 
– Umidades altas favorecem micotoxigênese. 
34 
MICOTOXINAS 
• Condições ambientais: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Regiões clima tropical: 
 (Alta umidade, altas 
temperaturas) 
Contaminação e 
desenvolvimento 
de fungos 
Teores micotoxinas 
35 
MICOTOXINAS 
• Fatores que favorecem a contaminação e 
desenvolvimento de fungos em vegetais: 
 
– Práticas agrícolas incorretas: contato com o solo  esporos; 
 
– Lesões nos grãos por insetos; 
 
– Armazenamento inadequado: 
 
 Umidade alta e pouca ventilação; 
36 
MICOTOXINAS 
• 1977 - Conferência internacional sobre micotoxinas 
(Food Agriculture Organization – FAO / World Health 
Organization – WHO / United Nations Environment 
Programme - UNEP): 
 
– 7 grupos de micotoxinas contaminando alimentos: 
 
• Aflatoxinas; 
• Ocratoxina A; 
• Patulina; 
• Zearalenona; 
• Tricotecenos; 
• Citrinina; 
• Ácido penicílico. 
Colônia Gibberella zeae. 
37 
MICOTOXINAS 
• Atualmente devem ser adicionadas: 
 
 
• Esterigmatocistina; 
 
• Rubratoxinas A e B; 
 
• Citroveridina; 
 
• Fumonisinas. 
 
 
 
 
 
 
Alimento contaminado por Alternaria sp. 
38 
MICOTOXINAS 
• Principais: 
 
• Aflatoxinas; 
• Esterigmatocistina; 
• Ocratoxinas; 
• Zearalenona; 
• Fumonisinas. 
• Tricotecenos; 
• Patulina; 
• Citrinina; 
• Ácido penicílico. 
• Rubratoxinas A e B; 
• Citroveridina; 
• Alcalóides do Ergot; Milho contaminado por fungos. 
39 
AFLATOXINAS 
Aflatoxina B1 . 
40 
AFLATOXINAS 
• Histórico: 
 
– 1960: doença “X” dos perus; 
– Allcroff & Lewis - Isolamento do “fator tóxico” fluorescente que 
promovia em cobaias os mesmos sintomas dos perus. 
– 1961: Sargent et al. – Isolamento Aspergillus flavus e 
associação com o “fator tóxico”. 
 
– AFLATOXINAS Aspergillus FLAvus + TOXINAS 
 
– 1963: Coomes e Sanders – Separação por cromatografia em 
papel duas aflatoxinas: B (azul) e G (verde). 
41 
AFLATOXINAS 
• Histórico: 
 
– De Iongh et al. – Separação das aflatoxinas B por CCD: dois 
componentes de Rf diferente: B1 e B2. 
– 1963: Hartley et al. – Descrição de quatro aflatoxinas: 
B1 , B2 , G1 e G2 
– 1964: De Iongh et al. – Excreção no leite de compostos relacionados à 
B1 : “toxinas do leite”. 
– Holzapfel et al. – Isolamento M1. 
– Outras aflatoxinas identificadas: aflatoxicol, 3B, B2a , G2a , H1 , P1 e Q1 . 
42 
AFLATOXINAS 
• Características químicas: 
 
– Estrutura: derivados difuranocumarinas; 
 
– Solúveis em clorofórmio, metanol, benzeno, 
acetonitrila (benzeno/ acetonitrila 98:2); 
 
– Instáveis à luz UV; 
 
– Bastante estáveis a temperaturas superiores a 
100ºC: pequena ou nenhuma decomposição de 
aflatoxinas com cozimento, pasteurização e 
torrefação de alimentos; 
43 
AFLATOXINAS 
44 
AFLATOXINAS 
• Propriedade especial: 
Sob luz UV ondas longas: fluorescência 
 
– AFBs azul; 
 
– AFGs verde; 
 
– AFM1 azul; 
 
– AFM2 violeta. 
 
 
Espectro de fluorescência das Aflatoxinas: 
45 
AFLATOXINAS 
• Fungos produtores: 
 
– Aspergillus flavus; 
 
– Aspergillus parasiticus; 
 
– Aspergillus nomius; 
 
– Aspergillus tamarii; 
 
Fotomicrografia: Aspergillus flavus. 
46 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência: 
 
– AFBs e AFGs  grãos. 
 
 
 
 
– AFMs  Leite e derivados: 
 
 
Gado confinado, apenas ração AFM1 
 
 
 
 
 
 
 
Milho contaminado por Aspergillus flavus. 
47 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem vegetal: 
 
– Culturas em áreas tropicais e subtropicais mais contaminadas; 
 
– Aflatoxina B1: binômio causa/efeito bem determinado (ingestão 
de alimento contaminado/ efeitos tóxicos); 
 
– Aflatoxinas em ppb (geralmente simultaneamente, B1 em maior 
concentração); 
 
– Características organolépticas dos alimentos preservadas; 
 
48 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem vegetal: 
 
– Obtenção praticamente impossível de certos 
alimentos isentos: 
 
• Maioria dos países (inclusive Brasil): valores 
limites para a presença nos alimentos; 
 
• OBS.: Valores limites não oferecem proteção 
efetiva contra efeito carcinogênico. 
49 
AFLATOXINAS 
50 
AFLATOXINAS 
• Condições que favorecem a produção: 
 
– Para alimentos ricos em amido (trigo, cevada, arroz): 
 
• Teor de água entre 18,3 e 18,5 %; 
 
• Umidade relativa do ar 85%. 
51 
AFLATOXINAS 
• Condições que favorecem a produção: 
 
– Para alimentos ricos em lipídeos (amendoim): 
 
• Teor de água entre 9 e 10 %; 
 
• Umidade relativa do ar 85%. 
52 
AFLATOXINAS 
• Condições que favorecem a produção: 
 
– Integridade física do substrato: proteção contra a 
contaminação. 
53 
AFLATOXINAS 
• Condições que favorecem a produção: 
 
– Temperatura mínima: 12ºC; 
 
– Temperatura máxima: 40 – 42 ºC; 
 
– Temperatura ótima: 27ºC. 
54 
AFLATOXINAS 
• Contaminação dos alimentos de origem vegetal: 
 
– Regra geral: fases de colheita e armazenamento; 
 
– Amendoim, milho e algodão: pode ocorrer no campo, 
após ataque de insetos; 
55 
AFLATOXINAS 
• Contaminação dos alimentos de origem vegetal: 
 
– Técnicas usuais de processamento de alimentos: 
 
• Remoção ineficiente de aflatoxinas sem redução 
de valores nutricionais. 
 
• Exceção: refinamento do óleo comestível. 
56 
AFLATOXINAS 
ALIMENTO PAÍS Nº AMOSTRAS INCIDÊNCIA AFB1(%) ANO 
SOJA ARGENTINA 94 10 1991 
TRIGO URUGUAI 123 20 1996 
AMENDOIM ÍNDIA 380 97 1995 
MILHO ÍNDIA 274 47 1996 
ARROZ EQUADOR 99 9 1997 
Incidência de AFB1 em diferentes alimentos: 
Fonte: Pittet, 1998 (adaptado). 
57 
AFLATOXINAS 
58 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem animal: 
 
– Aflatoxinas M1 e M2: produtos de biotransformação; 
 
– Leite: alimento importante para humanos; 
 
– Crianças: altas taxas de exposição; 
 
 
59 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem animal: 
 
– Aflatoxina M1 : 
 
• Produto hidroxilado da biotransformação da B1 ; 
 
• Estimativa: < 3% ingestão AFB1 no leite na forma de AFM1; 
 
• Relativamente estável em leite cru e produtos industrializados; 
 
• Transformação do leite fluido a leite em pó:  concentração; 
 
60 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem animal: 
 
– Aflatoxina M1 : 
 
• Manteiga: 10% presente no leite fração cremosa; 
 
• Fator importante: confinamentodo gado (alimentação resumida a 
rações, farelo de amendoim, milho ou algodão  frequentemente 
bolorentas); 
 
• Contaminação sazonal: países nos quais animais são confinados 
durante estação fria; 
 
61 
AFLATOXINAS 
• Ocorrência em alimentos de origem animal: 
 
– Aflatoxina M1 : 
 
• Níveis máximos tolerados estabelecidos em vários países; 
 
62 
AFLATOXINAS 
PAÍS ALIMENTO LIMITE (mg/L) 
Brasil Leite líquido 0,5 
França Leite líquido 0,05 
Holanda Leite líquido 0,05 
EUA Leite líquido 0,5 
Fonte: Boutrif & Canet 1998. 
63 
AFLATOXINAS 
• Toxicocinética: 
 
– Absorção 
 
• Depende alimento e concentração; 
• Pode ser completa; 
 
– Distribuição: 
 
• Metabolismo de 1ª passagem; 
• Ligação à albumina; 
• Atingem a maioria dos tecidos; 
• Acúmulo importante no fígado. 
64 
AFLATOXINAS 
• Biotransformação (AFB1): 
 
– Reações de fase I e fase II; 
 
– Fração microssomal hepática: CYP1A2 e CYP3A4; 
 
• Hidroxilação irreversível AFM1 
 
• Hidroxilação reversível AFLATOXICOL (Fração solúvel) 
 
 AFLATOXICOL como reservatório da AFB1 
 
• Oxidação posição 8-9 8,9- EPÓXIDO 
 
 
 
 
 
Colônia Aspergillus flavus. 
65 
AFLATOXINAS 
• Excreção: 
 
– Urina; 
 
– Fezes (excreção biliar); 
 
 
– Leite (metabólitos hidroxilados). 
 
 
 
 
 
Conjugados com ác. 
glicurônico e sulfato. 
66 
Conjugação e excreção 
67 
AFLATOXINAS 
• Efeitos tóxicos: 
 
– Intoxicação aguda: Aflatoxicose 
 
• Dor abdominal, vômitos, hepatomegalia, necrose hepática, 
insuficiência hepática fulminante. 
– Episódio: 26 intoxicados  arroz contaminado. Taiwan 
(Concon 1988); 
• Semelhanças com Síndrome de Reye; 
– Episódio: caso letal de Síndrome de Reye em criança 3 anos: 
ingestão arroz mofado c/ 10mg/Kg (Concon ,1988). 
 
68 
AFLATOXINAS 
• Efeitos tóxicos: 
 
– Intoxicação crônica: carcinogênese. 
 
• Ingestão de alimentos contaminados (baixas 
concentrações, alta freqüência); 
 
• AFB1 grupo 1 IARC – Evidência em humanos; 
 
• AFM1 grupo 2B IARC – Evidência em animais; 
69 
AFLATOXINAS 
• Toxicodinâmica: 
 
– Intoxicação crônica: carcinogênese 
 
– Formação 8,9-epóxido; 
 
• Dano ao DNA: 
 
– Ligação não covalente branda; 
 
– Ligação covalente irreversível (N7 guanina)- 8,9-epóxido; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
70 
AFLATOXINAS 
• Toxicodinâmica: 
 
– AFB1- 8,9-epóxido: 
 
• Iniciador do processo carcinogênico; 
 
• Meia vida em meio aquoso: 1 seg 
 
 AFB1- 8,9-epóxido AFB1- diol. 
 
– Proposta: intercalação na posição 5 do nucleotídio - não 
hidrolisado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
71 
72 
FUNGOS MICOTOXIGÊNICOS 
• Aflatoxinas: 
 
Determinação em alimentos: 
 
• CCD (Qualitativa); 
– Eluentes utilizados: 
• Clorofórmio/Acetona 9:1 
• Tolueno/Acetato de etila/Ácido fórmico 5:4:1 
– Estimativa visual da comparação entre intensidade 
de fluorescência da amostra e padrões de referência; 
 
• HPLC c/ detector de fluorescência (quantitativa); 
73 
 AFLATOXINAS 
Fotografia: Cromatoplaca 
Setor de Toxicologia - UFC 
 
• Fluorescência: 
Propriedade aproveitável para 
identificação das aflatoxinas 
em alimentos; 
74 FIM 
75 
FUNGOS MICOTOXIGÊNICOS 
• Fusarium: 
 
– Doença de Urov ou Kashin-Beck: 
 
– Rússia; 
– Comum em crianças; 
– Associada à contaminação por F. poae; 
– Toxina: desconhecida; 
– Sintomas: 
• Osteoartrite; 
• Encurtamento ossos longos; 
• Deformidade nas articulações; 
• Fraqueza muscular;