Biologia molecular - mecanismo de mutação e reparo DNA

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Biologia molecular 
Prova II
Mecanismo de mutação
Mutações que ocorrem naturalmente incluem todas mudanças imagináveis na sequência de DNA. No ambiente celular, as moléculas de DNA não são estáveis. Cada par de bases em uma dupla hélice de DNA tem certa probabilidade de mutar; o termo mutação cobre uma gama de diferentes tipos de mudanças, desde uma troca de um par de bases até o desaparecimento de um cromossomo inteiro.
Tais mudanças podem ser causadas, por exemplo, pela inserção de um transposon, o qual tipicamente transfere (insere) algumas centenas de pares de bases de um DNA estranho numa seqüência codificadora de um gene, ou por ações aberrantes do processo de recombinação celular.
Muitas mutações localizam-se em sítios diferentes. Aqueles sítios nos quais ocorre um maior número de mutações são chamados de sítios quentes.
Tipos de mutação:
Mutações de ponto - envolvem mudanças em sítios específicos de um gene. Principais tipos de mutações de ponto são: 
TRANSIÇÕES substituição de uma base por outra da mesma categoria química (purina <-> purina / pirimidina <-> pirimidina).
TRANSVERSÕES – que são mudanças de uma base púrica por uma pirimídica ou vice-versa.
Um segundo fato importante é que nem sempre os possíveis sítios mutantes mutam com a mesma eficiência, alguns são “hot-spots” que são pontos onde as mutações ocorrem com uma freqüência mais alta.
As mudanças de uma base são comumente reversíveis e, freqüentemente, a taxa de mutação reversa (do mutante para a forma selvagem) são muito próximas da taxa de mutação do gene selvagem para o mutante.
A mutação ocorre em uma parte codificante de polipeptídeo e que seja uma mutação de um único par de bases, existem vários resultados possíveis:
Mutações sinônimas: a mutação muda o códon de um aminoácido por outro códon do mesmo aminoácido. Podem ser divididas em dois grupos; que envolve troca de bases de DNA e não trocam aminoácidos e as que levam a troca de aminoácidos, mas não afeta a atividade da proteína – mutações neutras. As substituições sinônimas nunca alteram a sequência polipeptídica.
Mutações não-sinônimas (sentido trocado): o códon para um aminoácido é trocado por um códon que codifica a outro aminoácido. A substituição não sinônima pode ser:
*Substituição conservativa: o novo aminoácido é de natureza química similar ao anterior diminuindo a chance de uma alteração grave na estrutura da proteína.
*Substituição não conservativa: neste caso o novo aminoácido possui natureza química bem diferente ao antigo o que pode levar a uma grave alteração na estrutura da proteína.
Mutações sem sentido: o códon para um aminoácido é trocado por um códon de término de tradução (“stop codon”). Mutações sem sentido levarão a um término prematuro do polipeptídeo (pode ter alto efeito de inativação da proteína);
Mutações indel: esse tipo de mutação acrescenta ou retira uma base do lugar alterando a partir deste sítio de mutação toda a sequencia de bases. Portanto esse tipo de mutação também é conhecida como mudanças de matriz de leitura. Essa mudança na matriz resulta tipicamente com a perda completa da estrutura e função normal da proteína.
Mutação direta: altera o fenótipo do tipo selvagem
Mutação Reversa: altera o fenótipo mutante de volta para o selvagem.
Mutações de perda de função Mutações de perda de função - ausência completa ou parcial do funcionamento normal da proteína
Mutações de ganho de função: produz uma característica nova, ou faz com que uma característica apareça em tecidos impróprios.
Como pode ser observado, os efeitos das mutações citadas são, na realidade, fruto das características do código genético: código genético é degenerado (redundante): mais de um códon pode codificar ao mesmo aminoácido; existência de código de término de tradução.
Indels - Inserção ou deleção de bases na molécula de DNA sendo dividas em: 
Inserção: ocorre pela adição de um ou mais nucleotídeos na sequência de DNA. Geralmente, esse tipo de mutação é causado por transposons ou erros dutante a replicação de elementos repetitivos (sequências AT, por exemplo). Insersões na região codificadora de um gene podem alterar o corte (splicing) do mRNA, ou causar mudança no quadro de leitura dos códons. Ambas alterações podem alterar significativamente o produto gênico.
Deleção: Há a remoção de um ou mais nucleotídeos da sequência de DNA. Assim como insersões, essas mutações podem modificar o quadro de leitura do gene. Geralmente elas são irreversíveis; apesar de teoricamente a mesma sequência poder ser restaurada por inserção, elementos de transposição capazes de reverter uma deleção muito curta (com uma ou duas bases) em um dado local são muito improváveis ou mesmo inexistentes[carece de fontes]. É importante notar que uma deleção não é o oposto exato de uma inserção. Enquanto deleções são aleatórias, inserções consistem de uma sequência específica sendo inserida em locais que não são completamente aleatórios.
Inserções e deleções farão com que toda sequência de códons seguinte a ela seja trocado, podendo levar a uma sequência de aminoácidos totalmente diferente da original e, portanto, a uma proteína sem estrutura tridimensional correta (inativa).
Mutação por radiação
Os mutagênicos físicos são as radiações, como por exemplo, o raio X, raios gama derivados do Co60 ou do Ce137, os raios infravermelhos e os ultravioletas. Normalmente os mutagênicos físicos causam alterações a nível cromossômico, principalmente quebras cromossômicas, pois seus efeitos são mais drásticos do que os agentes químicos. 
Os raios X são altamente potentes. Eles podem quebrar cromossomos, oxidar a desoxirribose, desaminar e dehidroxilar bases e formar peróxidos. A luz ultravioleta apesar de ser menos energética que os raios X também é um poderoso mutagênico devido as bases dos ácidos nucleicos absorverem energia de seus comprimentos de onda. Quando expostos a UV as pirimidinas, comumente, adicionam uma molécula de água entre os carbonos 4 e 5, o que enfraquece as pontes de hidrogênio com sua purina complementar e permite separação da cadeia de DNA naquele local.
Mutagênicos químicos 
Entre os mutagênicos químicos há aqueles que são consagrados como tal, são chamados agentes alquilantes, são eles: etil metano sulfonato; etil etano sulfato; metil metano sulfonato; di-etil sulfato; azida sódica; ácido nitroso (HNO2). Esses químicos adiciona radicais alquila -CH3; -CH3-CH2 em posições variadas nas bases nitrogenadas, alterando a cadeia de DNA. Eles são considerados produtos radiomiméticos, pois mimetizam o efeito dos mutagênicos físicos.
Mecanismo de reparação
Reparo por fotorreativação enzimática: É ativada quando dímeros de bases pirimídicas (Timina, Citosina e Uracila) são formados no material genético por meio da exposição a raios UV. Nesse caso, a enzima fotoliase se liga ao dímero e, utilizando a energia proveniente da luz, catalisa a reação de dissociação do dímero. Envolve as seguintes etapas: inicialmente, a enzima reconhece e liga-se ao dímero (mesmo na ausência de luz visível); depois, a absorção de luz fornece energia para converter o dímero em monômero de pirimidina; por fim, a enzima dissocia-se do DNA. A reação depende do gene que codifica a fotoliase e ocorre especificamente em procarioto.
Reparo de bases alquiladas: ocorre quando há a adição de radicais alquila –principalmente o grupo metil - no material genético. Nesse caso a enzima O-metilguanina-metiltransferase reconhece essa alteração no DNA e remove o grupamento metila causador da mutação. Vale lembrar que cada molécula de CH3 (metil) removida consome uma enzima O-metilguanina-metiltransferase. Ou seja, não existe uma maneira de se reciclar a enzima que catalisa o reparo.
Reparo por excisão de bases: acontece, por exemplo, quando ocorre a desaminação da citosina à uracila. O sistema de reparação, então, reconhece a uracila como base estranha ao DNA, já que ela é característica de RNA. Como esse problema ocorre, geralmente, em apenas uma das fitas de DNA,a célula faz o reparo utilizando a fita não-danificada como molde. Esse processo consiste na transformação da uracila à citosina – voltando à conformação original – e é mediado por um complexo enzimático que possui enzimas como a DNA glicosilase, a AP-endonuclease e, principalmente, a DNA-polimerase.
Reparo por excisão de nucleotídeos (REN) - Ocorre quando a remoção da base defeituosa é feita pela incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão, com liberação dos nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região por ação da DNA-polimerase. Em todos os organismos onde já foi estudado, o processo de REN consiste em cinco etapas:
1. Reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático;
2. Incisão da fita anormal em ambos os lados da lesão a alguma distância desta;
3. Excisão do segmento contendo a lesão;
4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por ação da DNA-polimerase;
5. Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-ligase.
5. Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-ligase.
A extensão média do fragmento de DNA removido é de 12 nucleotídeos, razão pela qual esse modelo é chamado de reparação de regiões curtas. Em caso 
de grandes quantidades de lesões, em que a substituição envolve de 1500 a 9000 nucleotídeos, o modelo é conhecido como reparação de regiões longas. A diferença entre esses dois modelos de reparação é que o primeiro é uma função constitutiva da célula, enquanto o segundo deve ser induzido por lesões no DNA – pelo menos no que diz respeito à célula bacteriana. 
O modelo proposto para o sistema de REN em mamíferos é o seguinte:
1. As proteínas XPB, XPD e XPA estão envolvidas na detecção da lesão, sendo que as duas primeiras percorrem a hélice e a segunda reconhece a lesão;
2. Após encontrar a lesão, o DNA do local do dano é desnaturado e as endonucleases XPF e XPG fazem a dupla incisão na cadeia;
3. O oligonucleotídeo contendo a lesão é removido pelas DNAs-polimerases δ e ε e pelos seus cofatores PCNA e RF-C, que também são responsáveis pelo passo seguinte;
Reparo de bases malpareadas - Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da revisão realizada pela DNA-polimerase durante o processo de replicação. O sistema de correção de erro, que consiste em várias proteínas codificadas pelos genes mut percorre o DNA recentemente sintetizado à procura de pares de base malpareadas e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos. Existe um sinal especifico que permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de seqüências GATC próximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausência de metilação nestas seqüências caracteriza a fita recém-sintetizada.
Reparo por recombinação – No processo de reparação por recombinação, a fita complementar nãodanificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado. Algumas vezes, porém, esse molde não está disponível, por motivos diversos. A DNApolimerase, então, é forçada a passar pela lesão sem replicar aquela região. Uma lacuna com um tamanho considerável é deixada na fita recém-sintetizada. Toda a informação do sítio danificado é perdida e somente pode ser recuperada pela utilização de uma outra molécula idêntica de DNA.
Reparo através do sistema SOS - Uma vez que a célula pode regular a expressão gênica de acordo com sua necessidade, muitas enzimas envolvidas no reparo do DNA são induzidas pelo próprio defeito da molécula de DNA. As enzimas mais importantes desse processo são derivadas dos genes SOS, cuja expressão é induzida por um defeito severo o bastante a ponto de impedir a síntese de DNA. Estes genes dão origem a proteínas de reparo como, por exemplo, endonucleases de excisão, helicases, entre outras.
Reparo por união de extremidades não-homólogas - Quebras nas duas fitas de uma mesma molécula de DNA ocorrem nas células em diversas circunstâncias e constituem uma das principais ameaças à integridade do genoma. Se não forem reparadas, podem causar a morte celular e, em organismos multicelulares, podem causar o câncer. Uma grande variedade de agentes exógenos, incluindo a radiação ionizante e um número considerável de quimioterápicos (como a bleomicina), causam essas quebras, bem como agentes endógenos, a exemplo dos radicais livres. O principal mecanismo de reparação dessas quebras duplas, que ocorre comumente em mamíferos, é chamado de união de extremidades não-homólogas. Neste mecanismo, as extremidades de uma molécula de DNA, apesar de terem perdido alguns nucleotídeos por degradação espontânea, são justapostas para recombinar. O mesmo complexo enzimático realiza o processo de ligação entre as duas extremidades. Desta forma, a seqüência original de DNA acaba sendo alterada.
Reparo por união de extremidades homólogas - O segundo mecanismo reparador de quebras na dupla-fita é a união de extremidades homólogas. O processo é bem mais comum em bactérias e leveduras, e também mais preciso. Por este mecanismo, o cromossomo homólogo àquele lesado faz uma cópia da seqüência de nucleotídeos perdida com quebra da dupla-fita e transfere esta seqüência para o sítio de quebra no cromossomo lesado; este cromossomo lesado, então, tem sua seqüência original restaurada.
Recombinação geral ou recombinação entre homólogos
 Permite que genes sejam rearranjados em diferentes combinações resultando na troca de genes entre cromossomos homólogos pareados durante a meiose. Envolvida em rearranjos de seqüências especificas de DNA que alteram a expressão genica durante o desenvolvimento e diferenciação celular.
A recombinação geral ocorre a quebra e a religação de duas duplas hélices de DNA homologas que geram duas moléculas de DNA que sofreram entrecruzamento (crossed). Na meiose, este processo permite que cada cromossomo contenha uma mistura de genes maternos e paternos. O sítio de troca pode ocorrer em qualquer lugar da sequencia de nucleotídeos homologados das duas moléculas de DNA envolvidas, e lá, uma fita da outra molécula de DNA faz o pareamento de bases com uma das fitas da outra molécula, criando a junção alternativa chamada de heterodúplex, entre as duas diferentes hélices duplas.
A formação das duas regiões homologas é reconhecida no local do crossover através da sinapse de DNA que é um processo no 	qual ocorre a formação de pares de bases entre as fitas complementares das duas moléculas de DNA.
Meiose I Fase: Profase I (sub-fases)Leptóteno – inicia-se a individualização dos cromossomos estabelecendo acondensação (espiralização);
Zigóteno – aproximação dos cromossomos homólogos;
Paquíteno – máximo grau de condensação dos cromossomos. Momento em que ocorre o crosing-over, isto é, troca de segmentos (permutação de genes) entre cromossomos homólogos;
Diplóteno – começo da separação dos homólogos, configurado de regiões quiasmas (ponto de intercessão existente entre os braços entrecruzados, portadores decaracterísticas similares);
Diacinese – com separação definitiva dos homólogos, já com segmentos trocados. 
Prófase I
Recombinação na meiose (1) Duas moléculas de DNA homologas, geralmente oriundas de diferentes cromossomos, se entrecruzam (crossover
Recombinação na meiose (2) O sitio da permuta pode ocorrer em qualquer lugar das seqüência nucleotídeos homologas das duas moléculas participantes.
Recombinação na meiose (3) No local da permuta, a fita de DNA de uma molécula de DNA é pareada a fita da segunda molécula DNA, criando uma junção de heterodúplex.
 Recombinação de meiose (4) Nenhuma sequência de nucleotídeos é alterada no local da troca, normalmente ocorre alguma replicação de DNA, mas os eventos de clivagem e a religação acontecem de modo tão preciso que nenhum nucleotídeo é período ou adicionado.
Estruturas de Holliday
A recombinaçãoé iniciada pela introdução de cortes em posições idênticas nas duas moléculas de DNA parental. As fitas de DNA clivadas sofrem desenrolamento parcial, e cada uma dessas junta a outra molécula por pareamento de bases complementares com fitas entrecruzadas.
Após a formação de junção de Holliday, a junção das fitas entrecruzadas gera moléculas recombinantes.
Pode gerar dois diferentes isômeros: Heteroduplex recombinantes e Heteroduplex não recombinantes. Entretanto, esse modelo não explica como a recombinação é iniciada por cortes simultâneos em ambas as moléculas parentais, na mesma posição.
Enzimas envolvidas na recombinação homologa
 A proteína central RecA: Promove a troca de fitas entre DNAs homólogos, levando a formação de heteroduplex. A RecA é uma pequena proteína que polimeriza sobre o DNA para formar uma estrutura no interior da qual ocorrem as reações de pareamento. As prioridades enzimáticas da RecA mostram por que as regiões de DNA de fita simples ou quebra são necessárias para iniciar recombinação. 
A ação da RecA tem três estágios: 
 RecA se liga ao DNA de fita simples, recobrindo e formando um filamento de proteína com o DNA – RecA ligada ao DNA de fita simples se liga a uma segunda molécula de DNA de fita dupla, formando um complexo entre dois DNAs. – Segue-se um pareamento especifico, por complementariedade de bases, da fita simples de DNA com seu complemento, e forma um heteroduplex.
Proteina RecBCD
Envolvidas no processo de recombinação e também executa diversas atividades. Eles possuem uma potente atividade nucleásica, que degrada DN, uma atividade de helicase, que pode desenrolar um dúplex de DNA na presença de proteínas SSB, além de possuir atividade ATPase. Uma importante característica do complexo RecBCD é que ele inicia o processo de desenrolamento e degradação do DNA somente em uma molécula que contenha uma extremidade livre. A terceira atividade do complexo RecBCD, que acontece enquanto o DNA está sendo desenrolado, é crítica para a ocorrência da recombinação. Ele promove a recombinação com maior frequência em cadeias de DNA que contem o chamado sítio chi (5’ –GCTGGTGG – 3’) no qual durante o desenrolamento do DNA, uma atividade endonucleásica específica de RecBCD cliva uma das fitas do DNA, em uma região próxima ao sítio chi. O reconhecimendo do sítio chi faz com que a subunidade RecD dissocie-se do complexo ou torne-se inativa, fazendo com que o complexo perca sua atividade endonucleásica, mantendo, contudo, suas funções de helicase. Como consequência, é deixada para trás uma região de DNA de fita simples, sobre o qual RecA pode ligar-se e iniciar a troca de fitas com uma sequencia homóloga.
Recombinação em sítios-especifica
Pela sua natureza, o crossing-over geralmente preserva a ordem das seqüências de DNA em cromossomos homólogos. Em casos excepcionais, no entanto, as células também utilizam um elaborado processo recombinacional de regulação, que tem como conseqüência o rearranjo de seqüências através da recombinação direta entre sítios especiais. Segmentos de DNA podem ser movidos pela recombinação sítio-específica, resultando, freqüentemente, na expressão de diferentes genes ou grupos de genes. A recombinação sítio-específica não envolve extensa homologia entre as seqüências de DNA, como ocorre no crossing-over. Ela necessita apenas que as seqüências de ligação sejam localizadas por enzimas especializadas, que catalisam a quebra e a reunião das moléculas. Esse tipo de recombinação é iniciado por processos reguladores que tornam as enzimas corretas disponíveis. Na recombinação sítio-específica conservativa, uma molécula de DNA é clivada em ambas as fitas em dois locais específicos e as extremidades são religadas às suas novas parceiras. O primeiro passo na recombinação sítio-específica é a ligação de proteínas (recombinases) a alguns ou a todos os elementos de reconhecimento de um ou ambos os sítios que irão recombinar. Depois disso, esses sítios fazem uma sinapse (ou troca de fitas). Não é necessária homologia entre as partes recombinantes nessa etapa. A complexidade dos sistemas de recombinação sítio-específica varia muito, e cada sistema tem uma recombinase específica que reconhece as seqüências de DNA. Freqüentemente, a região codificadora dessa recombinase está relacionada com seus sítios de reconhecimento e, algumas vezes, com um elemento reforçador (enhancer) recombinacional.
TRANSPOSONS 
O termo transposon ou elemento genético móvel refere-se a um conjunto de segmentos lineares de DNA, que são capazes de mudar de posição dentro do genoma, independentemente de homologia entre a região genômica onde encontram-se inseridos e o local ao qual se destinam.
Relação entre Transposons e Mutações
Os transposons podem causar mutações quando eles interrompem um gene, por ocasião de sua inserção em um novo sítio do genoma, ou quando eles saem de um local onde estavam inseridos. A inserção de um transposon em um gene pode impedir sua expressão, principalmente se essa ocorre em um gene codificador de uma proteína. A expressão desse gene é normalmente bloqueada.
Se a inserção de um transposon ocorrer nas regiões reguladoras de um gene, essa inserção pode ocasionar mudanças nos locais onde esse gene é normalmente expresso, em diferentes tecidos ou órgãos, ou ela pode afetar o nível de expressão desse gene.
Transposons em procariotos
São conhecidos três principais tipos de elementos de transposição em bactérias.
Retrons: pertencem á classe do retrotransposons, porém, são exclusivos das bactérias e suas transcripase reversa estão envolvidas na síntese de uma classe especial de DNA satélite chamada de DNA multicopia de fita simples.
Sequências de inserção IS: elementos pequenos, que contêm apenas a informação estritamente necessária para promover a sua própria transposição. Elas são destituídas de qualquer informação genética adicional. Embora tenham uma arquitetura comum, com repetições terminais invertidas e pequenas, as sequencias de inserção mostram variações significativas em tamanho, sequencia nucleotídica, distribuição e número de cópias por genoma. A maioria IS insere-se em uma grande variedade de sítios no DNA hospedeiro. Entretanto, algumas mostram preferencia por determinados locais, que podem ser sítios específicos ou regiões genômicas ricas em AT ou GC.
Transposons Tn: constituem um grupo mais complexo, contendo, além das informações necessária para sua mobilização, material genético adicional não relacionado à transposição propriamente dita. Assim , os Tn são maiores dos que as IS e codificam diversas outras enzimas, que podem inativar antibióticos específicos ou, até catalisar o catabolismo de substratos.
Classificação geral dos elementos transponíveis
De modo geral, os Transposons presentes em procariotos e eucariotos podem ser divididos em três classes.
Classe I Retrotransposon: aquelas que se movem via RNA e, para tanto, codificam transcripase reversa, enzima capaz de fazer uma cópia de DNA a partir de uma fita molde. Retrotransposons copiar-se a RNA e depois voltar para DNA que podem integrar volta ao genoma. O segundo passo de formação de DNA pode ser levada a cabo por uma transcriptase inversa, o qual codifica retrotransposões. Retrotransposons, composto por dois subtipos, a repetição terminal longa (LTR), que são subdivididos em dois grupos, Ty1-copia e gypsy-Ty3 , e os retrotransposons, que incluem membros que não possuem LTRs e são subdividos em duas super famílias, denominadas de LINEs e SINEs.
Classe II Transposons: Transposons que se movem via DNA, a respeito dessa classe, é comum encontrarem-se os termos autônomo e não-autônomo referindo-se a membros de uma mesma família, sendo que elementos autônomos representam a forma mais complete do transposon, enquanto a não-autônomo são formas incompletas, geralmente menores, que perderam parte da região codificadora de sua sequencia de DNA.
Classe III – que inclui aqueles elementos para os quais não se conhece, ainda, o mecanismo de transposição.