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ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS
Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos,
algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar as propriedades de
um determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo em
cultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde
todas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célula
parental).
CULTIVO DE CULTURAS PURAS
9 MEIOS DE CULTURA
 Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem ser
supridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura de
células, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema
artificial, denominado meio de cultura.
 Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos
diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório
com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos
de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidos
são úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de
provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de
espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de
algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas
colônias.
Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são
utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de
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tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são
fornecidos elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas
ou fórmulas iônicas simples. Nesses meios somente são encontrados uma única fonte de
carbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos), de fósforo,
etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou ácidos nucléicos.
Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informações
especiais sobre os microrganismos:
9 Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento de
determinados microrganismos em detrimento de outros, que também se
encontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporação
de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção.
Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N.
meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina,
nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –
seletivos para Streptococcus mutans.
9 Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva
de espécies de microrganismos que porventura estejam colonizando um
mesmo ecossistema. Esses meios, via de regra, permitem a obtenção de
colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia, coloração,
etc), de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e
indicadores incorporados ao meio. Ex.: ágar-sangue (Porphyromonas e
Prevotellas).
9 Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos empregados
para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes e que
encontram-se particularmente presentes em pequeno número numa amostra
que inclui grande número de outros da microbiota normal.
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9 Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na coleta e
manutenção de bactérias anaeróbias, onde são adicionadas substâncias
redutoras (ácido ascórbico 0,1%, cisteína 0,1%, tioglicolato de sódio 0,1%)
que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de
metileno, resazurina).
9 Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das bactérias.
Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. Ex.: Brain Heart
Infusion Agar – BHI agar.
9 Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma mistura
simples contendo glicose, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e
alguns minerais. Em geral esses meios têm uma concentração maior de
açúcar (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6) que o meio para cultivo bacteriano
(pH 6,5 a 7,5). Ex.: Sabouraud Agar.
FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO
9 A origem do material a ser analisado
9 A espécie que se imagina estar presente na amostra
9 As necessidades nutricionais dos organismos.
MÉTODOS DE CULTIVO
Inoculação
Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura), obtido de uma
suspensão original da amostra, é colocado dentro ou sobre um meio geleificado (ágar),
as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia
isolada. Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas, com ancestral
único, visível a olho nu.
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9 Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de
semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio.
9 Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhad ie
do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky).
9 Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágar
fundido a 45°C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o ágar se
solidifica, as células são nele imobilizadas e crescem, formando colônias.
Se a suspensão de células que será inoculada foi previa a, as
colônias formadas estarão bem separadas, com alta probabilidade d
uma única célula. Mas para se ter certeza disso é necessário repicar u
desejado, suspendê-la em solução apropriada e replaqueá-la. Este pro
ser repetido quantas vezes for necessário, o que irá assegurar a obtenç
pura.
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Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com extinção. A
suspensão original da amostra é diluída seriadamente e semeiam-se amostras de cada
diluição. Se apenas algumas amostras de uma diluição particular exibirem crescimento,
presume-se que essas culturas se originaram a partir de células isoladas. Este método é
utilizado somente quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deve
ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma
população mista.
MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS
Por vezes, é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano em
meios artificiais, assim como este ocorre em ambiente natural. Para contornar este
problema reproduz-se em laboratório as condições ideais para o crescimento do
microrganismo que se deseja isolar, tais como:
9 diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo
microrganismo
9 temperatura de incubação
9 aeração
9 pH
 Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em uma
amostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em
tantos meios e condições de incubação diferentes quantos sejam necessários para se
obter o crescimento da maioria das espécies presentes na amostra.
Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma
população mista, alguns recursos podem ser empregados de acordo com as
características do microrganismo desejado, tais como meios diferenciais, meios
seletivos, meios enriquecidos, o aquecimento do material, ação de álcalis ou ácidos
fortes, e inoculação em animal sensível.
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ISOLAMENTO DE AERÓBIOS
Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. Após a
semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes são mantidos em estufa a
37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. Existem grupos de microrganismos,
como a Neisseria gonorrohoeae, que necessitam níveis elevadosde dióxido de carbono
(CO2), neste caso pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. Após semeados, os
meio são colocados dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é então
fechada hermeticamente. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de
oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10%.
ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOS
Durante a preparação dos meios, estes são fervidos para que a maior parte do
oxigênio dissolvido seja retirada. O gás nitrogênio livre de oxigênio é colocado nos
tubos contendo o meio, e então um agente redutor deve ser adicionado (normalmente
cisteína), o qual remove os últimos traços de oxigênio. Os meio são esterilizados em
autoclave na completa ausência de oxigênio.
¾ Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é realizada
dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da câmara.
A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio, dióxido de
carbono e nitrogênio. O material é introduzido ou removido da câmara por
meio de um sistema fechado para o ar. Qualquer resíduo de oxigênio na
câmara é removido pela reação com o hidrogênio, na presença do catalisador
paládio.
¾ Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra
juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram
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hidrogênio e dióxido de carbono. Este sistema é inadeqüado para o cultivo de
anaeróbios estritos.
¾ Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna
alta, crescendo no fundo do tubo de ensaio.
Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos, que são meios de cultura
com a adição de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sódio), que são capazes de
absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2.
MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA
Existe uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano. Os
dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células -
UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL – ex.: Contagem celular
microscópica ou eletrônica, contagem em placa ou através de membrana filtrante e
aqueles que medem o peso celular ou ainda através da estimativa de unidades de
absorbância da massa de células em caldo ou outras suspensões (turbidez).
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Através das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os
microrganismos, que podem variar desde uma microscopia relativamente simples à
análise do material genético encontrado na célula, procura-se enquadrar o
microrganismo numa espécie. Uma coleção de dados é utilizada para caracterizar
espécies diferentes:
9 Características Culturais
O primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a observação da
natureza do meio em que o organismo está crescendo.
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O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma,
dimensões, estrutura, brilho, etc) irá possibilitar uma identificação preliminar, mas não
definitiva do organismo estudado, já que muitas espécies podem produzir colônias que
não diferem entre si. (ex.: algumas colônias de E. coli são indistingüíveis das de
Shigella quando cultivadas em ágar- Hektoen).
Morfologia Colonial
9 Características Morfológicas
Os microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico utilizando-se
preparações fixadas e coradas. Preparações a fresco (em gota pendente ou preparações
entre lâmina e lamínula), são úteis quando a estrutura do microrganismo pode ser
distorcida pelo calor ou agentes químicos utilizados na preparação do material seco e
corado, podendo ser utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmente
ou para observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados.
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As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dos
microrganismos (flagelos, membranas, cápsulas), identificar suas estruturas internas e
ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As colorações podem ser feitas
com um ou mais corantes.
Coloração simples: realizada com uma única solução corante. As células
coram-se uniformemente com esta técnica. (ex.: Violeta de genciana)
Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. Evidencia
diferenças entre as células microbianas ou parte das células. (ex.: Coloração de Gram,
Coloração de Zihel-Nielsen)
Coloração de Gram
O microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido de
colônias isoladas para obter, através de observação ao microscópio óptico, maiores
informações sobre a morfologia celular. A maioria das bactérias pode ser dividida em
dois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram:
• Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro
• Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho
Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das
paredes celulares das bactérias.
Microscopia Óptica
Os microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de
1000x o tamanho original do espécime. Com algumas modificações, incluindo oculares
de alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar a
aproximadamente 2000x. A imagem formada pelas objetivas é também ampliada pelas
lentes oculares. Assim, a combinação do sistema de lentes da objetiva e o sistema de
lentes oculares produz a ampliação. Existem diversos tipos de microscópio de luz:
Microscópio de campo claro, de campo escuro, de fluorescência, de contraste de fase.
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O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de
200.000 – 400.000x o tamanho original do espécime, devido ao alto poder de resolução
proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons utilizados,
em vez da luz. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra estruturas das
células microbianas.
Existem avanços mais recentes na microscopia, como aquelas que utilizam
computadores, outras fontes de iluminação, ou novas técnicas de coloração
9 Características Metabólicas
Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade metabólica
(metabolismo oxidativo, metabolismo fermentativo, catabolismo protéico) de um
organismo. O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitas
vezes essencial para sua identificação
9 Características Fisiológicas
 Condições físicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o pH, a
luminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo também
fornecem parâmetros para a identificação. Por exemplo, os microrganismos do corpo
humano crescem a 35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C.
9 Características Antigênicas
Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que podem
agir como antígeno e induzir, desta forma, a produção de anticorpos. Os anticorpos
produzidos em animais de laboratório podem ser usados para detectar a presença de
antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar microrganismos.
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9 Características patogênicas
A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal, plantas ou
micróbios), com a finalidade de reproduzir a doença, poderá determinar se este é ou não
um patógeno.
9 Características genéticas
Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitem
realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou
compreender a sua atividade, através de métodos mais sensíveis e precisos.
CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS
Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método de
conservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com o objetivo do
estudo a ser realizado.
Conservação por um curto período (dias a meses):
9 Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C)
9 Repiques freqüentesConservação por longos períodos:
9 Nitrogênio líquido a -196°C
9 Freezers a -70°C/ -120°C
9 Liofilização – congelamento a seco - as amostras são congeladas,
desidratadas e fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das culturas
por muitos anos. Esta técnica permite a obtenção de uma coleção de
microrganismos como referência, por exemplo.
Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada a
atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em particular:
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CULTIVO DE VÍRUS
Para isolar vírus em laboratório, é necessário fornecer células hospedeiras vivas,
já que são parasitas intracelulares estritos.
Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados em
cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado
em placa.
Vírus animais:
9 Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado, devido ao alto custo. Alguns
vírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente em
animais vivos. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos,
coelhos e cobaias. São utilizados em estudo sobre a resposta imune do
hospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus é
capaz de causar uma infecção.
9 Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos embrionados
(embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente com vírus,
utilizando-se uma agulha e seringa, por meio de um orifício aberto na casca.
A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por 2 a 3
dias para permitir a multiplicação dos vírus. Diferentes tecidos do embrião
são inoculados, dependendo do tipo de vírus.
9 Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células, esta pode ser
utilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus. Podem ser
utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem contínua.
Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus invadem as
células, geralmente causando algum tipo de alteração visível. O ECP pode ter diferentes
aspectos, dependendo do vírus e do tipo de células na cultura. Um tipo de ECP é o
corpúsculo de inclusão, que é uma estrutura intracelular anormal. Sua presença pode
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ajudar a identificar o vírus que esteja causando uma infecção, por exemplo, os
corpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o vírus da
varíola.
Vírus de Plantas
Podem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas por
meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas folhas da planta.
QUESTIONÁRIO
1. Defina o termo “cultura pura”.
2. Descreva as principais características dos microrganismos usadas na
identificação das espécies.
3. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio.
4. Quais as técnicas para conservação de culturas?
5. Explique a finalidade dos principais meios de cultura.
BIBLIOGRAFIA
Baron, E.J., Peterson, L.R., Finegold, S.M. Methods for identification of
etiological agents of infectious disease. In: Bailey & Scott’s Diagnostic
Microbiology. 9. ed. St. Louis: Mosby, 1994. Cap. 4. p. 474-504.
Bier, O. Métodos gerais de estudo das bactérias. In: Microbiologia e
Imunologia. 23. ed. São Paulo: Melhoramentos, 1984. Cap. 25, p.477-499.
Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. & Krieg, N.R. Caracterização dos
Microrganismos. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2.ed. vol.1. São
Paulo: Mc Graw Hill do Brasil. 1996. Cap.3. p. 75-99.