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Produção de ÔMEGA-3 por fermentação de Yarrowia lipolytica: de fermentação em batelada à fermentação contínua. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ • INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS • FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA Andre da Luz Freitas Jonas Cunha da Silva José Pureza Castro Júnior Luís Eduardo de Oliveira Teixeira Processos Industriais de Fermentação | Fábio Gomes Moura Autores: Dongming Xie, et al. (2016) Roteiro 1. INTRODUÇÃO 2. LEVEDURA UTILIZADA PARA A PRODUÇÃO 3. OBJETIVOS 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Fermentação Contínua em Dois Estágios 4.2. Análises de amostras de fermentação 1. RESULTADOS 5.1. Produção de ômega-3 por fermentação em batelada 5.2. Criação de um modelo de fermentação em batelada com base nos dados experimentais 5.3. Simulação de modelos de fermentação contínua em um ou mais estágios 6. VALIDAÇÃO DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL 7. VANTAGENS DA FERMENTAÇÃO CONTÍNUA EM DOIS ESTÁGIOS 8. CONCLUSÃO 1. INTRODUÇÃO Os ácidos graxos ômega-3 referem-se aos ácidos graxos poliinsaturados ácido eicosapentaenóico (C20: 5; EPA) e ácido docosahexanóico (C22: 6; DHA) de cadeia longa com a primeira ligação dupla C=C na posição n- 3. DuPont é uma empresa americana e a segunda maior empresa química do mundo em termos de volume de capital, e a quarta em termos de receita. Com isso.... Yarrowia lipolytica modificada para expressar EPA. (2) Obtidos de peixes oceânicos de água fria. 2. LEVEDURA UTILIZADA PARA PRODUÇÃO DE EPA Sistema em batelada para produção de triglicerídeos através de Y. lipolytica Yarrowia lipolytica ● Fonte de carbono incomum: Hidrocarbonetos. Tornou interessante seu uso na microbiologia industrial, especialmente para a produção de lipídios especiais. A partir de vários estudos… utiliza-se As desvantagens na concentração e/ou rendimento do produto, além do aumento do esforço para evitar a contaminação, levaram a poucas aplicações bem- sucedidas de fermentação contínua na produção em larga escala. Devido ● Facilidade de operação, ● minimização do risco de contaminação, ● alto título do produto, ● flexibilidade para escolha do produto final. PORÉM…. Os dois sistemas ainda apresentam pouco rendimento! ANALISAR A PRODUÇÃO DE EPA EM DOIS PROCESSOS DIFERENTES Processo de fermentação contínua de dois estágios Processo de fermentação em batelada Utilizar programas estatísticos com os dados experimentais da fermentação em batelada para analisar, otimizar, projetar e escalonar processos em batelada e em fermentação contínua. Por fim, Realizar experimentos de fermentação contínua em dois estágios para a produção de EPA por Y. Lipolytica na escala de 2-5L durante 6 semanas para validar os modelos previstos. 3. OBJETIVOS Técnica operacional onde um ou mais nutrientes (substratos) são fornecidos ao biorreator durante o cultivo e nos quais o(s) produto(s) permanecem no biorreator até o fim da batelada. De acordo com protocolos de Fermentação em batelada. Estirpes de Y. lipolytica Z6109 e Z7334 CEPAS ATIVADAS FERMENTAÇÃO EM LOTE Fermentador de 2L (Biostat B, Sartorius BBI, Alemanha) 1L contendo Extrato de Levedura e outros nutrientes. Condições: Temperatura: 30°C. pH: 5,5 durante 0-24 h e depois 7,0. Concentração de glicose: 20 g/L. Alimentado quando preciso. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Fermentação Contínua em Dois Estágios Estágio Operacional 1: Fermentação no Modo Fed-Batch (72 ∼ 120 h) Três dias após o início da fermentação fase ‐ 2 ( t = 72 h), iniciou-se a fermentação de estágio 1 (2L) Estágio Operacional 2: Fermentação no Modo Fed-Batch (0 ∼ 120 h) Volume inicial de 3,0 L com um meio contendo 20 g / L de extracto de levedura e outros nutrientes. Operando a Fermentação Contínua em Duas Etapas (120 ∼ 1008 h) Após 120h na Fase 2, a fermentação contínua de dois estágios se inicia bombeando continuamente o caldo das Fases 1 para 2 e bombeando o produto de caldo do vaso da Fase 2 para um tanque de armazenamento. ● Análise lipídica. ● Determinação de peso celular. ● Análise de glicose em Analisador bioquímico YSI-2900. Isolamento de Produtores com Alto Índice de Lipídeos através dos experimentos com fermentação contínua Y. lipolytica Plaqueamento Inoculação e crescimento das colônias isoladas em Caldo (Extrato de levedura e Glicose) Análises dos lipídeos Coletada amostras no intervalos de 8-16h 4.2. Análises de amostras de fermentação 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1. Produção de ômega-3 por fermentação em batelada ■ As duas leveduras tiveram taxa de crescimento celular específico semelhantes. (µmax = 0.26/h) ■ Produziram quantidades semelhantes de lipídios e EPA na fase de produção. ■ Fermentador equipado com sistema de aeração: Nível de oxigênio: 25%. Alto consumo de oxigênio (apróx. 300mmol/L/h) ■ Produção de 50% de lipídios (p/p) de biomassa. ■ EPA representou 50% do total lipídico produzido. Maior valor reportado na literatura. Tempo (h) Tempo (h) Tempo (h) Tempo (h) Tempo (h) Tempo (h) Lipídios (%Biomassa)Biomassa (Unidade/L) Z7334Z6109 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.3. Simulação de modelos de fermentação contínua em um ou mais estágios Modificação do modelo de fermentação em batelada considerando alimentação constante e saída dos produtos formados em cada estágio da fermentação. Objetivo: Encontrar oportunidades significativas para alta produção de EPA em fermentação contínua sem grande de tempo e produtos laboratoriais 5.2. Criação de um modelo de fermentação em batelada com base nos dados experimentais Utilização de 12 equações baseadas nas variáveis de estado. Através do modelo simulado é possível estimar parâmetros ótimos e obter algumas considerações para maior produção de EPA: ■ Necessidade de haver um sistema de fornecimento de oxigênio no fermentador para garantir alta produção. ■ Fermentação contínua em dois estágios oferece bons resultados. ■ De acordo com a relação dos volumes (V1/V2) de cada reator, pode ser necessário menos fonte de nitrogênio para produzir mais células. Estudo experimental de dois estágios de fermentação contínua ● O processo de fermentação contínuo em duas etapas #6 (entrada 16 na Tabela 2), que tem uma baixa taxa de V1/V2 para a alta taxa de produção potencial EPA em grande escala, foi escolhido para uma validação adicional experimental. 6. VALIDAÇÃO DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL O volume de trabalho foi controlado a 1,5 L (V1) e 4,0 L(V2). Comparação entre resultados experimentais da fermentação descontínua alimentada e fermentação contínua em dois estágios de Y. lipolytica Z7334 6. VALIDAÇÃO DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL Isolamento de Produtores de Alto teor de Lípidos a partir da experimento contínuo 7. VANTAGENS DA FERMENTAÇÃO CONTÍNUA EM DOIS ESTÁGIOS Sucesso da fermentação contínuo em duas etapas para a produção de EPA por engenharia Y. lipolytica: 1) Foi necessário um tempo de fermentação significativamente menor (tempo de permanência) para obter o mesmo título de EPA devido à economia tanto do tempo de resposta quanto do tempo inicial de crescimento por operação contínua, o que ajudou a melhorar a taxa de EPA (produtividade). 2) Dois recipientes de fermentação separados foram usados para controle independente e ótimo do crescimento celular e produção de EPA, o que ajudou a fermentação a alcançar títulos mais altos de EPA na biomassa e um rendimento de conversão total de EPA a partir da glicose. 3) Densidade celular significativamente maior foi alcançada devido a um efeito global de menor diluição no processo contínuo, que ajudou ainda mais a fermentação a melhorar a produtividadeda EPA, uma vez que o título de EPA na biomassa foi mantido o mesmo. A maior parte da água em fermentação contínua veio da solução de alimentação de glicose, enquanto a água na fermentação em batelada alimentada foi do meio inicial e da alimentação de glicose. 4) A Y. lipolytica Z7334 estirpe manteve o seu alto teor de lipídios e de produção EPA após um longo período de funcionamento contínuo, devido ao seu elevado grau inerente de estabilidade genética (Xue et al. 2013). X massa celular total (unidade / L) S Concentração de glicose (g / L) N concentração de nitrogênio (mM) L concentração lipídica (unidade / L) E Concentração EPA (unidade / L) C Concentração de subproduto C (unidade / L) FB Taxa de alimentação de base (L / h) FS Taxa de alimentação de glicose (L / h) 8. CONCLUSÃO ✓ As principais condições de meio, alimentação e processo para a produção de EPA com alimentação por lotes foram identificadas e um título final de 25% de EPA na biomassa foi alcançado, o que é até agora o mais alto entre todos os títulos de EPA relatados na literatura. ✓ Comparando o processo padrão alimentado em lote de 2L, o processo de fermentação em 2 estágios melhorou a produtividade em 80% e a concentração em 40% (aumento no título, na taxa, e no rendimento). ✓ Durante a produção de EPA em dois estágios, a estirpe produziu mais lipídios em biomassa e menos subprodutos. ✓ Os modelos matemáticos de produção de ômega-3 por fermentação foram ferramentas eficientes para desenvolver esses processos sem grande quantidade de tempo e trabalho intensivo. REFERÊNCIAS XIE, Dongming et al. Omega‐3 production by fermentation of Yarrowia lipolytica: From fed‐batch to continuous. Biotechnology and bioengineering, v. 114, n. 4, p. 798-812, 2017.
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