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Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas Características Químicas dos Aminoácidos Carbono α Os aminoácidos Grupos R apolares e alifáticos Grupos R aromáticos Grupos R polares e não carregados Grupos R carregados Aminoácidos incomuns pH e pKa Constante de equilíbrio; pKa; Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas. Curva de titulação Peptídeos e Proteínas Polipeptídeo Peptídeos também são ionizáveis Possuem curva de titulação e pH isoelétrico (pI) específicos; Propriedades exploradas por algumas técnicas para separação de peptídeos e proteínas. Proteínas com outros grupos químicos Trabalhando com Proteínas Separação e purificação de proteínas Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? Basta selecionar por propriedade: Tamanho, carga e propriedades de ligação. ? Primeiro passo: extrato bruto Cromatografia em coluna Fase estacionária (matriz); Fase móvel (solução com tampão). Cromatografia de troca iônica Trocadoras de cátions; Trocadoras de ânions. Cromatografia de exclusão por tamanho Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro. Cromatografia por afinidade Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse. Eletroforese Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica; DNA, carga negativa: Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico; Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS). Etapas da eletroforese Preparação do gel Aplicação das amostras Eletroforese Coloração Análise dos resultados Preparação do gel Horizontal x vertical Agarose x poliacrilamida Aplicação das amostras Eletroforese Aplicação do campo elétrico; Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão; Terminais positivo e negativo; Coloração Gel SDS-PAGE: Prata (mais sensível); Coomassie blue. Gel de agarose: Brometo de etídio; Composto fluorescente à luz UV. Análise dos resultados Géis bidimensionais Proteínas não separadas podem ser quantificadas Convenção internacional: uma unidade de enzima digere 1 μmol de substrato por minuto a 25 °C. Estrutura Primária das Proteínas Níveis estruturais das proteínas As estruturas primárias são conhecidas Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo; As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas (e principalmente dentro da mesma). Evolução molecular Sequenciamento do mRNA é muito mais simples e preciso permite sequenciar proteínas enormes; Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas); Derivam do ancestral comum entre os organismos. Evolução molecular O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína; Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente marcadores da evolução. Produção de peptídeos Purificação a partir de tecidos; Engenharia genética; Síntese química direta.
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