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2015 Nilce Nazareno da Fonte (adaptado de DUARTE, M.R., FONTE, N.N e SANTOS, C.A.M.) FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório AAPPRREESSEENNTTAAÇÇÃÃOO Olá! Seja bem-vindo no aprendizado da Farmacognosia prática. A Farmacognosia é a Ciência inserida no contexto das Ciências Farmacêuticas responsável pelos conhecimentos relacionados aos produtos naturais de origem vegetal e animal, com grande ênfase nas plantas medicinais bem como nos medicamentos e remédios fitoterápicos. Assim, os estudantes desta Ciência devem compreender desde a identificação das espécies vegetais, a identificação dos compostos químicos produzidos por essas espécies, a maneira como esses compostos podem ser extraídos (e transformados em produtos farmacêuticos), a maneira como esses compostos e produtos agem no organismo humano, culminando no conhecimento específico sobre remédios e medicamentos fitoterápicos e na correta orientação para o uso racional dos mesmos pela população. A Farmacognosia é Ciência exclusivamente farmacêutica e seu bom desenvolvimento depende de sólidos conhecimentos prévios de diversas disciplinas das áreas biológica e química, bem como de demais disciplinas farmacêuticas. No Curso de Farmácia da Universidade Federal do Paraná a Farmacognosia é desenvolvida ao longo de duas disciplinas. Aqui você encontrará material de apoio para as aulas práticas de Farmacognosia I sob minha responsabilidade. Esta apostila é a adaptação da apostila clássica utilizada na disciplina há anos, contendo os roteiros de aulas práticas. Neste novo formato, os capítulos estão acrescidos de informações da Farmacopeia Brasileira, além dos registros fotográficos das práticas desenvolvidas nas aulas (análises químicas e microscópicas) realizadas pelos acadêmicos, sem tratamento das imagens. Bons estudos! Nilce Nazareno da Fonte 2015 SUMÁRIO CAPÍTULO 1: Regras de segurança em laboratório 4 CAPÍTULO 2: Microscopia óptica e identificação de drogas vegetais 12 CAPÍTULO 3: Identificação de amidos e gomas 35 CAPÍTULO 4: Drogas aromáticas 44 CAPÍTULO 5: Drogas tânicas 60 CAPÍTULO 6: Drogas com flavonoides e antocianos 66 CAPÍTULO 7: Drogas com antraquinonas 71 CAPÍTULO 8: Drogas saponosídicas 78 CAPÍTULO 9: Drogas cardioativas 83 CAPÍTULO 10: Análise de drogas vegetais por cromatografia em camada delgada (CCD) 88 CAPÍTULO 11: Determinação de resíduo pela incineração (cinzas) 92 CAPÍTULO 12: Análise do mel 94 CAPÍTULO 13: Descrição morfoanatômica das drogas vegetais segundo literatura oficial 101 CAPÍTULO 14: Soluções e reagentes 120 CAPÍTULO 1 REGRAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS 1 INTRODUÇÃO A palavra “laboratório” significa labor = trabalho + oratium (ou oratorium) = local de reflexão. Portanto, laboratório refere-se a um local de trabalho e concentração, não necessariamente perigoso, desde que sejam tomadas certas precauções. Os laboratórios das áreas biológica e química são locais onde podem ser encontrados tanto contaminantes de origem biológica quanto química e materiais inflamáveis e/ou tóxicos são manuseados, entre outros. Esta característica requer uma atenção especial e um comportamento adequado para reduzir ao mínimo o risco de acidentes. PORTANTO, a observância das normas de segurança pessoal é importante para a integridade física das pessoas que atuam de forma permanente (professores e técnicos) ou eventual (pessoal de limpeza, alunos etc). Constantemente devem ser feitas avaliações de riscos e tomadas de medidas de controle que, rigidamente observadas, propiciam condições de trabalho em níveis de segurança adequados. O descuido, a pressa e a ignorância de possíveis perigos são as causas principais de acidentes em laboratórios. Por isso, leia com atenção as instruções abaixo e jamais brinque nestes ambientes. Entre os riscos mais comuns destacam-se os seguintes: uso de substâncias tóxicas, corrosivas, inflamáveis, explosivas, muito voláteis etc.; manuseio de material de vidro; trabalho envolvendo temperaturas muito elevadas; trabalho com altas pressões; uso de fogo; uso de eletricidade. Os produtos químicos mais agressivos ao homem e ao meio ambiente podem ainda afetar pessoas que não têm conhecimentos de suas características, como é o caso do pessoal da coleta de lixo, por exemplo. Estes, por serem leigos no assunto, ficam sobremaneira expostos às consequências do manuseio inadequado dos resíduos. Os riscos de laboratório são classificados em químicos, biológicos, ergonômicos e físicos. No laboratório de Farmacognosia da UFPR deve-se ter especial cuidado com os riscos químicos, visto que são várias as práticas que utilizam reagentes químicos potencialmente perigosos caso as devidas precauções não sejam tomadas. 5 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios 2 RISCOS RELACIONADOS AOS PRODUTOS QUÍMICOS Além do contato direto com a pele, os diversos agentes químicos manuseados em laboratórios podem agredir o organismo humano por três vias: a) Por inalação: constitui a principal via de intoxicação. A absorção de gases, vapores, poeiras e aerossóis pelos pulmões e a sua distribuição pelo sangue, que os leva às diversas partes do corpo, é extremamente facilitada pela elevada superfície dos alvéolos pulmonares. A equivocada cultura de que “laboratórios têm naturalmente odor de produtos químicos” com frequência leva a atitudes negligentes, provocando efeitos crônicos à saúde, com danos muitas vezes permanentes ou irreversíveis. b) Por absorção cutânea: a pele e a gordura protetora são barreiras bastante efetivas, sendo poucas as substâncias que podem ser absorvidas em quantidades perigosas. Os efeitos mais comuns da ação de substâncias químicas sobre a pele são as irritações superficiais e sensibilizações decorrentes da combinação do contaminante com as proteínas. Como decorrência destes fatos, o agente químico pode penetrar pela pele, atingindo a corrente sanguínea. Neste sentido é necessário especial cuidado quando houver danos à integridade da pele – feridas expostas devem ser devidamente protegidas. Ácidos e bases fortes podem, ainda, causar corrosões sérias na pele. Cuidados especiais com os olhos devem ser tomados por se tratar de um órgão mais sensível. c) Por ingestão: pode ocorrer de forma acidental, ou ao ingerir partículas que estejam retidas no trato respiratório, resultantes da inalação de pós ou fumos. Os riscos de ingestão por contaminação das mãos e alimentos serão inexistentes se houver a devida atenção e higiene no trabalho. 3 REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS A seguir estão relacionadas algumas normas básicas de segurança que, se seguidas, minimizarão os riscos de acidentes. 3.1 Medidas relativas à conduta e à atitude: Não brinque durante o trabalho nem distraia seu colega com conversas desnecessárias. Concentre-se no que estiver fazendo. Nunca trabalhe sozinho no laboratório. 6 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios Informe sempre aos seus colegas quando está sendo efetuado um experimento perigoso. Esteja sempre consciente do que está fazendo. Use roupas adequadas para o trabalho que estiver realizando. O uso do guarda-pó, de mangas longas e preferencialmente de algodão (fibras sintéticas são altamente inflamáveis), sempre fechado, é indispensável em qualquer situação. O ato de vesti-lo ou desvesti-lo sempre deve ser feito na entrada do laboratório,distante das bancadas. Sempre use sapatos fechados. Cabelos compridos devem estar presos. De preferência use calças compridas. Sempre que a ocasião pedir não dispense o uso de luvas, óculos de segurança ou máscaras. De preferência não use lentes de contato quando houver riscos de vapores ou respingos, pois estas podem reter partículas ou absorver vapores e gases causando irritação, ou ainda descolorir ou secar em ambientes com pouca umidade (as lentes gelatinosas). Se utilizar óculos de grau, estes devem ser cobertos com óculos de segurança. Sempre ouça cuidadosamente do seu professor as instruções para a execução da prática. Em caso de dúvidas, procure questionar o professor ou monitor de prática antes do começo da execução da mesma. Comunique ao seu professor qualquer acidente ocorrido. Nunca coloque sobre a bancada de trabalho objetos de uso pessoal e/ou estranhos ao trabalho. Bolsas e sacolas devem ser colocadas nas estantes próximas à porta de entrada do laboratório. Mantenha telefone celular ou demais aparelhos eletrônicos DESLIGADOS ou sem som durante as aulas, dentro de sua bolsa. Não fume no laboratório sob quaisquer circunstâncias. Nunca ingira alimentos ou bebidas no laboratório. Não utilize vidrarias e materiais de laboratório para o preparo de alimentos e/ou bebidas. Conheça o laboratório em que trabalha e saiba usar os seus equipamentos de segurança. Conheça o funcionamento dos chuveiros de segurança, dos extintores, dos lava-olhos etc. Não manuseie quaisquer aparelhos, dispositivos ou substâncias sem ter noção completa dos riscos e dos cuidados envolvidos neste manuseio. Siga as instruções do laboratório para o descarte de substâncias. Improvisações são caminhos curtos para causar acidentes. Use sempre material adequado e observe o protocolo da aula. Para trabalhos com efluentes contaminados ou potencialmente contaminados, proceder à vacinação contra tifo, tétano etc., a critério médico. 7 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios 3.2 Medidas relativas aos métodos de trabalho: a) TOXICIDADE DE SUBSTÂNCIAS DESCONHECIDAS Crie o hábito de sempre se informar sobre as propriedades tóxicas de cada substância e os respectivos primeiros-socorros em caso de acidentes. Antes de executar uma reação desconhecida, teste-a na menor escala possível dentro da capela. b) PIPETAGEM E MANUSEIO DE FRASCOS Utilize provetas, pipetas e buretas com volume adequado à quantidade de líquido que você quer medir. Jamais pipete substâncias tóxicas e/ou corrosivas com a boca; use pera de borracha, pipetadores ou bomba a vácuo. Jamais utilize a mesma pipeta para a volumetria de líquidos diferentes. Nunca abra um frasco antes de ler o rótulo. Nunca abandone as tampas sobre a bancada de trabalho; quando ela é pequena é possível mantê-la com a própria mão que segura a pipeta. Sempre recoloque as tampas nos frascos quando eles não estiverem sendo utilizados, para evitar a contaminação ou perdas por volatilização. Nunca deixe de rotular de forma adequada os frascos com soluções recém preparadas. Ao utilizar pissete para conter líquido que não seja água destilada, não esqueça de rotulá-lo corretamente. Proteja os rótulos dos frascos de reagentes, evitando escorrer líquidos em sua superfície. Neste sentido é sempre aconselhável segurar os frascos com a palma da mão sobre o rótulo. Nunca retorne reagentes para os seus frascos de origem. c) MANUSEIO DE ÁCIDOS E BASES Adicione sempre ácidos à água E NUNCA O CONTRÁRIO. Ao diluir ou dissolver um ácido ou uma base, adicione-o lentamente sobre a água com agitação. Se necessário, use resfriamento. d) AQUECIMENTO Apague sempre os bicos de gás e lamparinas que não estiverem sendo utilizados. As lamparinas devem ser acesas com fósforo ou isqueiro, NUNCA uma com a outra. Sempre as mantenha distantes de produtos inflamáveis. 8 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios Não dirija a abertura de tubos de ensaio ou frascos em aquecimento contra si mesmo ou outrem. Nunca deixe sem atenção qualquer operação em que haja aquecimento. Nunca aqueça bruscamente líquidos ou sólidos. Ao submeter um líquido à ebulição durante longo período, utilize pedras de ebulição, evitando o transbordamento do líquido e possíveis queimaduras. Nunca aqueça qualquer sistema completamente fechado. Use sempre o banho-maria para aquecer solventes orgânicos. Cuidado com peças aquecidas: como a aparência delas é igual à das frias, uma queimadura nestas circunstâncias é comum. e) ELETRICIDADE Ao ligar qualquer aparelho, verifique se a tensão da rede corresponde à indicada na etiqueta do aparelho. Não ligue ou desligue um interruptor elétrico sem antes verificar quais as instalações que se relacionam, direta ou indiretamente, com o mesmo. Não manuseie equipamentos elétricos com as mãos molhadas. f) UTILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS Não deixe aparelhagem alguma em funcionamento sem a supervisão de alguém. Ao fazer vácuo, procure utilizar recipientes capazes de suportar a pressão negativa (frascos de kitasato, por exemplo). Não faça montagens instáveis de aparelhos, tais como aquelas que utilizam livros, lápis ou caixas de fósforo como suportes. Utilize garras, anéis e suportes apropriados para cada situação. Quando aparelhos forem montados com garras, essas não devem ser muito apertadas e, caso necessário, peça ajuda para a sua colocação. Quando tubos de borracha forem conectados a aparelhos de vidro, primeiramente molha-se a borracha, sem se usar força excessiva na operação. Não utilize material de vidro trincado, lascado ou corroído. Sempre lubrifique os tubos de vidro, termômetros etc., antes de inseri- los nas rolhas. Proteja as mãos com luvas apropriadas ou enrole a peça de vidro em toalha antes de proceder a operação. g) DESCARTE E LAVAGEM DE MATERIAIS Todo o material deve ser lavado imediatamente após o uso. Não utilize solventes orgânicos para a limpeza, a não ser quando autorizado pelo seu professor. 9 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios Lave os frascos de reagentes antes de descartá-los. Lave sempre imediatamente os respingos de produto sobre a pele, qualquer que seja a sua natureza. Os vidros quebrados devem ser descartados em lixo apropriado. Os resíduos de drogas vegetais devem ser descartados nas lixeiras e NUNCA nas pias. Todo e qualquer material de natureza microbiológica deverá ser esterilizado antes de ser descartado. As soluções aquosas podem ser despejadas na pia com bastante água corrente. Na dúvida, deixe ao lado da pia com etiqueta, indicando o conteúdo da solução. Descartes de ácidos fortes devem ser diluídos em água antes de serem derramados na pia, deixando-se escorrer bastante água em seguida. Os metais pesados e os solventes orgânicos como diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetato de etila, éter de petróleo, tolueno etc., devem ser recolhidos em frascos próprios para solventes localizados dentro da capela, para serem esvaziados e incinerados em locais apropriados. Atente para o descarte correto dos solventes clorados e não clorados nos recipientes apropriados. JAMAIS DESCARTE METAIS PESADOS E SOLVENTES ORGÂNICOS NA PIA! Antes de deixar o laboratório, lave a vidraria utilizada, limpe a bancada de trabalho e lave as mãos criteriosamente. h) OUTRAS MEDIDAS Não armazene substâncias oxidantes próximas a líquidos voláteis ou inflamáveis. Não teste produtos químicos pelo odor ou sabor, a menos que a técnica o peça especificamente. Sempre utilize a capela quando forem efetuadas evaporações com solventes ou reações que liberem gases tóxicos. Ao retirar-se do laboratório, verifique se todos os aparelhos estão desligados e se há torneiras de água ou gás abertas. Em caso de acidentes, procure manter a calma. Desligue os aparelhos próximos, inicie o combate ao fogo se for o caso, isole os inflamáveis. Para evitá-los, trabalhe com cuidado máximo. 3.3 Medidas relativas à proteção individual: Abaixo estão listados alguns equipamentos de proteção individual (EPI). Nem todos são necessários para o trabalho no laboratório de Farmacognosia. Equipamento de proteção individual é todo dispositivo de uso individual destinado a 10 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios proteger a saúde e a integridade física do trabalhador. Deve ser usado apenas para a finalidade a qual se destina e não deve ser usado fora do ambiente no qual seu uso está previsto (fora do laboratório, no nosso caso): Aventais longos, com mangas compridas, protegendo ao máximo o corpo e a roupa contra respingos. Óculos de segurança. Luvas descartáveis de plástico ou cirúrgicas, para manuseio de amostras contaminadas. Luvas descartáveis de nitrila para contato intermitente com produtos químicos (luvas de látex são permeáveis a praticamente todos os produtos químicos). Luvas revestidas de amianto para trabalhar com fontes de calor. Luvas de raspas de couro para trabalhar com vidraria frágil. Luvas de borracha antiderrapantes para lavagem de vidrarias ou outros materiais frágeis onde haja riscos de queda. Protetor facial para operações que possam causar respingos. Máscara respiradora para manipulação de reagentes altamente tóxicos e voláteis. Aventais plastificados para lavagem de vidraria e outras operações onde haja derramamento de água. Calçados apropriados com solado antiderrapante e resistentes ao ataque de produtos. OBS.: a Norma Regulamentadora 6 (NR 6), com redação dada pela Portaria N.º 25, de 15 de outubro de 2001, publicada no DOU em 17 de outubro de 2001, estabelece as disposições relativas aos EPI. O texto completo da NR 6, com todas as suas atualizações, bem como de demais normas relacionadas, encontra-se disponível no site do Ministério do Trabalho e Emprego – TEM (http://portal.mte.gov.br/legislacao/normas-regulamentadoras-1.htm). 3.4 Medidas a tomar em caso de acidentes: Em caso de acidentes deve-se, mantendo a calma, desligar todos os equipamentos e materiais próximos, evacuar a área e não permitir a entrada no laboratório de pessoas estranhas, enquanto aguarda a chegada de socorro. Algumas providências imediatas devem ser tomadas: Havendo cortes não profundos, deve-se deixar sangrar um pouco e verificar se ficaram estilhaços de vidro. Lavar com água corrente e desinfetar com álcool, protegendo o ferimento com gaze esterilizada. Se houver sangramento ou hemorragia, pressionar o ferimento até cessar. 11 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Regras de segurança em laboratórios Em caso de acidente com fogo, se as proporções não forem grandes, abafa-se a chama com pano úmido. Se alguma roupa pegar fogo nunca correr, e sim rolar no chão ou envolver-se num cobertor. Queimaduras térmicas, provocadas por chamas, água fervente ou placas quentes devem ser resfriadas com água e nunca gelo. Recomenda-se um jato fraco de água levemente morna ou fria, demoradamente, sobre a zona queimada. Para aliviar a ardência pode ser usado creme de sulfadiazina de prata a 1%. Encaminhar para atendimento médico. Em caso de queimadura com ácido ou base, lava-se a região atingida com água corrente em abundância para remover todo o reagente. Se o produto cair no vestuário, removê-lo imediatamente. Em seguida procurar cuidados médicos. Se houver queimaduras químicas nos olhos, lavá-los abundantemente com água (lava-olhos) e em seguida procurar atendimento médico. Quando houver inalação de gases, vapores ou poeiras, deve-se afastar a pessoa afetada da área contaminada e levá-la para outro local bem arejado, afrouxar-lhe a roupa e mantê-la deitada de lado enquanto aguarda socorro médico. Nunca dar água, leite ou qualquer líquido. Se houver ingestão acidental de sólidos ou líquidos deve-se levar a pessoa imediatamente a um hospital, cuidando para levar junto a anotação das especificações da substância ingerida. Jamais provocar o vômito. Todos os acidentes devem ser imediatamente relatados ao professor responsável. 4 NOTAS: Manter em locais de fácil acesso e visualização nomes e telefones de médicos e/ou hospitais que possam prestar atendimento específico em caso de acidentes em laboratórios. Relacionar os produtos químicos empregados, com danos e seus riscos, sintomas e tratamento específico. Antídoto universal: em caso de envenenamento por ingestão, pode- se utilizar o chamado antídoto universal, composto por uma parte de chá da ìndia forte, uma parte de leite de magnésia, duas partes de pão carbonizado (ou carvão ativo). Porém não deve ser usado como fator principal de desintoxicação, sendo apenas uma solução temporária enquanto o paciente aguarda socorro especializado. CAPÍTULO 2 MICROSCOPIA ÓPTICA E IDENTIFICAÇÃO DE DROGAS VEGETAIS Uma das atribuições do Farmacognosta é fazer análise anatômica de drogas vegetais, visando a sua identificação – a Anatomia Vegetal estuda a estrutura interna dos organismos vegetais. Para tanto são utilizadas técnicas de microscopia óptica, que permitem o estudo da natureza íntima dos vegetais, ou seja, de suas células, tecidos e órgãos. Conhecer o microscópio, a fim de poder usá-lo em sua plenitude, é tarefa indispensável, portanto. 1 O MICROSCÓPIO ÓPTICO A palavra microscópio é de origem grega (micros = pequeno; scopein = observar com atenção). É um instrumento óptico composto por várias lentes e que serve para ampliar, à vista, objetos muito pequenos. 13 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Um microscópio óptico é formado por dois sistemas: o sistema óptico e o sistema mecânico. O primeiro é composto por: - Ocular: são as lentes situadas perto dos olhos do observador. Amplia a imagem formada nas objetivas. Quando o microscópio é binocular, possui um mecanismo que permite ajustar a distância interpupilar. - Objetivas: são as lentes situadas perto da preparação, ampliando a imagem desta. Na superfície de cada objetiva estão indicados o aumento, a abertura numérica e ainda há um anel colorido representando os diferentes aumentos: vermelho 4X, amarelo 10X, azul 40X e branco 100X (esta última de imersão). - Condensador: é um sistema de lentes situado abaixo da platina e que tem a função de concentrar a luz gerada pela fonte de iluminação em direção à preparação. - Diafragma: localizado no interior do condensador, o diafragma-iris regula o feixe de raios que atravessa o sistema de lentes, eliminando os raios muito desviados. - Fonte de luz: se trata de uma lâmpada halógena de intensidade graduada, situada ao pé do microscópio. Sua superfície externa pode possuir uma espécie de anel para a colocação de filtros que facilitam a visualização. Além do sistema óptico, um microscópio é formado pelo sistema mecânico, o qual ´composto de:- Suporte: mantém o sistema óptico e fornece estabilidade ao aparelho. É composto por duas partes, sendo elas a base (ou pé) e o braço. - Platina: também conhecida como mesa, é uma plataforma horizontal com um orifício central que permite a passagem dos raios procedentes da fonte de iluminação. Pode ser fixa simplesmente ou apresentar outra peça superior deslizante movimentada por meio de botões e denominada de carro ou charriot, destinada a movimentar a lâmina onde se localiza a preparação a ser observada. Na parte posterior há um nônio que permite fixar as coordenadas de qualquer campo óptico. Sobre a mesa existem ainda pinças para prender a lâmina. - Tubo de encaixe ou canhão: contém o revólver com as objetivas abaixo e o sistema de lentes oculares acima. Existem tubos monoculares e binoculares. - Revólver: contém o sistema de lentes objetivas. O revólver é provido de movimento circular que permite mudar as objetivas. - Parafusos macrométrico e micrométrico: permitem o deslocamento da platina para cima e para baixo. O deslocamento grosseiro se faz por meio do parafuso macrométrico, que aproxima o enfoque, e o ajuste por meio do parafuso micrométrico, que realiza o enfoque correto. 14 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas 1.1 Funcionamento do microscópio óptico O material que será observado deve ser colocado sobre lâmina de vidro e coberto por lamínula de vidro. Esta preparação é então colocada sobre a platina e presa pelas pinças. Por esta técnica, a luz proveniente do microscópio deve vir de baixo, atravessar a preparação e focalizar-se de forma adequada na lente objetiva, por isso o material deve ser de espessura extremamente fina. A objetiva, a primeira lente e que está mais próxima do objeto (daí o nome), capta a luz filtrada pelo condensador e projeta uma imagem real, invertida e aumentada da estrutura. Esta imagem é modificada mediante outro sistema de lentes, a lente ocular, que aumenta a imagem projetada pela objetiva, para ser captada pelo olho do observador. O aumento total do objeto observado é calculado multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular. No microscópio óptico este aumento tem um limite, denominado “poder de resolução” e que é de aproximadamente de 1200 vezes. 1.2 Uso e manuseio do microscópio 1º: Inicialmente deve-se verificar a iluminação: acender a luz, regular sua intensidade e ajustar o diafragma para a iluminação desejada. 2º: Colocar, a seguir, a lâmina com a preparação sobre platina, prendendo-a com o auxílio de pinças. 3º: Colocar o objeto a ser examinado na direção da lente do condensador, localizando-o aproximadamente no centro do orifício que existe na platina. 4o: Acertar a distância interpupilar das oculares (visualização de imagem única com os dois olhos). Começar a observação com a objetiva de menor aumento (4x). 5º: Para realizar o enfoque: - Aproximar ao máximo a objetiva de menor aumento da preparação, com o uso do macrométrico. Este procedimento deve ser feito olhando-se lateralmente e nunca através da ocular, já que se corre o risco de encostar a objetiva na preparação, podendo causar danos a ambos. - Olhar através da ocular e distanciar lentamente a objetiva da preparação, com auxílio do macrométrico, até que a imagem apareça nitidamente. O ajuste fino deve ser feito através do micrométrico. A observação do objeto deve ser feita movimentando-se o parafuso micrométrico delicadamente para frente e para trás até obter o enfoque fino. 6º: Para passar a um aumento maior, coloque o detalhe a ser observado no meio do campo e a seguir gire o revólver trocando a objetiva; finalmente ajuste, se 15 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas necessário, a iluminação. A imagem deve estar praticamente enfocada. Se ao trocar a objetiva, se perder por completo a imagem, é preferível voltar a focar com a objetiva anterior e repetir a operação. 1.3 Cuidados com o Microscópio - ao finalizar o trabalho, deve-se colocar a objetiva de menor aumento na posição de observação e abaixar a platina ao máximo. - não forçar nunca os parafusos giratórios do microscópio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver e condensador). - o microscópio deve ser guardado adequadamente de maneira a ficar protegido de poeiras. Para isto, deve ser coberto por uma capa especial que o acompanha. - com relação à limpeza, deve-se empregar flanela macia para as partes mecânicas e lenço de papel absorvente para as lentes. Não utilizar, em hipótese alguma, material que possa arranhar as lentes, do mesmo modo que jamais deve-se tocá-las com a mão. 2 TÉCNICAS DE MICROSCOPIA: MONTAGEM DE LÂMINAS No microscópio óptico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser observado não pode ser opaco. Por outro lado, o excesso de transparência acarreta falta de contraste entre as diversas estruturas e entre estas e o meio que as rodeia. Portanto, para que se obtenha uma boa preparação, com uma ótima visualização, alguns procedimentos técnicos são necessários: cortes histológicos muito finos e colorações histológicas que permitam a melhor visualização e diferenciação das estruturas. Podem ser observados: material em pó ou dissociado, fragmentos (quando suficientemente finos), cortes paradérmicos (paralelos à superfície), transversais e longitudinais. Os cortes podem ser feitos com auxílio de micrótomo ou à mão livre. Esta última técnica exige que o material seja de natureza rígida ou incluído em suporte (isopor, cortiça, medula vegetal), para que possa ser segurado com firmeza e cortado com uma lâmina de barbear qualquer. Para a observação com maior definição de detalhes anatômicos é necessário realizar clareamento do material, técnica esta chamada de diafanização. Este procedimento é realizado com solução de hipoclorito de sódio ou de cloral hidratado. 16 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Os corantes histológicos, utilizados para evidenciar estruturas, são compostos químicos com determinados radicais ácidos ou básicos que possuem cor e apresentam afinidade de combinação com estruturas básicas ou ácidas dos tecidos. Desta maneira cria-se o grupamento químico responsável pela cor, ou, grupamento cromóforo. Os componentes que se combinam com corantes ácidos são chamados acidófilos e os componentes que se combinam com corantes básicos são chamados basófilos. Por exemplo, os núcleos das células, onde predominam substâncias ácidas (DNA), são basófilos, enquanto que o citoplasma, onde predominam substâncias básicas (proteínas estruturais), é acidófilo. No laboratório de Farmacognosia da UFPR são comumente usados, além do diafanizador (cloral hidratado), os seguintes corantes: - floroglucina clorídrica: evidencia estruturas lignificadas, corando-as de vermelho. O material deve ser sempre diafanizado antes. - glicerina iodada: evidencia amido, corando-o de azul arroxeado. O material não deve ser diafanizado antes para não alterar a estrutura do amido; - sudam III: evidencia estruturas de natureza lipídica corando-os de rosa alaranjado. Quando a coloração por sudam III tem o objetivo de evidenciar óleos essenciais, o material não deve ser diafanizado para não haver perda por volatilização dos respectivos óleos. 2.1 Técnica de Preparo de Lâmina Diafanizada (utilizando cloral hidratado) - Escolher uma parte da droga vegetal em boas condições para oprocedimento; - Quando o material for muito rígido, reidratá-lo ou fervê-lo em água; - Quando muito flexível, incluí-lo em suporte; - Fazer cortes finos na secção desejada (transversal, longitudinal) usando lâmina de barbear. Procurar utilizar sempre lâminas novas e afiadas; - Receber os cortes em vidro-de-relógio contendo água; - Selecionar os cortes mais finos (diversos) e transportá-los com auxílio de pincel para lâmina contendo 1-2 gotas de solução de cloral hidratado; - Cobrir com lamínula e aquecer cuidadosamente na chama USANDO ÓCULOS DE SEGURANÇA; Inclinar 45ºC para permitir a saída de bolhas, lembrando-se sempre de repor o diafanizador evaporado, nunca permitindo que a lâmina fique seca. Ao repor o diafanizador, cuidar para que este não escorra por cima da lamínula. - Após diafanizar, limpar o excesso do líquido diafanizador com papel de filtro, não se esquecendo de limpar por baixo da lâmina. Observar que todo o espaço sob a lamínula esteja preenchido com o diafanizador. 17 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas - Caso necessário, substituir o diafanizador por corante usando papel de filtro para retirar o cloral hidratado ao mesmo tempo em que se coloca cuidadosamente, pelo outro lado da lamínula, a solução corante; - Examinar ao microscópio. 3 IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS VEGETAIS Embora a Farmacognosia estude fármacos de origem animal e vegetal, estes últimos, por serem mais numerosos, apresentam maior interesse. Na identificação de fármacos vegetais três caracterizações são importantes: organoléptica, macroscópica e microscópica. A análise organoléptica trata de características que impressionam os órgãos dos sentidos como cor, odor, sabor e textura. A caracterização macroscópica refere-se ao seu aspecto externo, sua morfologia e tamanho. Em geral esta análise é realizada a olho nu ou com auxílio de lupa. Muitas vezes é prejudicada quando o fármaco encontra-se fragmentado ou pulverizado. A análise microscópica, importante para verificação da identidade da droga vegetal, exige conhecimentos básicos de anatomia vegetal. Assim, determinadas estruturas microscópicas devem ser reconhecidas para que a droga possa ter a sua identidade confirmada. Em seguida uma revisão bastante resumida sobre algumas estruturas vegetais: 3.1 Anatomia de Folhas As folhas são geralmente órgãos fotossintetizantes, sendo, portanto, clorofiladas. Quando completas são formadas por bainha (porção basal alargada), pecíolo (pedúnculo da folha) e limbo (lâmina da folha). Na maioria das dicotiledôneas, as folhas apresentam uma nervura principal com ramificações secundárias; esta disposição é conhecida como venação ou nervação reticulada. Na maioria das monocotiledôneas as nervuras apresentam-se paralelas umas às outras, denominado venação paralela. Da mesma forma que o caule e a raiz, a folha possui três sistemas de tecidos: o sistema dérmico (constitui a epiderme e reveste toda a superfície foliar), o sistema fundamental (constitui o mesofilo da lâmina foliar e o córtex da nervura mediana e do pecíolo) e o sistema vascular (constitui os tecidos vasculares das nervuras). Alguns detalhes anatômicos das folhas, em fragmentos diafanizados, cortes paradérmicos, transversais e longitudinais, devem ser observados: 18 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas a) Epiderme: Sistema de revestimento, cujas faces adaxial (superior ou ventral) e abaxial (inferior ou dorsal) são recobertas por cutícula. Suas células se caracterizam por estarem perfeitamente justapostas, sem deixar espaços intercelulares. O número de camadas que formam a epiderme pode variar, bem como a forma das células, sua estrutura, o arranjo dos estômatos, a morfologia e arranjo dos tricomas, a ocorrência de células especializadas etc. Em geral, em vista frontal, as células epidérmicas são poligonais ou irregulares nas folhas com nervação reticulada. Já nas folhas com nervação paralela são normalmente poligonais ou irregulares, alongadas, com o maior eixo sempre paralelo ao sentido longitudinal do órgão. No caso de epiderme múltipla, a camada externa geralmente assume características típicas de epiderme, enquanto as camadas subjacentes diferem do mesofilo por apresentarem pouco ou nenhum cloroplasto. b) Anexos epidérmicos: Tricomas (ou pêlos) tectores (Fig. 1a) e glandulares (Fig. 1b): Os tricomas tectores podem ser unicelulares (simples) ou multicelulares. Os simples variam em função do tamanho, forma e espessura das paredes. Incluem as papilas. Os tricomas multicelulares são ramificados ou não. Os ramificados são classificados em função da forma das ramificações: estrelados, em forma de candelabro, em forma de T. Os não ramificados podem ser unisseriados ou multisseriados. Os sésseis (sem haste) são normalmente chamados de escamas e os que possuem haste são chamados de peltados. Os tricomas glandulares estão envolvidos com a secreção de várias substâncias, como óleos, néctar, sais, resinas, mucilagem, sucos digestivos e água. Possuem sua extremidade formada por uma cabeça uni ou multicelular, que pode ter grande variedade de formas e tamanhos. O pedúnculo varia no comprimento, sendo muitas vezes tão curto que torna-se quase imperceptível. Estômatos (Fig. 1c): células clorofiladas responsáveis pela troca gasosa, imprescindíveis para a fotossíntese e, secundariamente, pela saída de vapor d’água. São formados por duas células (células-guarda) que delimitam uma fenda (fenda estomática ou ostíolo). São classificados em: anomocítico (envolvido por número variável de células que não diferem em formato e tamanho das demais células epidérmicas), anisocítico (circundado por três células subsidiárias de tamanhos diferentes), paracítico (acompanhado de cada lado por uma ou mais células posicionadas de forma que seu eixo longitudinal está paralelo à fenda estomática) diacítico (acompanhado de cada lado por uma ou mais células posicionadas de forma que seu eixo longitudinal forma um ângulo reto com a fenda estomática) e actinocítico (células subsidiárias se dispõem radialmente em torno do estômato). 19 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas c) Inclusões Existem inclusões celulares orgânicas (amido, inulina, aleurona, óleos) e inorgânicas (cristais) (Fig. 2). Os cristais podem ser constituídos por oxalato de cálcio (que podem se apresentar em formas de ráfides, drusas, prismas, areias ou estilóides) ou carbonato de cálcio (denominados cistólitos, existentes em células denominadas litocistos). São produtos resultantes do metabolismo celular e que assumem forma visível no interior das células. As inclusões teciduais podem ser: células mucilaginosas e oleíferas, bolsas ou cavidades e canais ou ductos secretores, esclereides. Figura 2: tipos de cristais. a. b. c. Figura 1: a = tricomas tectores; b = tricomas glandulares; c = estômatos 20 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas d) Mesofilo: Compreende todos os tecidos situados entre a epiderme e o sistema vascular. Usualmente formado por tecidos parenquimáticos fotossintetizantes ou clorofilianos, possuindo, portanto, cloroplastos. Principalmente nas dicotiledôneas, há dois tipos de parênquimas clorofilianos: paliçádico e esponjoso (ou lacunoso). O parênquima paliçádico está geralmente logo abaixo da epiderme adaxial ou hipoderme e possui células alongadas, que em cortetransversal são visualizadas como barras dispostas lado a lado, em fileiras. O parênquima lacunoso possui células que variam muito na forma e apresenta grandes espaços intercelulares. Dependendo do arranjo dos parênquimas o mesofilo pode ter diferentes classificações, conforme Fig. 3, abaixo: a) Mesofilo homogêneo: b) Mesofilo heterogêneo assimétrico (dorsiventral): c) Mesofilo heterogêneo simétrico (isofacial): parênquima indiferenciado parênquima paliçádico parênquima lacunoso parênquima paliçádico parênquima lacunoso parênquima paliçádico 21 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas - Homogêneo, uniforme ou indiferenciado: constituído de células aproximadamente iguais, não sendo possível distinguir dois tipos de parênquimas; - Heterogêneo: apresenta parênquimas diferenciados, podendo ser: - Heterogêneo assimétrico (dorsiventral ou bifacial): constituído por um parênquima paliçádico e um lacunoso (frequentemente voltados às faces adaxial e abaxial, respectivamente); - Heterogêneo simétrico (isofacial ou isobilateral ou isolateral): constituído de um parênquima lacunoso entre dois parênquimas paliçádicos. e) Sistema vascular: Formado pelo xilema e pelo floema, tem função de sustentação e transporte de nutrientes orgânicos e minerais, localizando-se no interior do mesofilo. O xilema está sempre virado para a página superior da folha. Geralmente existe ao redor do feixe vascular a chamada bainha vascular, formada por colênquima ou esclerênquima, que dá sustentação e impede a quebra dos feixes. Os feixes de maior calibre são notados à superfície da folha, formando as nervuras. 3.2 Anatomia de Órgãos Subterrâneos Os órgãos subterrâneos compreendem as raízes e os caules subterrâneos (rizomas, tubérculos e bulbos). Depois de transformados em drogas, nem sempre a diferenciação entre eles é fácil. RAIZ: órgão especializado em fixação, absorção, reserva e condução. Apresenta-se como uma estrutura axial relativamente simples quando comparada ao caule. A raiz apresenta crescimento primário, em alongamento, tanto em dicotiledôneas herbáceas como em monocotiledôneas. No entanto, o crescimento secundário em geral só ocorre em gimnospermas e em angiospermas dicotiledôneas lenhosas. Nas monocotiledôneas, em que não existe uma raiz principal, a raiz que se forma no embrião é temporária, sendo rapidamente substituída por raízes adventícias formadas a partir do caule. A estrutura primária da raiz resulta do seu crescimento primário e caracteriza-se pela existência de um pequeno cilindro central e de um córtex muito largo. Os tecidos que são encontrados num corte transversal de raiz primária são, de fora para dentro (Fig. 4, 5a e 5b): - epiderme: geralmente com tricomas; - córtex ou região cortical: contendo: - parênquima: de reserva ou clorofiliano em epífitas; 22 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas - endoderme: última camada de células do córtex, com espessamentos em U nas monocotiledôneas e pontuações ou estrias de Caspary em dicotiledôneas. Tem como função proteger o cilindro central, que contém os tecidos condutores, de substâncias nocivas que tenham sido absorvidas ou tenham penetrado no córtex da raiz. - cilindro central: contendo: - periciclo: primeira camada de células do cilindro central, com capacidade mitótica pois forma as raízes secundárias; - floema: tecido condutor de seiva elaborada. O floema é um tecido complexo de transporte de soluções orgânicas, podendo igualmente ser primário ou secundário, como o xilema; - câmbio: tecido meristemático que origina floema para fora e xilema para dentro; - xilema: tecido condutor de seiva bruta. Trata-se de um tecido complexo, com origem no procâmbio ou no câmbio vascular, conforme se trate de xilema primário ou secundário. Os tecidos condutores organizam-se em feixes, denominados simples e alternos, pois o xilema e o floema dispõem-se alternadamente. Nas monocotiledôneas o centro da raiz é ocupado por parênquima medular, o que raramente acontece nas dicotiledôneas, que ocupam totalmente essa zona com o xilema. A estrutura secundária da raiz resulta do desenvolvimento da estrutura primária com o surgimento dos meristemas secundários. Inicialmente este meristema tem uma forma ondulada mas rapidamente toma uma forma circular, criando floema secundário para o seu exterior e xilema secundário para o seu interior. Em geral forma-se muito mais xilema que floema numa época de crescimento (primavera e início do verão), o que torna o centro da estrutura progressivamente maior. Figura 4: esquema de corte transversal de raiz de Dicotiledônea. 23 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas 3.3 Anatomia de Caule O caule é o órgão vegetal que sustenta as folhas e as estruturas de reprodução e estabelece o contato entre esses órgãos e as raízes. Em geral é inteiramente aéreo, podendo ainda haver aquáticos ou subterrâneos (rizomas, tubérculos e bulbos). Nos vegetais superiores apresenta uma mesma organização básica: nós (regiões onde as folhas se prendem ao caule) e entrenós (regiões entre dois nós consecutivos). Imediatamente acima do ponto de inserção de cada folha estão as regiões meristemáticas denominadas gemas axilares ou laterais (que originarão novas folhas); quando localizada na extremidade do caule chama-se gema apical. Em corte transversal é possível perceber uma nítida diferença entre caules de monocotiledôneas e de dicotiledôneas. Enquanto nas dicotiledôneas se observa um cilindro central bem destacado (denominada estrutura eustélica (eu=verdadeiro + stele= cilindro central), nas monocotiledôneas isto não acontece, uma vez que os tecidos de condução são encontrados dispersos tanto na periferia como na parte central do caule (denominada estrutura astélica (a=sem + stele= cilindro central) (Fig. 6a e 6b). Os tecidos originados nos meristemas primários - tecidos primários - diferenciam-se enquanto o caule se encontra em crescimento. Uma estreita faixa de células situada entre o floema primário e o xilema primário pode reter a sua natureza meristemática e formar o câmbio vascular. As células do câmbio continuam a se dividir indefinidamente, com as divisões celulares ocorrendo num plano paralelo à superfície do órgão, produzindo os tecidos secundários. A ação do câmbio vascular leva ao "engrossamento" do caule, isto é, ao seu crescimento em diâmetro. a. b. Figura 5: visão microscópica de corte transversal de raiz. a = monocotiledônea; b = dicotiledônea 24 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Quando se observa a estrutura primária do caule de dicotiledôneas em corte transversal é possível se reconhecer, de fora para dentro: - sistema de revestimento ou epiderme: é geralmente uniestratificada, recoberta por cutícula, podendo apresentar estômatos e tricomas, assim como a epiderme foliar; - córtex: região delimitada externamente pelo sistema de revestimento e internamente pela endoderme. A camada mais externa do córtex é a exoderme, nem sempre distinta morfologicamente; - cilindro vascular e medula: contendo: - periciclo: contíguo à endoderme, pode ser formado por uma ou várias camadas de células. Na maioria é pouco diferenciado morfologicamente; - floema ou líber: sistema condutor de nutrientes; a. b. Figura 6: esquema de corte transversal de caules de Angiospermas. a =monocotiledônea; b = dicotiledônea 25 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas - câmbio: tecido meristemático que origina floema para fora e xilema para dentro; - xilema ou lenho: sistema condutor de água e sais minerais; - medula: região central do cilindro vascular, geralmente parenquimática. Em alguns caules a parte interna da medula é destruída durante o crescimento, formando os chamados caules fistulosos. O floema e o xilema estão dispostos em feixes duplos e colaterais. Os feixes são sempre em número reduzido, geralmente entre dois e quatro . Na maioria dos caules, a delimitação entre córtex e cilindro vascular é de difícil visualização. Em algumas espécies a endoderme se destaca, com células maiores ou então apresentando grãos de amido ou estrias de Caspary. O córtex do caule pode ser fotossintético, com células parenquimatosas dispostas soltamente. Pode também armazenar água, como nos cactos, ou amido, uma situação menos comum. É comum encontrar colênquima e esclerênquima como tecidos de suporte. O caule das monocotiledôneas terá sempre uma estrutura primária, salvo raríssimas exceções, devido à ausência de meristemas secundários, não engrossando, portanto. São caracterizados por dois aspectos principais: - os feixes vasculares encontram-se dispersos e não organizados num cilindro central ou medula, não podendo ser encontrada uma delimitação nítida entre o córtex e a medula; - todos os tecidos são primários. ESTRUTURA SECUNDÁRIA (fig. 7): Nas dicotiledôneas lenhosas e gimnospermas, a raiz e o caule continuam a crescer em espessura em regiões onde não ocorre mais alongamento, o que é denominado crescimento secundário. Isto é resultado da atividade de dois meristemas laterais: o câmbio vascular e o câmbio da casca. O câmbio vascular vai formar floema secundário para fora e xilema secundário para dentro, engrossando o caule. A epiderme não consegue acompanhar esta enorme pressão de crescimento e acaba sendo destroçada e em resposta diferencia-se o câmbio suberofelogênico na zona cortical (câmbio da casca). Este meristema secundário irá formar para fora súber e para dentro feloderme (parênquima secundário), em substituição à epiderme destruída. Este conjunto toma o nome de periderme. Ao contrário da epiderme, o súber é um tecido com diversas camadas de células, podendo atingir espessuras importantes, como no caso dos carvalhos ou dos sobreiros, em que forma a cortiça. Exerce as funções de proteção, impedindo a perda de água e protegendo o frágil floema. É um tecido muito leve e elástico, está 26 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas presente somente em caules lenhosos. As células do súber são mortas devido à deposição de suberina na parede secundária. Os raios medulares aparecem como linhas de diversos comprimentos, radiais ao lenho, resultantes do crescimento secundário. São responsáveis pelo armazenamento e translocação de água e solutos à curta distância, principalmente no sentido lateral. Em geral, com o crescimento em espessura, o parênquima cortical que está presente na estrutura primária de caules e raízes não é mais observado após o crescimento secundário. 3.4 Anatomia de Casca As cascas são o conjunto de tecidos e sistemas localizados externamente ao câmbio em caules e raízes de crescimento secundário. Seu estudo anatômico coincide parcialmente com a anatomia desses órgãos. Incluem obrigatoriamente o floema, além da periderme (súber, felogênio e feloderme) (Fig. 7). As cascas se enrolam no sentido transversal devido à maior resistência e menor hidratação dos tecidos externos. Denomina-se casca mondada àquela que durante o preparo sofre remoção de suas camadas mais externas. Na análise desse tipo de droga não se encontra o súber. 3.5 Anatomia de Semente As sementes são originadas do óvulo fecundado e desenvolvido. Podem estar encerradas nos frutos, característica das angiospermas, ou podem ser nuas, característica das gimnospermas. casca Figura 7: esquema de estrutura secundária de caule de Dicotiledônea lenhosa. 27 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Basicamente, as sementes apresentam (Fig. 9): - tegumento ou casca: formados a partir da primina e secundina, que se espessam e impermeabilizam, protegendo a semente, tal como protegiam o macrosporângio. Pode também ser chamado do episperma e espermoderma. Células taniníferas desenvolvem-se, com freqüência, nas camadas mais externas das sementes e parecem estar relacionadas à proteção contra predadores e microrganismos, ao aumento da dureza dos tegumentos e à atribuição de cor à semente. - endosperma: também designado albúmen, é um tecido com elevado conteúdo em substâncias de reserva. O tipo de reserva e a consistência do endosperma são variáveis. Possui células com paredes finas e o material de reserva se localiza no seu interior. Podem ser encontrados grãos de amido (amiláceo) muitas vezes associados a proteínas (glúten) ou grãos de aleurona (proteico) ou ainda serem oleaginosos; - embrião: resultante do zigoto por mitoses sucessivas, em geral consiste de um eixo, hipocótilo-radícula, um ou mais cotilédones e o primórdio foliar. A forma do embrião, o número de cotilédones, seu tamanho, sua localização e as inclusões que ele possa conter são características que devem ser observadas na identificação de drogas constituídas por sementes. É importante ainda observar nas sementes certas estruturas existentes sobre o tegumento, denominadas cicatrizes e excrescências, que ajudam a caracterizar certas drogas. As mais frequentes são: hilo, micrópila ou cicatrícula, rafe, arilo, membranas aliformes, cristas e apêndice plumoso. A semente desprovida de tegumento é denominada de amêndoa. Figura 9: estruturas de semente. 28 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas 3.6 Anatomia de Flor Aparelho reprodutivo das Angiospermas, a flor é um ramo altamente modificado, constituído por folhas modificadas (férteis e estéreis), formando anéis concêntricos ao redor do eixo central de sustentação. Apresenta três tipos de órgãos (Fig. 10a e 10b): - órgãos de suporte: órgãos que sustentam a flor: - pedúnculo: liga a flor ao resto do ramo; - receptáculo: dilatação na zona terminal do pedúnculo, onde se inserem as restantes peças florais; - órgãos de proteção: órgãos que envolvem as peças reprodutoras propriamente ditas protegendo-as e ajudando a atrair animais polinizadores. O conjunto dos órgãos de proteção designa-se perianto. Uma flor sem perianto diz-se nua. Destes fazem parte: - cálice: conjunto de sépalas, as peças florais mais parecidas com folhas pois geralmente são verdes. A sua função é proteger a flor quando em botão. A flor sem sépalas diz-se assépala. Se todo o perianto apresentar o mesmo aspecto (tépalas) e for semelhante a sépalas diz-se sepalóide. Neste caso diz-se que o perianto é indiferenciado; - corola: conjunto de pétalas, peças florais geralmente coloridas e perfumadas, com glândulas produtoras de néctar na sua base, para atrair animais. A flor sem pétalas diz-se apétala. Se todo o perianto for igual (tépalas) e for semelhante a pétalas diz-se petalóide. Também neste caso o perianto se designa indiferenciado; - órgãos de reprodução: folhas férteis modificadas, localizadas mais ao centro da flor e designadas esporófilos. As folhas férteis masculinas formam o anel maisexterno e as folhas férteis femininas o interno: - androceu: parte masculina da flor, é o conjunto dos estames. Os estames são folhas modificadas, ou esporófilos, pois sustentam esporângios. São constituídos por um filete (corresponde ao pecíolo da folha) e pela antera (corresponde ao limbo da folha) (Fig. 10c); - gineceu: parte feminina da flor, é o conjunto de carpelos. Cada carpelo, ou pistilo, ou esporófilo feminino, é constituído por uma zona alargada oca inferior designada ovário, já que contém óvulos. Após a fecundação, as paredes do ovário formam o fruto. O carpelo prolonga-se por uma zona estreita, o estilete, e termina numa zona alargada que recebe os grãos de pólen, designada estigma. Geralmente o estigma é mais alto que as anteras, de modo a dificultar a autopolinização (Fig. 10d). 29 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas 3.7 Anatomia de Fruto Os frutos resultam do desenvolvimento do ovário e podem encerrar uma ou mais sementes, que provêm de óvulos fecundados. São característicos das angiospermas. Podem ser divididos em três partes: epicarpo, mesocarpo e endocarpo. O conjunto destes elementos é denominado de pericarpo (Fig. 8). - epicarpo: camada mais externa, resulta das células epidérmicas que envolvem o ovário e o carpelo. Forma a casca dos frutos, como a maçã; - mesocarpo: a camada intermediária origina-se do parênquima das paredes (tecido fundamental) do ovário. Geralmente é rico em substâncias nutritivas e saborosas, como no caso da maçã, porém existem frutos em que isso não se verifica. As substâncias nutritivas ajudam a dispersão das sementes, atraindo animais que delas se alimentam; não são utilizadas para o desenvolvimento do embrião; a. b. c. d. Figura 10: esquemas de estruturas de flor. a = corte longitudinal; b = corte transversal; c = androceu; d = gineceu. 30 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas - endocarpo: a camada mais interna resulta das células epiteliais que rodeiam a cavidade do ovário (lóculo). Na maçã corresponde à camada muito fina e com textura de papel que envolve a “estrela” central, onde se localizam as sementes. 3.8 Regras Gerais de Nomenclatura Em função da enormidade e diversidade de nomes comuns dados aos organismos vivos, em especial às plantas, é imperioso que cientificamente se identifique as mesmas pelo seu nome científico, de acordo com a nomenclatura oficial. Isto, além de possibilitar uma linguagem comum a todos, evita que ocorram equívocos e confusões. A nomenclatura botânica é estritamente regulamentada, baseada em um código oficial - ICBN (International Code of Botanical Nomenclature) - que é atualizado a cada três anos em cada International Botanical Congress. Este código se aplica a plantas, fungos e algas, e não a animais, os quais são regidos pelo código zoológico, que tem algumas diferenças. A Nomenclatura da espécie, proposta por Linnaeus em 1753, é uma nomenclatura binária ou binomial, pois contém dois termos. Assim, a designação da espécie inclui: - nome do gênero: geralmente um substantivo, escrito com letra inicial maiúscula. Reflete as características mais genéricas ou coletivas; - epíteto específico: corresponde a uma espécie determinada. Geralmente é um adjetivo, devendo ser escrito com todas as letras minúsculas. Normalmente exprime uma qualidade da planta ou nome do seu descobridor, ou ainda uma homenagem a alguma pessoa. Os nomes das espécies são escritos em destaque - em itálico, negrito ou sublinhado - e devem ser termos latinos ou latinizados. Figura 8: esquema de estrutura de fruto em comparação à de flor. 31 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Sempre que o nome de uma espécie surge pela primeira vez num texto, o binômio deve ser escrito na sua totalidade; porém subseqüentemente pode ser abreviado, reduzindo o nome do gênero à sua inicial – T. truncatus. O epíteto específico nunca pode ser abreviado. Se um organismo está devidamente identificado em nível de gênero mas não da espécie, escreve-se Tursiops sp, ou se existem numerosas espécies indeterminadas Tursiops spp. O binômio científico deve ser acompanhado do nome do autor da primeira descrição do organismo, por extenso ou abreviado, bem como o ano dessa descrição separado por vírgula – Nepeta cataria Lineu, 1759. Esta situação é conhecida como lei da prioridade (o nome mais velho, validado e efetivamente publicado para uma espécie, é o nome correto, e deve ser utilizado). Quando uma espécie é transferida de um gênero para outro, o nome do autor da primeira classificação deve vir entre parêntesis, antes do nome do autor que estabeleceu a nova combinação. Ex: Limonium brasiliense (Boiss) Kuntze. Algumas espécies receberam nomes desacompanhados da respectiva descrição. Neste caso o nome do autor da descrição deve ser mencionado após o nome do autor do nome da espécie. Ex: Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek. Algumas espécies consistem em duas ou mais raças, que são chamadas de subespécies ou variedades. Estas apresentam uma nomenclatura trinomial, seguindo-se o epíteto subespecífico à designação da espécie. Assim, o pessegueiro é Prunus persica var. persica enquanto a nectarina é Prunus persica var. nectarina. A designação dos grupos superiores à espécie é uninominal, constando de uma única palavra, um substantivo, escrito com letra maiúscula. 32 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas MMIICCRROOSSCCOOPPIIAA DDEE FFOOLLHHAASS Esta aula tem o objetivo de iniciar o aluno na prática do laboratório de Farmacognosia I por meio de técnicas de microscopia. Para tanto é fundamental que o aluno tenha estudado o início deste capítulo, sobre microscopia óptica e identificação de drogas vegetais, particularmente as técnicas descritas nas páginas 15 a 17. Serão utilizadas drogas vegetais constituídas por folhas, sendo feito cortes histológicos transversais seguidos de diafanização. Utilizar técnica de preparo de lâmina diafanizada. Guaco: folhas de Mikania sp., ASTERACEAE / COMPOSITAE. 33 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Maracujá: folhas de Passiflora alata Dryand., PASSIFLORACEAE. Pata-de-vaca: folhas de Bauhinia forficata Link., CAESALPINIACEAE / LEGUMINOSAE. . 34 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: folhas Abacateiro: folhas de Persea americana Mill., LAURACEAE. CAPÍTULO 3 MICROSCOPIA DE DROGAS VEGETAIS: amidos e gomas Esta aula tem o objetivo de trabalhar com drogas polissacarídicas pulverizadas, que dispensam a realização de cortes histológicos: os amidos e as gomas. Para a identificação de amidos será utilizada técnica de microscopia com corante específico (glicerina iodada). Para a identificação das gomas serão utilizadas reações químicas. AMIDOS E FÉCULAS Os amidos e as féculas são compostos de origem vegetal, classificados como poliholosídeos homogêneos (polímeros de glucose) e constituídos por duas cadeias de polissacarídeos: amilose (linear) e amilopectina (ramificada).Utiliza-se o nome amido quando obtido de órgãos vegetais aéreos (frutos e sementes) e fécula quando de órgãos subterrâneos. Apresentam-se como pós finos de coloração esbranquiçada, constituídos por grânulos de tamanhos, formas e estratificações variáveis. O grão de amido é constituído de hilo (ponto inicial de formação) e lamelas ou estrias (zonas claras e escuras). Na análise microscópica devem ser observadas características como a forma (esféricos, ovóides, poliédricos, periformes, elipsóides etc.), presença de lamelas, tipo de hilo (pontuado, estrelado, linear etc.) e estado de agregação. Coram-se de azul-arroxeado frente ao iodo, pelo fato deste halogênio formar um complexo com os polissacarídeos, principalmente amilose. Por este motivo, utiliza-se como corante de identificação a glicerina iodada ou o lugol. Quando tratados por água aquecida, entumecem. São solúveis em solução aquosa de cloral hidratado. São refringentes e apresentam uma cruz negra de braços recurvos (cruz de Malta) quando observados à luz polarizada. No Brasil são considerados oficiais os amidos de milho, arroz e trigo e as féculas de batata e mandioca por constarem da Farmacopeia Brasileira. 36 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas Os amidos e féculas têm grande importância em Farmacognosia: microscopicamente, auxiliam na identificação de fármacos e na pesquisa de falsificação. Por serem largamente utilizados como excipientes na indústria farmacêutica e também nas indústrias química, de alimentação etc., sua identificação é parte fundamental da análise de controle de qualidade. Técnica de preparo de lâmina - Colocar um pouco de amido ou fécula em lâmina com auxílio de bastão de vidro; - Retirar o excesso de material; - Gotejar solução de glicerina iodada; - Cobrir com lamínula; - Observar ao microscópio. Obs: Não diafanizar!!! DESCRIÇÃO DOS AMIDOS OFICIAIS Amido de trigo: obtido de frutos de Triticum vulgare Vill., POACEAE / GRAMINEAE. Segundo Farmacopéia Brasileira V: Duas formas de grãos, nitidamente diferenciadas e quase sem formas intermediárias: grãos grandes, lenticulares, redondos, ovais e sub-reniformes, algumas vezes fendidos nos bordos; apresentam camadas concêntricas pouco distintas, assim como o hilo sob a forma de um ponto central ou uma simples linha; medem, em média, de 28 μm a 35 μm de diâmetro. Vistos de perfil, são elípticos, alongados, quase fusiformes, sulcados por uma fenda, às vezes bastante larga. Os grãos menores são arredondados, facetados pela compressão mútua, medindo de 2 μm a 9 μm (5 μm a 7 μm, em média) de diâmetro. Também se apresentam em alguns grupos de dois a quatro grãos. 37 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas Amido de milho: obtido de sementes de Zea mays L., POACEAE / GRAMINEAE. Segundo Farmacopéia Brasileira V: Mistura de grãos de duas formas. Quando provenientes da periferia do albúmen são poliédricos, fortemente comprimidos, mostrando hilo arredondado, rachado ou estelar e medem, em média, 14 μm a 20 μm de diâmetro. Quando oriundos da parte mais central do albúmen mostram contorno pouco anguloso, irregularmente arredondado e são alongados, ovóides ou piriformes e com o hilo maior; e medem, em média, 10 μm a 35 μm. Os grãos menores agrupam-se, por vezes, assemelhando-se a grãos compostos. 38 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas Amido de arroz: obtido de frutos de Oryza sativa L., POACEAE / GRAMINEAE. Segundo Farmacopéia Brasileira V: Grãos muito pequenos, poliédricos, com ângulos agudos e arestas retas, comumente reunidos em grupos, com diâmetro de 2 μm a 10 μm (4 μm a 6 μm, em média). Os grãos arredondados são raros e o hilo frequentemente está ausente ou aparece como diminuta pontuação. Fécula de batata: obtida de tubérculos de Solanum tuberosum L., SOLANACEAE. Segundo Farmacopéia Brasileira V: Grãos simples, irregularmente ovóides ou subesféricos, raramente agrupados aos pares ou trios, característicos. Os grãos ovóides são desigualmente alongados ou triangulares, de 30 μm a 100 μm de diâmetro.Os grãos subesféricos medem de 10 μm a 35 μm. O hilo é redondo, excentricamente disposto na parte mais estreita do grão, com estrias bem nítidas e concêntricas. 39 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas Fécula de mandioca: obtida de tubérculos de Manihot esculenta Grantz., EUPHORBIACEAE. Segundo Farmacopéia Brasileira V: Os grãos variam de 25 μm a 35 μm de diâmetro, irregularmente arredondados, em forma de dedal, de esfera truncada em uma ou várias faces, com hilo pontuado, linear ou estrelado, central e bem nítido. 40 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas IDENTIFICAÇÃO DE GOMAS Gomas, de um modo geral, são consideradas produtos patológicos resultantes de uma ação física sofrida pelos tecidos (contusões, feridas, picadas de insetos, etc.), pela ação de microorganismos que parasitam as plantas ou devido a condições desfavoráveis, tais como seca, pela quebra das paredes celulares (formação extracelular; gomose). Algumas vezes considera-se como uma conseqüência do metabolismo normal mas de origem obscura. São obtidas geralmente por feridas provocadas nas plantas, havendo um escoamento lento para o exterior sob a forma de geléias espessas que rapidamente se solidificam. Quimicamente são polissacarídeos naturais, tipicamente heterogêneos na sua composição. Após hidrólise, são encontrados diversos açúcares como arabinose, galactose, glucose, ramnose, xilose e ácidos urônicos, na forma de sais de cálcio, magnésio e outros cátions. A maioria das gomas são hidrossolúveis e formam soluções mais ou menos viscosas. Algumas formam géis e em solução diluída precipitam com a adição de etanol. As gomas têm diversas aplicações em farmácia. Internamente são usadas como laxativas por causarem um aumento do peristaltismo intestinal. Mas suas principais aplicações são no preparo de emulsões, pastilhas, como fixador para cabelos, pós compactos, cremes e outros produtos cosméticos. Algumas gomas são também empregadas na indústria de alimentos no preparo de confeitos, geléias, xaropes e maionese. São utilizadas pela sua grande capacidade de retenção de água formando soluções mais ou menos viscosas, por possibilitar o inchamento de diversos produtos alimentícios, por estabilizar suspensões ou espuma de cerveja etc. Em geral são indigeríveis pelo organismo humano, ainda que uma parte seja degradada por microrganismos do intestino. Entre as gomas oficiais de interesse econômico e industrial estão: Goma Arábica (ou acácia): exsudato gomoso seco de caules e ramos de Acacia senegal (L.) Willd., MIMOSACEAE, ou outras espécies de Acacia africanas; CARACTERES DO PÓ: é fino e esbranquiçado, quase inodoro e de sabor insípido mucilaginoso. Goma Adragante (ou alcatira): exsudato gomoso seco de caules de Astragalus gummifer Labill., FABACEAE / LEGUMINOSAE. 41 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas CARACTERES DO PÓ: Pó branco ou branco-amarelado, inodoro e de sabor insípido,mucilaginoso. Goma Caraia (ou indiana): exsudato gomoso seco de caules e ramos de Sterculia urens Roxb. e S. tomentosa, STERCULIACEAE e de outras espécies de Sterculia. CARACTERES DO PÓ: pó branco ou levemente róseo, de odor levemente acético e de sabor mucilaginoso e levemente acético. TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO DE GOMAS Para cada goma realizar as seguintes análises: 1. Caracteres Organolépticos: - Observar a cor e o odor da goma. 2. Preparo da solução de goma a 1%: - Colocar 0,15 g de goma em pó em gral de porcelana e triturar bem; - Observar o aspecto da goma; - Adicionar gradativamente 15ml de água destilada, triturando sempre até obter goma homogênea. 3. Solubilidade em água: - Observar o aspecto da goma ao ser misturada com água: líquida, viscosa ou gelatinosa. 4. Dividir a solução de goma a 1% em 3: 2 tubos de ensaio (5 ml em cada) e 1/3 deixar no gral. e realizar as seguintes reações: 4.1 Pesquisa de lignina: - No primeiro tubo de ensaio com 5 ml da solução de goma a 1%, adicionar 2 ml de HCl conc.; - Ferver em chama por 5 minutos. Reação positiva coloração rósea 42 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas 4.2 Reação com NaOH: - No segundo tubo de ensaio com 5 ml da solução de goma a 1%, adicionar 2 ml de solução de NaOH a 15%; - Ferver. Reação positiva coloração amarelo-canário 4.3 Pesquisa de amido: - No gral que contém 5 ml da solução de goma a 1%, adicionar 1 gota de lugol; - Observar coloração. Reação positiva coloração azul Identificação das gomas: Arábica Adragante Caraia Odor inodoro inodoro levemente acético Solubilidade (aspecto da goma) líquida viscosa gelatinosa Pesquisa de amido - + - Pesquisa de lignina - - + Reação com NaOH + - - 43 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Microscopia de drogas vegetais: amidos e gomas Quando se requer o uso de goma arábica esterilizada (ou pasteurizada), isto é, privada de suas enzimas, deve-se realizar a: Pesquisa de oxidases e peroxidases: - Preparar solução de goma arábica a 1%; - Transferir 10 ml da solução para um tubo de ensaio; - Adicionar 10 gotas de H2O2 20 volumes; - Agitar e dividir em duas porções A e B. Porção A - Reação do guáiaco: - Adicionar 5 gotas de extrato alcoólico recente de resina de guáiaco a 2%; - Agitar Reação positiva (enzimas ativas) coloração azul em 10 minutos Porção B - Reação da benzidina: - Adicionar 5 gotas de solução alcoólica de benzidina1 a 0,5%; - Agitar. Reação positiva (enzimas ativas) coloração azul ou azul-esverdeada em 10 minutos 1 CUIDADO: a benzidina é um produto cancerígeno! CAPÍTULO 5 DROGAS AROMÁTICAS Denominam-se drogas aromáticas aquelas que possuem óleos essenciais em sua composição. Os óleos essenciais, também chamados de óleos voláteis, óleos etéreos ou essências, são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Sua principal característica é a volatibilidade, o que os diferencia dos óleos fixos. Quimicamente, os óleos essenciais são constituídos de derivados fenilpropanoides ou, preponderantemente, de terpenoides. Na mistura de compostos são encontrados diferentes concentrações de hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas até compostos com enxofre. Exemplos de derivados terpênicos são mentol, funchona, citronelol e borneal e dos derivados do fenilpropano, o anetol, o eugenol e o aldeído cinâmico. Nas drogas aromáticas, os óleos essenciais são encontrados em diferentes órgãos vegetais, em espécies pertencentes a gêneros e famílias diversas. São armazenados em estruturas especializadas denominadas aparelhos secretores (vide abaixo): tricomas ou pêlos glandulares; células modificadas do parênquima, em canais secretores e em bolsas secretoras lisígenas ou esquizolisígenas. 45 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Os métodos de extração utilizados para óleos essenciais variam conforme a localização do mesmo na planta e com o objetivo para o qual será destinado o óleo. Podem ser utilizados: arraste por vapor d’água, extração com solventes orgânicos, enfloração (enfleurage), prensagem (expressão) ou utilização de CO2 supercrítico. Em função do método de extração utilizado haverá variação na composição do óleo obtido, em função da grande labilidade dos seus constituintes. As drogas aromáticas e os óleos essenciais têm diversas aplicações em perfumaria, na indústria de alimentos e de cosméticos, na aromaterapia e na medicina (usados como antissépticos, carminativos, estomáquicos, expectorantes etc.). ANÁLISE DE DROGAS AROMÁTICAS Na análise de drogas aromáticas são realizadas: - identificação da droga vegetal (caracterização macro e microscópica), - pesquisa qualitativa de princípios ativos, e - doseamento do óleo essencial. Em laboratórios de Farmacognosia, tanto a identificação da droga vegetal quanto a pesquisa de princípios ativos podem ser facilmente realizadas por meio de técnicas de microscopia óptica. Para tanto, são preparadas duas lâminas com cortes histológicos: 1. uma para identificação da droga vegetal, na qual é realizada diafanização e, se necessário, coloração com floroglucina clorídrica; 2. outra, não diafanizada (para evitar a evaporação do óleo essencial), na qual será utilizado Sudam III como corante específico para pesquisa do óleo essencial. 46 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas CARACTERIZAÇÃO MICROSCÓPICA DE DROGAS AROMÁTICAS Menta: folhas de Mentha sp., LAMIACEAE / LABIATAE. . 47 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Eucalipto: folhas de Eucaliptus globulus Labill., MYRTACEAE. 48 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Erva-cidreira: folhas de Melissa officinalis L., LAMIACEAE / LABIATAE 49 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Capim-limão: folhas de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf., POACEAE / GRAMINEAE. 50 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Lípia: folhas de Lippia alba (Mill.) N.E.Br., VERBENACEAE. Alecrim: folhas de Rosmarinus officinalis L., LAMIACEAE / LABIATAE. 51 FARMACOGNOSIA I: aulas de laboratório Drogas aromáticas Canelas: cascas de caules de Cinnamomum cassia Ness ex Blume (C. aromaticum) e C. zeylanicum Ness, LAURACEAE. CANELA DA CHINA: cascas de Cinnamomum cassia Ness ex Blume (C. aromaticum), LAURACEAE. CANELA DO CEILÃO: cascas descorticadas de C. zeylanicum
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