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Laboratório de Fitopatologia (aula 5) 
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO 
DEPARTAMENTO DE PRODUÇÃO VEGETAL 
FITOPATOLOGIA BÁSICA (DPV 05382) 
 
LABORATÓRIO DE FITOPATOLOGIA (aula 5) 
 
Prof. Celson Rodrigues 
 
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Na grande maioria das vezes, para que se possa identificar com segurança o agente 
etiológico de uma enfermidade, faz-se necessário dispor desse organismo sob forma de 
cultura pura em meio artificial de cultivo. Somente após isso, estudos poderão serem feitos 
sobre sua patogenicidade, anatomia, fisiologia, ecologia, etc., facilitando identificação e 
caracterização 
O isolamento de bactérias fitopatogênicas demanda especiais cuidados da assepsia, pois o 
número de operações envolvidas é grande e bactérias saprófitas acham-se quase sempre 
presentes, associadas ao tecido enfermo, principalmente nas lesões mais velhas. 
Outro aspecto a considerar é a importância de se praticarem as operações que envolvem o 
isolamento de modo a dominar com eficiência todos os passos. Somente a execução das 
operações por repetidas vezes levam à familiaridade e à possibilidade de sucesso. 
De um órgão vegetal infectado, deve-se tentar o isolamento a partir dos bordos da lesão, 
onde a chance é menor de existirem microrganismos saprófitas e oportunistas e onde 
espera-se estar a fitobactéria fisiologicamente mais ativa. A metodologia padrão de 
isolamento, uma operação essencialmente realizada com absoluta assepsia, pressupõe que 
no interior do tecido existem somente as fitobactérias e que no exterior estariam também 
saprófitas, tanto fungos como bactérias. Casos de duas ou mais fitobactérias infectando o 
mesmo tecido não são comuns, assim como não o são fitobactérias e saprófitas vivendo 
lado a lado, no mesmo nicho ecológico, a não ser nos estágios finais da infecção quando o 
tecido entra em colapso e organismos secundários não patogênicos começam a se 
desenvolver. 
 
2. MEIO DE CULTURA RECOMENDADOS PARA O ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS 
 
Em princípio, a maioria dos meios de cultura rotineiramente empregados num laboratório de 
Fitopatologia presta-se ao isolamento, desde que o pH esteja em torno de 7,0, contenham 
uma fonte orgânica de carbono, não contenham antibióticos e que em sua composição 
figurem ingredientes mínimos para suportar o crescimento de um procariota 
quimioeterotrófico. 
Contudo, existem meios tradicionalmente utilizados para o cultivo de fitobactérias e que 
proporcionam melhores condições nutricionais e, conseqüentemente, crescimento mais 
rápido. Esses meios devem ter seu pH ajustado para 7,0 a 7,2 e, em seguida devem ser 
autoclavados por 20 minutos a 121°C. 
Caso se queira prevenir o crescimento de fungos saprófitas, pode-se adicionar, como 
inibidor de microrganismos eucariotas, o anti-fúngico cicloheximida a 50 ppm (concentração 
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final no meio). Deve-se preparar uma solução estoque de cicloheximida, esterilizá-la por 
filtração e mantê-la em geladeira, ao abrigo da luz. Sua incorporação ao meio fundente deve 
ocorrer imediatamente antes do preparo das placas. Para isto o meio de cultura, após 
fundido por fervura em banho-maria ou em forno de microondas, deve ter sua temperatura 
mantida em torno de 48-50°C. Se mais frio, pode sol idificar-se no momento de ser vertido. 
Se mais quente, pode ocasionar condensação de vapor d’água na tampa da placa, o que 
dificulta a visualização da superfície do meio. Um modo empírico de se verificar se a 
temperatura está ideal é colocar o recipiente contendo o meio fundido em contato direto com 
a pálpebra ocular ou com a face inferior do antebraço - se o calor estiver suportável, pode-se 
verter o meio. 
 
Um dos meios mais utilizados para isolamentos de rotina de bactérias fitopatogênicas é o 
“meio 523” (Kado & Heskett, 1970), cuja composição é a que se segue: 
• Sacarose (10,0 g) 
• Caseína ácida hidrolisada (8,0 g) 
• Extrato de levedura (4,0 g) 
• K2HPO4 (anidro) (2,0 g) 
• MgSO4.7H2O (0,3 g) 
• Agar (15,0 g) 
• Água destilada (1000 mL) 
 
O meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar), preparado em aula prática anterior, também 
é um meio de cultura considerado padrão para o isolamento de bactérias e fungos 
fitopatogênicos em laboratórios de Fitopatologia e será o meio utilizado na presente aula. 
 
 
3. ISOLAMENTO DIRETO A PARTIR DE ÓRGÃOS VEGETAIS VOLUMOSOS 
 
Tentativas de isolamento direto de bactérias fitopatogênicas, por prospecção de tecidos mais 
internos do órgão, dispensando-se a fase de esterilização superficial do fragmento de tecido 
infectado, podem culminar em sucesso, com grande economia de tempo e material. Esse 
tipo de isolamento direto é aplicável para órgãos vegetais volumosos como porções 
relativamente espessas de caules, tubérculos, rizomas, bulbos, frutos e, eventualmente, 
sementes não muito pequenas. Bactérias que tipicamente colonizam o sistema vascular de 
caules, como Ralstonia solanacearum em tomate ou batata, são também isolados com 
sucesso por esse método. 
Pelas características peculiares da metodologia a ser executada, toda ênfase deve ser dada 
à esterilização superficial do órgão e, ou, fragmento de órgão, antes de ter início à operação 
de isolamento. 
 
3.1. Obtenção e maceração dos fragmentos do tecido vegetal doente 
a) O órgão vegetal deve ser exaustivamente lavado com água e detergente, devidamente 
enxaguado e, em seguida, secado com papel toalha ou similar. A seguir, deve ser 
mergulhado em álcool absoluto e flambado duas a três vezes. 
 
b) Com escalpelo flambado, faz-se uma incisão não profunda no órgão. Essa incisão servirá 
como uma cunha ou linha de fraqueza a ser usada para cindir o órgão no plano desejado. 
Feita a incisão, parte-se o órgão, expondo seu interior. 
 
c) De um local longe da periferia e também do local onde a incisão foi feita, que não foi 
tocado e que apresente sintomas ou alterações de cor, rigidez e ou consistência, retiram-
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se com escalpelo flambado e resfriado, pequenos fragmentos de tecido putativamente 
infectado que são assepticamente macerados em uma gota de água estéril. 
 
d) Observa-se que nesse caso, as operações de desinfecção superficial e lavagem em água 
 estéril dos fragmentos são dispensadas. 
 
3.2. Semeio do macerado pelo método de estrias ou riscas 
 
a) Com alça de repicagem flambada, retirar uma gota da suspensão e depositar o excesso 
em uma pequena área, próxima aos bordos da placa. 
 
b) Sem flambar a alça, traçar três a 4 riscas paralelas espaçadas de 0,5 cm, sendo a 
primeira distanciada do local onde foi feito o depósito de, aproximadamente, 1 cm. Essas 
riscas não devem ultrapassar o meio da placa. 
 
c) Flambar a alça. Depois de fria, fazer outras três a quatro riscas paralelas, em ângulo reto 
com as primeiras, partindo da primeira risca da primeira série. 
 
d) Observando os mesmos princípios, traçar outras 3 - 4 riscas paralelas em ângulo reto 
com as da segunda série. 
 
e) Repetir a operação, traçando riscas paralelas em ângulo reto com as da terceira série. 
 
f) Etiquetar as placas, invertê-las e incubá-las a 25-30°C. 
 
g) Cerca de 24 a 48 horas após o semeio, repicar colônias bem isoladas para os tubos de 
cultura com o meio inclinado. Colônias que surgem com 24 horas ou menos são, 
geralmente, de bactérias saprófitas. 
 
h) Cuidados especiais devem ser tomados para não se ferir a superfície do meio quando as 
 riscas ou estrias são feitas. 
 
 
4. ISOLAMENTO INDIRETO A PARTIR DE TECIDOS INFECTADOS (PADRÃO) 
 
4.1. Corte, tratamento dos fragmentos vegetais doentes 
 
a) Lavar e enxugar cuidadosamente o órgão vegetal de onde se tencionarealizar o 
isolamento. Se se tratar de caule, fruto ou outro órgão volumoso, mergulhá-lo em álcool 
absoluto e flambá-lo. Repitir a operação por 1 ou 2 vezes. 
 
b) Com escalpelo ou lâmina de barbear, remover parte do tecido afetado (preferencialmente 
dos bordos das lesões mais recentes), de modo a obter pequenos fragmentos, não 
maiores que 0,5cm x 0,5 cm. 
 
c) Expor os fragmentos de tecido enfermo a álcool a 70% (20 - 30 segundos). 
 
d) Com pinça flambada, transferir os fragmentos para solução a 2% de NaClO por 1 a 5 
 minutos. O tempo de desinfecção varia de acordo com a consistência e espessura do 
 material. 
 
e) A lavagem com água destilada esterilizada dos fragmentos por, pelo menos, três vezes se 
faz necessária, para retirar o excesso de desinfectante. 
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f) Por meio de pipeta, depositar, no fundo de uma placa de Petri estéril, uma gota grande de 
 água destilada esterilizada. Transferir, para essa gota, 3 a 4 fragmentos já esterilizados. 
 
g) Com pinça, estilete ou escalpelo flambados, macerar os fragmentos de tecido dentro da 
 gota, de modo a obter a suspensão. Deixar em repouso por 20 a 30 minutos para que 
haja a difusão das bactérias do interior do tecido enfermo para o seio da gota. 
 
4.2. Semeio do macerado pelo método de estrias ou riscas (descrito anteriormente no 
item 3.2.) 
 
 
4.3. Semeio pelo método de diluição em placas 
 
a) Com uma pipeta estéril, depositar uma gota de água destilada esterilizada no centro de 
três placas de Petri, numerando-as de 1 a 3. 
 
b) Transferir, com alça de repicagem uma gota da suspensão bacteriana obtida do 
macerado, para a gota de água estéril da placa nº 1. Misturar bem com a alça e transferir 
uma gota dessa nova suspensão para a gota da placa nº 2. Repetir a operação para a 
placa nº 3 e, assim sucessivamente, caso se deseje maior diluição. 
 
c) Fundir o meio de cultura. Deixá-lo esfriar até 48 – 50°C. Verter o meio nas placas e, em 
seguida, com o fundo da placa tocando o tampo da superfície de trabalho, fazer 
movimentos suaves, rotatórios, de modo que a suspensão de bactérias se distribua bem 
no meio e a ele se incorpore. 
 
d) Etiquetar e incubar conforme descrito anteriormente. 
 
 
4.4. Semeio pela utilização de espátula ou alça de Drigalsky 
 
a) Proceder à diluição do macerado em solução salina (NaCl a 0,85%) estéril ou em PBS 
 (solução salina em tampão de fosfato 0,1 M, pH = 7,0) também estéril. 
 
b) Para isso, preparar tubos com 2 mL do diluente e esterilizá-los em autoclave. Com pipeta 
 esterilizada, transferir 0,5 mL da suspensão para o 1º.tubo e agitar. Retirar 0,5 ml desse 
tubo e transferir para o segundo. Proceder assim sucessivamente (diluição 1:5). Pode-se 
optar por diluições maiores, se necessário. 
 
c) Com outra pipeta estéril, começando da maior diluição para as menores, retirar 0,1 ml e 
 depositar na superfície do meio em placa de Petri (pelo menos 1 placa para cada 
diluição). 
 
d) Com espátula de Drigalsky flambada em álcool várias vezes e resfriada, espalhar 
 a suspensão bacteriana sobre a superfície do meio, sem feri-lo. 
 
e) Incubar conforme indicado, após etiquetar ou identificar as placas. Procurar por colônias 
 individualizadas em placas correspondentes às diluições maiores. 
 
 
5. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 
 
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Laboratório de Fitopatologia (aula 5) 
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AGRIOS, G.N. Introduction. In: AGRIOS, G.N. Plant pathology. 5 ed. San Diego: Elsevier 
Academic Press, 2005. 
 
ALFENAS, A.C.; MAFIA, R.G. (edt). Métodos em fitopatologia. Viçosa: Ed. UFV, 2007. 
 
FERREIRA, L.P.; SALGADO, C.L. Bactérias. In: BERGAMIN FILHO, A.; KIMATI, H.; 
AMORIM, L. (Eds.). Manual de fitopatologia: princípios e conceitos. 3. ed. São Paulo: 
Agronômica Ceres, 1995. v.1, p.97-131. 
 
ROMEIRO, R.S. Fundamentos de bacteriologia de plantas. Viçosa: Universidade Federal de 
Viçosa, 1996. 50p. 
 
ROMEIRO, R.S. Bactérias fitopatogênicas. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 1995. 
283p.