10_Biotecnologia_e_acidos_nucleicos

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Técnicas e Técnicas e 
Biotecnologia Biotecnologia 
de Ácidos de Ácidos 
NucléicosNucléicos
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Separação e DetecçãoSeparação e Detecção
� Em 1997
� Uma ovelha foi clonada por cientistas escoceses
� Dois macacos rhesus por pesquisadores de Oregon
� Nesse capítulo, será tratado alguns dos métodos 
mais importantes usados na biotecnologia
� Técnicas de separação
� A carga elétrica e o tamanho são duas propriedades 
das moléculas que constituem a base dos processos 
de separação. A eletroforese em gel faz uso dessas 
propriedades
� A poliacrilamida é utilizada para fragmentos menores
� Agarose é utilizada para fragmentos maiores
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Separação e DetecçãoSeparação e Detecção
� Amostras são aplicadas ao gel em posição vertical
� Devido a presença de seus grupos fosfatos, os 
polinucleotídios são carregados negativamente em pH 
neutro
� Quando uma corrente elétrica é aplicada, os 
polinucleotídios carregados negativamente migram na 
direção do pólo positivo
� A razão da carga para a massa permanece 
aproximadamente a mesma, a despeito do tamanho da 
molécula de polinucleotídio
� A separação dos polinucleotídios acontece 
primordialmente em função do tamanho da molécula, 
determinado pela “peneira molecular” imposta pelo gel
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Separação e DetecçãoSeparação e Detecção
� Auto-radiografia
� Baseado na detecção de 32P ou 35S
� Após a separação dos polinucleotídios marcados, o gel 
é colocado em contato com um de filme de raio X
� Após a revelação, a posição dos compostos marcados 
aparece como bandas escuras
� Luminescência
� Por um composto ligado aos fragmentos como um 
rótulo
� Usado para detectar níveis em nanomoles
� Para o DNA, são utilizados quatro tipos de compostos 
fluorescentes, um para cada tipo de base
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Separação e DetecçãoSeparação e Detecção
� O gel com os produtos após a separação é irradiado 
com uma luz laser que é capaz de ser absorvida pelos 
quatro compostos fluorescentes que marcam as 
diferentes bases
� Cada um desses compostos reemite luz em um 
comprimento de onda próprio, mais longo, o que 
caracteriza o fenômeno de fluorescência
� Quimioluminescência
� Depende da emissão de luz como resultado de uma 
reação química
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NucleasesNucleases
� Nuclease
� Uma enzima que catalisa a hidrólise dos esqueletos 
fosfodiéster dos ácidos nucléicos
� Endonuclease de restrição
� Uma enzima que cliva o DNA em sítios específicos
� Isolada principalmente das bactérias
� Cerca de 1000 endonucleases de restrição foram 
isoladas e suas especificidades determinadas
� As seqüências reconhecidas por endunucleases de 
restrição – seus sítios de ação – serão as mesmas se 
lidas da esquerda para direita, ou da direita para a 
esquerda (fita complementar)
� As seqüências reconhecidas são palindromos
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Restriction
endonuclease
Recognition and 
cleavage site
Bam HI
Eco RI
Not I
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'
5'-GCGGCCGC-3'
3'-CGCCGGCG-5'
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DNA DNA RecombinanteRecombinante
� DNA Recombinante: as moléculas de DNA que 
contêm segmentos ligados covalentemente, 
derivados de duas ou mais fontes de DNA
� A produção de DNA recombinante requer corte e 
emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito 
específicas
� O corte é realizado com endonucleases de restrição
� A emenda dos segmentos é feito por enzimas 
chamadas DNA ligases
� Extremidades adesivas
� Eco RI reconhece e causa hidrólise da lponte
fosfodiéster no fita de DNA entre os pares de bases G e 
A
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DNA DNA RecombinanteRecombinante
Eco RI cleavage5'-G-A-A-T-T-C-3'
3'-C-T-T-A-A-G-5'
5'-G 5'-A-A-T-T-C-3'
G-5'3'-C-T-T-A-A-5'
staggered cleavage 
gives fragments 
with protruding 
5' ends
If a ligase reseals sticky ends from 
a DNA of different origin, what 
results is a recombinant DNA
sticky ends from
original DNA
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DNA DNA RecombinanteRecombinante
� Quando dois tipos diferentes de DNA são combinados 
em laboratório, um dos DNAs é normalmente um 
plasmídeo
�� PlasmídeoPlasmídeo: uma molécula circular de DNA que não faz 
parte do DNA principal do cromossomo circular da 
bactéria
� Fitas de E. coli de várias fontes tem plasmídeos
diferentes
� Plasmídeos da E. coli capazes de se auto-perpetuar são 
fundamentais na tecnologia do DNA recombinante
� O processo de produção de cópias idênticas de um 
DNA é chamado de clonagemclonagem
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Engenharia GenéticaEngenharia Genética
� De certo modo, a engenharia genética de organismos 
já era praticada pelo homem desde que se inciaram
os cruzamentos seletivos entre as plantas e animais
� As alterações seletivas de organismos, para 
propósitos agronômicos ou médicos, beneficiou-se 
grandemente com a metodologia do DNA 
recombinante
� Na agricultura, genes para maior produtividade, 
resistência ao congelamento e a pestes foram 
introduzidas em morangos, tomates e milho
� Em humanos, as pesquisas buscam formas de terapia 
gênica para alterar células para aliviar os sintomas da 
doença
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ClonagemClonagem
�� CloneClone: uma população geneticamente idêntica
� Pode ser de organismos, de células, de vírus ou moléculas 
de DNA
� O uso de endonucleases de restrição e de DNA ligases
produz relativamente poucas moléculas de um dado DNA 
recombinate
� É necessário que as amostras de DNA existam (1) em 
quantidades razoáveis e (2) em estado puro para realizar a 
clonagem
� Clonagem de bacteriófagos (vírus que infectam as 
bactérias)
� Examina-se o vírus de DNA que contém DNA de fita dupla
� Um “tapete” (lawn) de bactérias, cobrindo a superfície de uma 
placa de Petri, é infectado com o fago
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ClonagemClonagem
� Cada vírus infecta uma célula bacteriana e reproduz-se
� Cada descendente seu repete o ciclo, infectando e 
destruindo outras células
� À medida que o vírus se multiplica, uma mancha clara, 
chamada “placa de lise” (plaqueplaque), aparece na placa de 
Petri, marcando a área em que as çélulas bacterianas 
foram destruídas
� A placa consiste da progênie do primeiro vírus, clones 
do vírus original
� Para clonar-se células individuais, um pequeno número 
de células é semeado em finas camadas, em um meio 
de cultura adequado em uma placa
� Cada colônia de células que aparecer na placa será, 
então, um clone derivado de uma única célula
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ClonagemClonagem
� Produção de DNA recombinante com fago vetor
� Bactérias e bacteriófagos podem crescer em grande 
quantidade em pequenos intervalos de tempo em 
condições laboratoriais
� Por exemplo, se quisermos clonar uma porção de DNA 
humano em um vírus
� Trata-se o DNA humano e o DNA viral com a mesma 
endonuclease de restrição, que são então misturados, 
para permitir que as extremidades adesivas possam 
anelar-se
� Trata-se, então, a mistura com uma DNA ligase
� Para cloná-lo, incorporamos o DNA quimérico em 
partículas virais, o que se faz adicionando a proteína do 
capsídeo viral, para permitir que o vírus se monte em 
partículas
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ClonagemClonagem
� As partículas virais são distribuídas sobre um tapete de 
bactérias, e os segmentos clonados em cada placa de lise 
são identificados
� O bacteriófagofoi o vetorvetor, o carreador do DNA 
recombinante
� Plasmídeos bacterianos
� Se replica independentemente do genoma bacteriano 
principal e pode ser transferido de uma cepa de uma 
espécie de bactérias para uma outra por meio de contatos 
célula-célula
� O gene exógeno pode ser inserido no plasmídio pela 
ação sucessiva de uma endoonuclease de restrição e da 
DNA ligase
� Um exemplo é a inserção do gene para o hormônio de 
crescimento humano em bactérias
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Engenharia genéticaEngenharia genética
� Com o advento da tecnologia do DNA recombinante
� É possível (dentro de certos limites) fazer-se alterações 
específicas nos genes
� Até mesmo em seqüências específicas do DNA dentro de 
um gene
� Com essas alterações, é possível modificar as 
características herdáveis de um organismo 
� Bactérias podem ser alteradas para produzir grandes 
quantidades de proteínas de importância médica
� Animais podem ser tratados para curarem-se ou para 
amenizar suas doenças genéticas
� Plantas agronomicamente importantes podem tornar-se 
mais produtivas ou apresentar resistência aumentada 
contra pragas
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Bactérias como “Fabricas de Bactérias como “Fabricas de 
Proteínas”Proteínas”
� Exemplo: engenharia genética para insulina humana
� O gene da insulina contém exons que aparecem no mRNA
maduro e um intron que deve ser eliminado no processo 
de edição do mRNA que comandará a síntese direta da 
insulina
� As bactérias não possuem a maquinaria celular para a 
remoção dos introns dos transcritos de RNA
� A solução é usar dois DNAs sintéticos, um para codificar 
a cadeia A, outro para a cadeia B
� Esses DNAs sintéticos são produzidos em laboratório 
pelo uso de métodos que desenvolvidos por meio da 
síntese orgânica e inseridos em um plasmídeo vetor 
separado
� As cadeias A e B produzidas, são extraídas e misturadas, 
produzindo, por fim, a insulina 
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Engenharia genéticaEngenharia genética
� As plantas e animais são organismos multicelulares e 
apresentam diferentes tipos de tecidos
�� Mudança somáticaMudança somática: alteração de um gene afetando apenas 
os tecidos diferenciados do organismo alterado
�� Alterações germinativasAlterações germinativas: alterações nas células 
germinativas (óvulos e espermatozóides) são transmitidas 
para as gerações seguintes
� Um exemplo de terapia gênica
� O tratamento de imunodeficiência associada grave (SCID), 
ou a “síndrome do menino bolha”
� O objetivo final é introduzir nelas o gene para a adenosina 
desaminase, usando um vírus como vetor, e, depois, 
reintroduzir as células no organismo dos doentes
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Engenharia genéticaEngenharia genética
� Adenosina desaminase participa do catabolismo das 
purinas
� Quando essa enzima está ausente, o dATP acumula-se 
nos tecidos, inibindo a ação de outra enzima, a 
ribocucleotídio redutase
� O resultado disso é uma deficiência nos outros três 
desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs) 
� Esse desequilíbrio afeta particularmente a síntese de 
DNA em linfócitos, dos quais depende uma parte 
importante da resposta imune
� Indivíduos afetados com SCID são muito susceptíveis a 
infecções em função de seus sistemas imunes 
comprometidos
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Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos
�� Organismos Organismos transgênicostransgênicos: organismos que 
carregam genes herdáveis introduzidos por 
engenharia genética
� Em mamíferos, como nos camundongos
� O método envolve microinjeção do DNA contendo o 
gene desejado no núcleo de um ovo fertilizado
� O DNA injetado integra-se ao genoma
� Os ovos tratados dessa maneira são implantados em 
uma mãe de aluguel para desenvolverem-se
� Quando os camundongos nascem, amostras de DNA 
são retiradas de suas caudas para verificar-se a 
presença de DNA incorporado
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Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos
� Nas plantas
� Um vetor amplamente utilizado é baseado no 
plasmídio de uma bactéria causadora de “galhas de 
coroa”, a Agrobacterium tumefaciens
� As células dessa bactéria ligam-se a ferimentos nos 
tecidos de uma planta, transferindo plamídios para as 
células vegetais
� Parte do DNA plasmidial insere-se no DNA da planta, 
constituindo-se, assim, no único exemplo conhecido de 
transferência natural de genes de um plasmídio
bacteriano para um genoma eucarioto
� A expressão dos genes do plasmídio na planta dá 
origem a um tumor chamado galha da coroa
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Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos
� Plantas inteiras e saudáveis podem desenvolver-se a 
partir de células da galha, apesar de serem células 
germinativas
� As plantas que crescem a partir de galhas podem 
produzir sementes férteis
� Genes de qualquer fonte podem ser incorporados ao 
plasmídio do A. tumefaciens e ser, assim, transferidos 
para uma planta
� Esse método foi usado para alterar geneticamente 
plantas de tomate que são mais resistentes à 
desfoliação por lagartas
� Um gene que codifica uma proteína tóxica para as 
lagartas foi obtido da bactéria Bacillus thuringensis
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� Uma vez que existem métodos que permitem:
� Selecionar certas regiões do DNA do genoma
� Clonar essas regiões de DNA em vetores adequados
� A questão que surge é
� É possível tomar-se todo o DNA de um organismo (o 
genoma total) e cloná-lo em quantidades razoáveis?
� A resposta é sim, e o resultado é uma Biblioteca de Biblioteca de 
DNADNA
� Desafio – para construir uma biblioteca do genoma 
humano
� Existem 6 bilhões de pares de base em uma célula 
humana diplóide (conjunto de cromossomos de cada 
um dos pais
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� Se considerarmos que 20,000 pares de bases é um 
tamanho razoável para um inserto clonado, seria 
necessário um mínimo de 300,000 diferentes tipos de 
DNAs recombinantes para cobrir todo o genoma
� Na prática, precisaríamos de várias vezes esse mínimo 
para garantir uma representação abrangente, etc.
� Nesse exemplo, utilizaremos um plasmídio bacteriano 
como vetor para construir um número adequado de 
moléculas de DNA recombinate
� A primeira etapa é a separação por clonagem de 
membros individuais da população de moléculas de 
DNA plasmidial
� Um modo de simplificar esse processo, é aproveitar o 
fato de que os plasmídios bacterianos mais usados 
carregam genes para resistência a certos antibióticos 
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� No nosso exemplo, o plasmídio possui um gene para 
resistência à ampicilina e um gene para uma enzima (bb -
galactosidase), que transforma um derivado incolor de 
galactose em um produto de cor azul
� O sítio de clivagem pela enzima de restrição 
(endonuclease) usada para construção do DNA 
recombinante fica dentro do gene para a bb -
galactosidase
� Se a recombinação ocorrer, o gene da bb -galactosidase
será clivada e deixará de ser funcional
� A presença ou ausência de bb -galactosidase e a 
presença ou não de resistência ao antibiótico serão 
indicadores para detectar a presença de plasmídeos e 
para saber se eles contêm ou não o inserto de DNA
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� Contrução de uma biblioteca de DNA
� Quando os plasmídeos estão prontos, são misturados 
com bactérias sensíveis à ampicilina e estas são 
colocadas para crescer em um meio que contenha um 
derivado de galactose� As células que não adquiriram o plasmídeo não 
crescem no meio que contém o antibiótico
� As células que adquiriram um plasmídeo sem o inserto 
de DNA crescem no meio, pois agora possuem um 
gene de resistência à ampicilina
� As células que adquiriram plasmídeos contendo o 
inserto serão resistentes à ampicilina e crescerão no 
meio que contém esse antibiótico
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� O grupo de clones que adquiriu o plasmídeo contendo 
o inserto forma uma biblioteca de recombinantes
� A biblioteca pode ser armazenada para uso posterior, 
ou um único clone pode ser selecionado para estudos
� Bibliotecas de RNA
� Não são construídas e clonadas como tais
� O RNA de interesse (geralmente mRNA) é usado como 
molde para a síntese de DNA complementar (cDNA)
� O cDNA é incorporado em um vetor
� A partir desse ponto, a produção de uma biblioteca de 
cDNA é praticamente idêntica a do DNA genômico
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� Encontrando um clone específico em uma biblioteca de 
DNA
� Envolve a separação e o anelamento de fitas 
complementares
� As colônias de bactérias ou placas de lise de fagos 
crescem em placa de Petri
� Um carimbo é feito por contato contato (blotting) pressionando
uma membrana de nitrocelulose contra a placa
� A membrana de nitrocelulose é tratada com um agente 
desnaturante para abrir a dupla hélice de todo o DNA 
presente nela.
� A membrana é tratada com DNA de fita simples (ou RNA). 
Esse DNA é chamado de sonda sonda (probe), sendo marcado 
com um isótopo radioativo ou com um radical 
fluorescente
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Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA
� Uma sonda radioativa de fita simples é adicionada para 
detectar o DNA desejado
� A sonda anela-se com o DNA de interesse, e apenas 
com ele 
� O clone de interesse pode ser retirado da placa de Petri
e reproduzido
� Se não houver sondas disponíveis
� Escolher um vetor que permita ao gene clonado ser 
transcrito e traduzido, ou 
� A detecção pode ser realizada por anticorpos marcados 
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Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase
� As duas fitas do DNA de interesse são separadas por 
aquecimento
� Pequenos segmentos oligonucleotídicos são adicionados em 
grande excesso e anelam-se com o DNA
� Os pequenos segmentos são complementares às extremidades 
do DNA escolhido para amplificação e servem como 
iniciadores
� DNA polimerase e outros fatores são adicionados para a 
síntese
� As duas fitas complementares são sintetizadas na direção 5’ 
para 3’; um primeiro ciclo de PCR dobra a quantidade do DNA 
desejado
� O processo de dissociação de duas fitas, de anelamento dos 
iniciadores e de cópias de fitas complementares é repetido 
� Mais de 20 ciclos podem ser completados em uma hora
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
�� Mapa genéticoMapa genético: é a ordem dos genes em um 
cromossomo
� Mapas genéticos clássicos
� Algumas bactérias, entre elas a E. coli, podem 
transferir DNA de uma célula para outra, por um 
processo conhecido como conjugaçãoconjugação
� As células estabelecem um contato físico enquanto 
tranferem DNA de uma para a outra
� Os genes que estão próximos uns dos outros no 
genoma são transferidos juntos durante a conjugação
� genes que estão distantes uns dos outros não são 
transferidos juntos
� A quantidade de DNA transferido depende do tempo em 
que as bactérias permenecem em contato
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Mapeamento dos cromossomos procarióticos
� O mapa físico do genoma da E. coli foi obtido do seguinte 
modo
� Foi escolhida uma endonuclease de restrição por gerar 
relativamente poucos fragmentos
� Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel
� Os fragmentos de DNA do gel foram transferidos para um 
filtro de nitrocelulose pela técnica de SouthernSouthern blottingblotting
� Uma solução com uma sonda de DNA de fita simples 
contendo uma determinada seqüência (um gene de 
interesse) foi incubada com o filtro de nitrocelulose
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� A sonda de DNA liga-se apenas aos fragmentos que 
contenham a seqüência de interesse; a detecção foi 
feita por auto-radiografia ou quimioluminescência
� As posições dos fragmentos no genoma circular foram 
determinadas por comparação com o mapa genético 
clássico, que já continha a posição de mais de 1000 
genes determinados
� Mapeamento de cromossomos eucarióticos
� Existem múltiplos cromossomos
� genes are separated by long stretches of noncoding
DNA sequences
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Mapeamento do gene humano
� Os primeiros genes mapeados foram os genes 
presentes no cromossomo X
� As mulheres possuem dois cromossomos X, ao passo 
que os homens têm um cromossomo X e um Y
� Alguns homens apresentam doenças provocadas por 
genes não-funcionais nos seus cromossomos X, ex.: 
cegueira para cores verde e vermelho (daltonismo), 
hemofilia e distrofia muscular de Duchenne
� Essas observações tornaram possível localizar, no 
cromossomo X, os genes envolvidos com essas 
doenças
� Os progressos foram lentos até o advento dos métodos 
de DNA recombinante
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Genes para as globinas
� São um grupo de genes em um cromossomo 
autossômico autossômico (não-sexual)
� A família de genes que codifica a cadeia bb da 
hemoglobina consiste de um grupo de genes 
arranjados ao longo do chromosomo 11, na ordem em 
que são expressos durante o desenvolvimento
� ee-globina, Ggg -globina, Agg-globina, dd -globina e bb -globina
� O mapa também contém dois pseudogenes; o 
pseudogenepseudogene é uma cópia não-funcional de um gene 
que normalmente não pode ser expressa devido a 
algum tipo de mutação
� Um arranjo similar aparece no cluster dos genes para a 
aa-globina no cromossomo 16
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Os genes humanos de globinas estão entre os 
primeiros genes de mamíferos clonados usando 
técnicas do DNA recombinante
� Houve interesse na clonagem desses genes com vistas 
ao desenvolvimento de terapias gênicas para doenças 
genéticas que resultam de hemoglobinas anormais
� A maior parte do mRNA nos reticulócitos é de dois 
tipos, aquele para a cadeia a a ou aquele para a cadeia bb
� Usando esses mRNAs, tornou-se possível construir 
sondas que permitiram a identificação dos genes de 
globinas em bibliotecas genômicas
� Cada um desses genes estava presente em um clone 
que continha também regiões de DNA adjacentes a eles
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Tais seqüências adjacentes foram então clonadas e 
puderam, assim, servir de sondas para a busca de 
seqüências de DNA localizadas em regiões ainda mais 
distantes naquele cromossomo
� O processo é chamado rastreamento de cromossomo rastreamento de cromossomo 
� Esse tipo de método possibilitou a obtenção do mapa 
físico de todo o cluster da família de genes bb -globin
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
� Em organismos que possuem dois conjuntos de 
cromossomos, um certo gene presente em um 
cromossomo pode diferir-se ligeiramente da outra cópia 
desse mesmo gene, que ocorre no cromossomo 
correspondente 
� Esses genes são alelosalelos
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Quando eles são iguais no parde cromossomos, o 
organismo é dito homozigotohomozigoto
� Quando eles são diferentes, o organismo é dito 
heterozigotoheterozigoto
� uma diferença entre os alelos, mesmo a troca em 
apenas um par de bases, pode significar que um alelo 
possui um sítio de reconhecimento para uma 
endonuclease de restrição que falta no outro
� Assim, fragmentos de restrição de tamanhos diferentes 
podem ser obtidos após tratamento com nucleases
� Esses fragmentos de restrição são denominados 
polimorfismo de comprimento de fragmentos de polimorfismo de comprimento de fragmentos de 
restriçãorestrição, RFLPsRFLPs
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Mapas GenéticosMapas Genéticos
� Esses polimorfismos são analisados por eletroforese 
em gel para separação dos fragmentos por tamanho, 
seguido de transferência para um suporte e anelamento
com uma sonda específica para o gene que está sendo 
pesquisado
� RFLPs são bastante comuns, muito mais do que 
características como cor dos olhos e certas doenças 
hereditárias, que eram utilizadas antes para fazer o 
mapeamento genético
� A análise de RFLPs foi usada na localização do gene 
alterado em casos de fibrose cística
� O gene foi isolado, clonado, e a proteína codificada
� Essa proteína está envolvida no transporte do íon 
cloreto através de membranas; se for defeituosa, o íon 
cloreto permanecerá no interior das células
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Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos
� O método de Sanger-Coulson
� Depende da interrupção seletiva da síntese do 
oligonucleotídio pelos ddNTPs
� Cada ddNTP incorporado na cadeia em crescimento 
resulta na terminação prematura da cadeia
H
Ba s e
H
H H
H H
O
- O - P- O - P - O - P - O- C H 2
O -
O
O -
O
O -
O
A 2',3'-dideoxyribonuceotide
(ddNTP)
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Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos
� Um fragmento de DNA de fita simples cuja seqüência 
se deseje determinar é usado como molde para a 
síntese de uma fita complementar 
� O iniciador faz pontes de hidrogênio com a 
extremidade 3’ do DNA a ser seqüenciado
� A mistura reacional contendo o DNA complexado com 
o iniciador é dividida em quatro partes
� Cada uma dessas partes contém os quatro dNTPs, um 
dos quais é marcado de modo a permitir a visualização
� Além disso, cada uma das partes recebe um dos quatro 
ddNTPs
� Em cada uma delas ocorre a terminação da cadeia de 
todas as posições possíveis daquele nucleotídio
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Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos
� Na eletroforese em gel de cada mistura, uma banda 
aparece correspondendo a cada posição onde a 
terminação da cadeia ocorreu
� A seqüência da fita recém-formada, que é 
complementar ao DNA-molde, pode ser “lida” 
diretamente no gel de seqüenciamento
� Uma variação desse método consiste de uma única 
mistura reacional com uma marcação fluorescente 
diferente para cada um dos quatro ddNTPs
� Esse método tornou possível a automação do 
seqüenciamento do DNA, com todo o processo 
controlado por computadores