Espectrofotometria: Absorção de Radiação

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Espectrofotometria 
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção 
e/ou emissão de radiação electromagnética por muitas 
moléculas, quando os seus elétrons se movimentam 
entre níveis energéticos. 
E0 
E1 
hn 
hn’ 
Interação da radiação com a matéria 
O que faz com que alguns raios interajam e outros passem 
através das coisas? 
 
 
Dois requerimentos devem ser observados para que uma 
determinada radiação possa ser absorvida por uma molécula: 
 
1 - A radiação incidente deve ser de frequência equivalente 
aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da 
molécula, 
 
2 - A molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo 
induzido, ou seja, deve haver algum trabalho que a energia 
absorvida possa fazer. 
 
Aplicações da espectroscopia 
Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um 
prisma: 
(a) esquema e (b) fotografia. 
Exemplo de difração de luz 
produzida na natureza. 
A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos 
comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho 
Fig.1.Espectro electromagnético. A 
espectrofotometria utiliza a radiação 
compreendida entre o ultravioleta 
(ultraviolet) e o infravermelho 
(infrared). 
 
A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de 
comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho 
no espectro da radiação electromagnética (Fig. 2). 
Ultra 
violeta 
Infra 
vermelho 
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 
Fig2. Radiação luminosa. 
 
O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 
800 nm (Tabela 1). 
Comprimento
de onda (nm)
Cor
Absorvida
Cor
Complementar
400-435 violeta Verde amarelado
435-480 azul Amarelo
480-490 Azul esverdeado Laranja
490-500 Verde azulado Vermelho
500-560 Verde Roxo
560-580 Verde amarelado Violeta
580-595 Amarelo Azul
595-610 Laranja Azul esverdeado
610-750 Vermelho Verde azulado
Espectrofotômetro 
Fig. 3. Espectrofotómetro. A luz é dividida em feixes de diferentes 
comprimentos de onda por meio de um prisma óptico e passa através 
da amostra, contida numa cubeta ou célula de espectrofotómetro. 
 
INSTRUMENTAÇÃO 
Esquema Básico de um Instrumento para Medir a Absorção 
Sistema de Feixe Simples 
Sistema de Feixe Duplo 
Fontes de radiação UV-VIS 
 
Lâmpada de Tungstênio e Tungstênio-Halogênio: O filamento da 
lâmpada de tungstênio vaporiza-se e esses vapores fixam-se na 
face interna do bulbo da lâmpada. 
 
Lâmpada de Deutério: Normalmente usa-se a lâmpada de 
deutério para comprimentos de onda entre 180 a 370nm. 
Monocromadores 
 Filtros, Filtros de interferência, Prismas , Grades de 
difração 
Detectores 
Fotografias de arranjos de diodo 
com 1024 elementos (detectores 
de diodo): a. vista de topo; b. 
vista de perfil. 
Esquema (a) e fotografia (b) do 
tubo fotomultiplicador 
HAMAMATSU - R928 
Esquema óptico de um espectrofotômetro com 
detector de arranjo de diodos 
Vê-se neste esquema duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e de tungstênio, cujas emissões são focalizadas através 
de uma lente sobre a amostra. Portanto, todo o espectro de emissão da lâmpada incide sobre a mesma, sendo que a radiação 
incidente será, em parte, absorvida. Esta radiação que atravessou a amostra (transmitida ou emergente) irá incidir sobre uma 
lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de difração. Esta grade irá difratar a radiação, separando 
os seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser 
irradiado, produz uma corrente elétrica cuja magnitude depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito 
fotoelétrico). Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em absorbância nos diferentes 
comprimentos de onda, resultando no que se convenciona chamar de espectro de absorção. 
 
 
Espectros de absorção 
O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda 
para um composto chama-se espectro de absorção e varia de 
substância para substância. Se uma substância é verde, por 
exemplo, então deixa passar ou reflete a cor nesse 
comprimento de onda, absorvendo mais a luz na região do 
vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias 
substâncias diferentes (Fig. 4). 
 
0.5 
1.0 
1.5 
Fig. 4. Espectros de absorção de diferentes substâncias (1: 
bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 4: 
ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). 
 
 Uma vez que diferentes substâncias têm 
diferentes padrões de absorção, a 
espectrofotometria permite-nos: 
• Identificar substâncias com base no seu espectro. 
•Quantificar a substância, uma vez que a quantidade 
de luz absorvida está relacionada com a concentração 
da substância 
 Espectros de absorção do 
NAD+ e do NADH. 
 
Essas diferenças de espectro podem ser 
utilizadas laboratorialmente para seguir o 
percurso de reações que se esteja a estudar, por 
exemplo, reações metabólicas que envolvam a 
oxidação do NADH ou a redução do NAD+. 
 
Espectrofotometria e quantificação 
Princípios de absorção da luz: 
1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada 
for a solução por ela atravessada: 
 
solução 10 g/l 
Io IT1 
 
solução 20 g/l 
 
IT2 
 
Io 
feixe de luz de 
intensidade Io 
2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância 
percorrida pelo feixe luminoso através das amostras: 
 
1 cm 
Io IT1 
Io IT3 
3 cm 
feixe de luz de 
intensidade Io 
Relação entre a distância percorrida pelo feixe luminoso e a a luz absorvida por uma 
solução. A solução contida na cubeta com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida 
na cubeta de 1 cm. 
 
 
 
 
absorvância 
(l fixo) 
= 
constante 
(para um l fixo) 
Al el.c.l 
 
 
concentração 
da solução 
absorvente 
distância percorrida 
pelo feixe luminoso 
através da amostra 
 
Al = log10 
Io 
IT 
Io – luz incidente 
IT – luz transmitida 
el – coeficiente de extinção molar ao comprimento de onda l 
c – concentração da substância (em moles/l) 
l – distância percorrida pela luz através da substância 
 
Nesta equação, 
Normalmente usam-se cubetas com 1 cm de comprimento, 
de modo que a equação fica: 
 
Al= el.c 
 
Ou seja, a absorbância da luz num dado comprimento de 
onda l é diretamente proporcional à concentração da 
solução. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações 
muito elevadas da substância. 
 
Métodos colorimétricos 
 Com alguma frequência é necessário quantificar 
substâncias em misturas complexas, ou que não absorvem 
significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. 
Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos 
- o composto a quantificar é posto em contato com um 
reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja 
intensidade é diretamente proporcional à concentração da 
substância na mistura original. 
Para quantificar espectrofotometricamente uma 
substância é necessário saber o valor de e. Para isso é 
necessário preparar uma série de soluções com 
concentração conhecida do composto a quantificar, e 
medir as absorbâncias no comprimento de onda 
adequado, construindo assim uma Curva de Calibração. 
0 0.1M 0.2M 0.3M 0.4M 0.5M 
Se várias substâncias absorverem a a radiação,há um efeito 
aditivo: 
 Abs = a1b1C1 + a2b2C2 + . . . 
Corante vermelho Corante azul 
Mistura corante azul +vermelho 
Mistura: 
A 510 nm= 0,317 
A625nm = 0,477 
Máx. de absorção a 625 nm 
A = 0.318 -> a = 0,106/ppm.cm 
Máx. de absorção a 510 nm 
A= 0,183 a = 0,061 ppm.cm 
Considerações Sobre a Colorimetria 
 
•É um método mais preciso em baixas concentrações que 
os métodos Titrimétricos e Gravimétricos 
•Rapidez 
•Fácil execução 
 
Fatores que devem ser Considerados na análise Colorimétrica 
1. Absortividade do Solvente 
2. Absortividade da Cubeta 
3. Absortividade do ar 
4. Temperatura e pH 
5. Interferentes 
6. solubilidade 
7. Estabilidade em solução 
9. Linearidade da Lei de Beer 
10. Outros fenômenos ópticos como reflexão, fluorescência