APOSTILA qPCR

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Coordenação Técnica 
Dra. Karem Guimarães Xavier Meireles 
Dra. Letícia Jungmann Cançado 
Dra. Lucimara Chiari 
 
 
Coordenação de Capacitação Interna 
Setor de Recursos Humanos 
 
 
Realização 
Embrapa Gado de Corte 
 
 
Data: 28 de setembro a 01 de outubro de 2010 
 
 
Carga horária: 32 horas 
 
 
Número de participantes: 16 
 
 
Apoio: 
 
 
 
2 
 
ÍÍNNDDIICCEE 
 Página
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................................................. 
 
3 
2. SÍNTESE DE cDNA PARA A AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO 
GÊNICA .......................................................................................................................................................................................... 
 
 
7 
3. SISTEMAS PARA A DETECÇÃO DA FLUORESCÊNCIA ...................... 
 
11 
4. CONCEITOS IMPORTANTES .............................................................................................................. 
 
15 
5. ETAPAS ANTERIORES À qPCR .................................................................................................... 17 
5.1 Delineamento experimental ....................................................... 17 
5.2 Qualidade do RNA ...................................................................... 18 
5.3 Desenho e mascaração de primers .......................................... 
 
19 
6. PARÂMETROS IMPORTANTES PARA A PADRONIZAÇÃO DA 
qPCR .................................................................................................................................................................................................... 
 
20 
6.1 Two-step ou one-step qPCR …………………………………… 20 
6.2 Curva padrão e eficiência de amplificação da PCR ................ 21 
6.3 Titulação de primers .................................................................. 22 
6.4 Curva de dissociação (melt curve) ........................................... 23 
6.5 Anormalidades da curva de dissociação ................................. 
 
26 
7. MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO GÊNICA .................................................................. 28 
7.1 Quantificação Absoluta ............................................................. 29 
7.2 Quantificação Relativa................................................................ 33 
7.2.1 Genes de referência................................................................. 33 
7.2.2 Método da curva padrão relativa............................................ 34 
7.2.3 Método do Ct comparativo (∆∆Ct).......................................... 
 
37 
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................................................... 
 
41 
9. GLOSSÁRIO .................................................................................. 
 
42 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 46 
 
 
 
 
3 
 
11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO 
 
Os crescentes estudos de análise do transcriptoma e de expressão 
gênica de diversas espécies sob condições experimentais específicas vêm 
permitindo o acúmulo de informações que permitem o melhor entendimento de 
processos celulares ligados ao desenvolvimento, à resposta a estresses 
bióticos e abióticos, ao aumento da produtividade em espécies cultivadas, entre 
outros. Técnicas como a construção de bibliotecas de cDNA, micro ou 
macroarranjos de DNA, SAGE (Serial Analyses of Gene Expression) 
(Velculescu et al.,1995) e, mais recentemente, o sequenciamento massal 
(Margulies et al., 2005), constituem fonte primária para a análise de padrões 
específicos de expressão gênica. 
Os métodos de análise da expressão gênica acima mencionados 
requerem uma etapa adicional de refinamento e validação dos resultados que 
pode ser realizada por meio de Northern Blotting, técnica requer grande 
quantidade de RNA e é laboriosa, ou por análise semi-quantitativa da 
expressão gênica, cuja precisão é muitas vezes questionada. Ultimamente, a 
técnica mais utilizada é a da reação em cadeia da polimerase (PCR) 
quantitativa em tempo real (qPCR), devido à sua alta sensibilidade, praticidade 
e exatidão (Udvardi et al., 2008). Vale a pena enfatizar que a comunidade 
científica procura uniformizar o uso da abreviatura qPCR para a técnica de 
PCR quantitativa em tempo real, ao invés de RT-PCR, o que pode causar 
confusão com a abreviatura da técnica de transcrição reversa (Bustin et al., 
2009). O termo RT-qPCR ou qRT-PCR refere-se a técnica de PCR quantitativa 
em tempo real em que o alvo é o cDNA. Neste caso, a expressão gênica é 
medida indiretamente pelo o acúmulo do RNA mensageiro. 
A qPCR combina a amplificação de um alvo específico com métodos de 
quantificação, por meio de medidas da fluorescência associada à síntese de 
um amplicon ao longo dos ciclos da PCR. Essa combinação faz com que a 
qPCR seja um método sensível, robusto e com boa reprodutibilidade para 
medidas quantitativas. Esta técnica funciona essencialmente da mesma 
maneira que a PCR convencional, com ciclos subsequentes em que ocorre a 
desnaturação do DNA, a hibridização de iniciadores a sequências específicas e 
a extensão, mediada por uma DNA polimerase termoestável, de uma fita 
4 
 
complementar, resultando em um aumento exponencial do número de 
amplicons ao longo dos ciclos da reação. No entanto, na qPCR esse aumento 
é registrado em tempo real ao longo da fase exponencial e não somente ao 
final da reação (Figura 1). Na qPCR detecta-se uma fluorescência referente a 
quantidade de amplicons acumulados a cada ciclo, que é proporcional à 
quantidade inicial do DNA alvo. A qPCR também pode ser utilizada para 
realizar um ensaio do tipo endpoint (também chamado ensaio de leitura de 
placa), que mede a quantidade de produto da PCR acumulado ao final dos 
ciclos da reação. 
 Higuchi et al. (1992, 1993) foram os pioneiros no desenvolvimento de um 
sistema automatizado para a amplificação e detecção simultâneas de uma 
sequência específica de DNA, que foi denominada de PCR cinética. Os autores 
adicionaram brometo de etídeo a reação e usaram um sistema acoplado de 
câmeras para medir a fluorescência desse agente intercalante, a qual aumenta 
na presença de DNA de dupla fita. A cada ciclo da PCR uma imagem era 
gerada e, ao final da reação, as imagens eram analisadas por um software, que 
media a intensidade luminosa média emitida por cada tubo e gerava os gráficos 
de amplificação (Figura 2). 
 O uso de fluoróforos, como SYBR Green, e sondas que emitem 
fluorescência (FAM, TAMRA etc) para a detecção do DNA amplificado na 
qPCR gerou grandes avanços na técnica, permitindo até mesmo a análise em 
multiplex. Os equipamentos atualmente disponíveis para o preparo das reações 
e medição da fluorescência chegam a superar a capacidade de processamento 
simultâneo de 384 amostras, o que permite a análise conjunta de centenas de 
genes em diferentes tratamentos. Isso traz ganhos significativos, tanto para a 
facilidade de geração de resultados, diminuição de custos por reação, como 
também para a robustez das análises estatísticas. Essa ampliação na 
capacidade de gerar resultados pela qPCR facilita, por exemplo, a análise da 
expressão de centenas de genes relacionados que fazem parte de uma mesma 
via metabólica ou então a análise da expressão de membros de uma mesma 
família gênica, como por exemplo em análises de fatores de transcrição 
(Czechowski et al. 2004). 
 
5 
 
 
Figura 1 – Fases da PCR: exponencial, em que a quantidade demoléculas amplificadas dobra 
a cada ciclo; linear, em que a eficiência de amplificação é reduzida; platô, fase final em que não 
há mais amplificação. Na PCR convencional (A), a detecção da quantidade de moléculas é 
realizada ao final da reação, enquanto na qPCR (B), a detecção é realizada em tempo real, a 
cada ciclo da reação. 
 
6 
 
 
 
Figura 2 – PCR cinética, técnica desenvolvida por Higuchi et al.(1993). (A) imagens, captadas 
através da tampa dos tubos, mostrando a fluorescência emitida pelo brometo de etídeo após 
excitação com luz ultravioleta. As três imagens são das mesmas seis PCRs antes do início da 
reação (ciclo 0) e ao longo dos ciclos subseqüentes (14 e 28). As reações foram realizadas 
com diluições seriadas do DNA alvo (0, 1, 4,16, 48 e 192 x), demonstrando o princípio geral de 
que quanto maior for a quantidade de DNA inicial, mais cedo ocorre a detecção da 
fluorescência. (B) Curva de amplificação com valores normalizados (fluorescência versus 
número de ciclos). Modificado de Higuchi et al.(1993). 
 
7 
 
22.. SSÍÍNNTTEESSEE DDEE ccDDNNAA PPAARRAA AA AAVVAALLIIAAÇÇÃÃOO DDAA EEXXPPRREESSSSÃÃOO GGÊÊNNIICCAA 
 
Este método, assim como a técnica de qPCR, baseia-se na medida 
indireta da quantidade de RNA mensageiro pela quantificação do resultado de 
uma PCR usando cDNA como alvo. A primeira fita de cDNA é sintetizada a 
partir de uma preparação de RNA total, ou apenas somente de mRNA, usando 
a enzima transcriptase reversa. Nesta reação, pode-se utilizar 
oligonucleotídeos (primers) do tipo oligo-dT, complementar à cauda poli-A do 
mRNA, em sua região 3’ (Figura 3), hexâmeros aleatórios, que permitem 
múltiplos sítios de início da síntese ao longo de uma mesma molécula de 
mRNA, ou primers que amplifiquem uma sequência específica de interesse. 
Alternativamente, pode-se utilizar uma combinação desses dois primeiros 
primers em uma reação, mas isso necessita uma padronização de suas 
concentrações. 
 
 
Figura 3 - Síntese da primeira fita de cDNA a partir do mRNA, usando oligo dT e a enzima 
transcriptase reversa. 
Modificado de http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.dur.ac.uk 
 
8 
 
 A desvantagem do uso de hexâmeros aleatórios é que a maioria do 
cDNA sintetizado a partir do RNA total é ribossomal, o que pode ser um 
problema se o mRNA de interesse está presente em baixos níveis (Bustin et 
al., 2005). Além disso, por permitirem diversos sítios de início da síntese, 
podem provocar uma super-estimação do número de cópias de mRNA (Zhang 
& Byrne, 1999). O uso de oligo dT promove maior especificidade que os 
primers aleatórios e é o melhor método para uma representação mais fidedigna 
do pool de mRNA. O problema é que o método necessita de moléculas 
íntegras de mRNA, o que pode causar limitações dependendo da origem e 
condição do material biológico inicial. Outra desvantagem, é que a síntese de 
cDNA pode não abranger a região 5’ do mRNA, o que ocorre quando há 
formação de estruturas secundárias ao longo da molécula ou quando as 
sequências são longas, principalmente a região 3’ não traduzida da molécula. 
O uso de primers específicos é o método mais específico, mas necessita que 
as reações para a análise dos diversos genes de interesse sejam feitas 
separadamente, o que aumenta os gastos e a quantidade de RNA necessária 
(Bustin et al., 2005). As principais considerações para cada tipo de primer 
utilizado estão resumidas na Tabela 1. 
 
9 
 
Tabela 1 - Comparação dos tipos de primers para síntese de cDNA 
Primers Considerações 
Primer com sequência 
específica 
- Usado para a transcrição reversa somente da 
sequência alvo 
- O método mais usado na reação do tipo one-step 
(item 6.1) 
Oligo d(T) - Usado para a transcrição reversa de todos os 
mRNA eucarióticos e de vírus com cauda poli-A 
- Não deve ser utilizado para a transcrição reversa 
de RNA ribossomais (rRNA) 
- Pode apresentar problemas na transcrição reversa 
de mRNA longos ou que contenham hairpin loops 
- Tendência a apresentar desvios na transcrição 
reversa da região 3’ 
Primers aleatórios - Pode ser usado para a transcrição reversa de 
mRNA e rRNA 
- boa alternativa para a transcrição reversa de RNA 
longos ou com tendência a formar hairpin loops 
- Sem desvios na região 3’ 
Modificado de Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystems. 
 
 Outro ponto a ser definido para a padronização da síntese de cDNA é a 
escolha da transcriptase reversa. Há basicamente dois tipos disponíveis, de 
acordo com sua origem viral: MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) e AMV 
(Avian Myeloblastosis Virus). As duas enzimas possuem originalmente 
atividade DNA polimerase dependente de RNA e atividade RNase H. Esta 
última, não desejada na síntese de cDNA, degrada a fita de RNA de uma 
molécula híbrida DNA:RNA, o que pode interferir diretamente na eficiência da 
reação. Alternativas para contornar esse problema são a utilização de enzimas 
modificadas em que a atividade RNase H é reduzida ou a adição de inibidores 
desta atividade à reação. 
A enzima AMV é mais termoestável que a MMLV (Figura 4) e a reação 
com a AMV pode ser realizada em temperaturas mais elevadas, o que pode ser 
10 
 
uma boa solução para evitar a formação de estruturas secundárias da molécula 
de mRNA e aumentar a eficiência da reação. Nota-se que, dependendo da 
temperatura utilizada, a enzima MMLV modificada pode ser mais eficiente 
(Stahlberg et al. 2004). 
É importante salientar que as mesmas condições devem ser mantidas 
em todas as reações de um mesmo experimento, pois a quantidade inicial da 
molécula alvo, o tipo e concentração de primers, o tipo e concentração da 
enzima utilizada e a temperatura em que a reação é realizada são fatores que 
interferem diretamente na eficiência da síntese de cDNA. É preciso minimizar 
ao máximo as variações decorrentes da técnica para registrar com mais 
precisão a real variação entre as amostras. 
 
 
 
Figura 4 – Performance das enzimas transcriptases reversas (RT) MMLV e AMV em função da 
temperatura. 
Modificado de: http://www.ambion.com/techlib/tn/111/12.html 
 
11 
 
33.. SSIISSTTEEMMAASS PPAARRAA AA DDEETTEECCÇÇÃÃOO DDAA FFLLUUOORREESSCCÊÊNNCCIIAA 
 
Os seguintes sistemas para a detecção de fluorescência são comumente 
utilizados: o do reagente SYBR Green, o TaqMan, também conhecido como 
ensaio para nuclease 5’ fluorescente e o FRET, fluorescence resonance energy 
transfer. 
O sistema SYBR Green (Figura 5) baseia-se na capacidade desse 
corante de se ligar a todas as moléculas de DNA de fita dupla, intercalando-se 
a bases adjacentes. Uma vez ligado ao DNA, o reagente emite um sinal 
fluorescente após excitação luminosa. Este método é o menos oneroso, porém 
exige o uso de iniciadores altamente específicos para que produtos de uma 
amplificação inespecífica não sejam detectados, o que poderia resultar na 
superestimação da quantidade do amplicon. Para garantir a especificidade da 
reação, há também a necessidade de se otimizar a concentração dos 
iniciadores, que não podem formar dímeros entre si. Ao final da reação, deve-
se realizar uma curva de dissociação para a confirmação de que o sinal da 
fluorescência detectado provém somente do amplicon alvo. 
O método TaqMan (Figura 5) utiliza uma sonda que se hibridiza 
especificamente a uma região do amplicon. Esta sonda possui em sua 
extremidade 5’ um fluoróforo repórter e na 3’, uma molécula silenciadora. 
Quando próximos, a molécula silenciadora inibe a emissão de fluorescência 
pelo repórter por um processo de transferência de energia porressonância de 
fluorescência através do espaço. Durante a etapa de hibridização da PCR, 
iniciadores e sonda ligam-se a suas sequências complementares. Na etapa 
seguinte, de extensão, a enzima Taq DNA polimerase, com atividade 5’ 
exonucleásica, promove a clivagem do fluoróforo na região 5’ da sonda e um 
sinal de fluorescência é detectado, uma vez que o fluoróforo não está mais 
próximo à molécula silenciadora. A amplificação da região alvo é medida pela 
liberação e acúmulo do fluoróforo na fase de extensão de cada ciclo. A 
especificidade da reação é conferida pela sonda, que assegura que a 
fluorescência provém do acúmulo do amplicon. Este sistema permite a 
realização de um protocolo multiplex, em que sondas podem ser marcadas 
com diferentes fluoróforos e múltiplos amplicons podem ser gerados e 
quantificados simultaneamente em uma só reação. 
12 
 
 
Figura 5 – Representação esquemática dos sistemas de detecção de fluorescência usados na 
técnica de qPCR. 
Fonte: www.appliedbiosystems.com 
 
 Em ensaios com sondas do tipo FRET (fluorescence resonance energy 
transfer), são utilizadas duas sondas adjacentes que se ligam ao amplicon. 
Quando as duas sondas hibridizam-se às suas sequências específicas, seus 
fluoróforos aproximam-se, permitindo a transferência de energia do fluoróforo 
doador para o aceptor. Neste caso, a fluorescência é detectada durante a fase 
de hibridação dos primers e sondas e seu sinal é proporcional à quantidade do 
produto de PCR (Figura 6). 
 
13 
 
 
 
Figura 6 – Princípio da sonda FRET. Quando distante do fluoróforo doador, nenhuma 
fluorescência é emitida pelo aceptor (A). Durante a fase de hibridação (annealing) da qPCR, as 
duas sondas se ligam proximamente à molécula alvo permitindo troca de energia entre os 
fluoróforos e o sinal do fluoróforo aceptor é identificado (B). Na fase de extensão, as sondas 
desprendem-se da molécula alvo e o sinal do fluoróforo aceptor não é mais captado (C) 
Modificado de: Critical Factors for Successful Real - Time PCR (Qiagen) 
 
 Diversos fluoróforos estão disponíveis para a marcação de sondas em 
ensaios de qPCR, cada um com seus valores de comprimento de onda de 
excitação e emissão (Figura 7). Essa grande variedade de fluoróforos permite 
ensaios do tipo multiplex. Vale salientar que os fluoróforos escolhidos devem 
ter um espectro de excitação e emissão compatíveis com o equipamento 
utilizado e os espectros de emissão dos fluoróforos escolhidos devem ser bem 
distintos a fim de se evitar sobreposição de sinais. 
 
 
14 
 
 
 
Figura 7 – Máxima emissão, em nm, de fluoróforos repórteres usados na qPCR. 
Modificado de: Critical Factors for Successful Real - Time PCR (Qiagen) 
 
A escolha do sistema para a detecção da fluorescência dependerá das 
características de cada experimento e também da quantidade de recursos 
financeiros disponível, já que o sistema TaqMan e o FRET são mais onerosos. 
Normalmente, quando há a necessidade de se quantificar diversos tipos de 
genes, o sistema SYBR Green é o mais utilizado. O sistema TaqMan é muito 
utilizado em análises clínicas, em que resultados muito precisos são 
fundamentais. Na Tabela 2 está esquematizada uma breve comparação entre 
os sistemas TaqMan e SYBR Green, os mais utilizados para qPCR. 
 
 
 
 
15 
 
Tabela 2 – Características dos sistemas de detecção de fluorescência 
 
 TaqMan (sonda de hidrólise) SYBR Green 
Química Sonda fluorogênica para 
detectar produtos de PCR 
específicos 
Fluoróforo que se liga 
especificamente à fita dupla de 
DNA 
Especificidade Detecta amplicons específicos Detecta todas as moléculas de 
DNA de fita dupla, inclusive 
produtos inespecíficos 
Vantagens Reação específica, redução de 
backgrounds e falso positivos, 
permite multiplex, não necessita 
de curva de dissociação 
Não há necessidade de sonda 
(redução de gastos), é 
universal, bem sensível em 
sua detecção 
Desvantagens Uma sonda deve ser sintetizada 
para cada amplicon 
especificamente (aumenta 
gastos) 
Pode gerar sinais falso- 
positivos, exige realização da 
curva de dissociação 
 
 
 
 
44.. CCOONNCCEEIITTOOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS 
 
 A seguir estão listados e esquematizados (Figura 7) conceitos 
essenciais para o entendimento da técnica de qPCR. 
 
 
16 
 
 
 
Figura 7 – Esquema da curva de amplificação da qPCR evidenciando conceitos importantes. 
 
 
Linha de base (ou baseline): é o valor que indica a fluorescência de fundo, 
aquela emitida pelos componentes da reação, como água, tampão, tubos etc. 
Esse valor deve ser desconsiderado na análise. Somente valores de 
quantificação da fluorescência acima da linha de base são considerados como 
referentes à amplificação da molécula alvo. 
 
Threshold: linha que intercepta o gráfico de amplificação acima da linha de 
base, na fase exponencial da reação. Ela pode ser ajustada manualmente, mas 
normalmente é calculada automaticamente pelo equipamento, levando em 
consideração valores de Rn dos ciclos iniciais da reação. 
 
Fluorescência passiva: é aquela emitida por um fluoróforo de referência, 
geralmente utiliza-se o Rox, e sua quantificação não deve variar durante as 
fases da reação e entre amostras. É utilizada para a detecção de erros 
técnicos, como o de pipetagem que alterem o volume da reação ou problemas 
com a detecção da fluorescência pelo equipamento. 
 
17 
 
Fluorescência repórter: é aquela emitida pelo fluoróforo escolhido para 
detecção do aumento da quantidade de moléculas a cada ciclo. Ex: SYBR 
Green. 
 
Rn: é a intensidade de emissão de fluorescência repórter dividida pela 
intensidade de emissão de fluorescência passiva. 
 
Rn +: é o valor de Rn da reação que contém todos os ingredientes, inclusive a 
molécula alvo. 
 
Rn -: é o valor de Rn de uma amostra não reagente, por exemplo, do controle 
negativo, sem molécula alvo (ou DNA). 
 
∆Rn: é a magnitude do sinal gerado pela qPCR. È calculado subtraindo-se de 
Rn+ o valor de Rn-. Esse é o valor considerado nas quantificações. 
 
55.. EETTAAPPAASS AANNTTEERRIIOORREESS ÀÀ qqPPCCRR 
 
5.1 Delineamento experimental 
 A principal etapa é a de delineamento experimental. Os objetivos devem 
ser definidos com clareza para evitar que, ao final do experimento, as 
perguntas iniciais não sejam respondidas com os dados gerados. Os ensaios 
devem ser bem traçados, levando em consideração controles e repetições, 
para que os resultados possam ser validados por métodos estatísticos. A 
escolha dos genes a terem sua expressão quantificada pode ser baseada em 
dados da literatura, informações sobre vias metabólicas, dados gerados por 
bibliotecas de cDNA ou microarranjo, por exemplo. 
 Para que a análise estatística seja realizada com precisão, é necessário 
realizar replicatas. Estas podem ser de dois tipos: 
Replicata técnica: é a repetição da reação de qPCR mantendo as mesmas 
condições. Permite a detecção de erros técnicos, como pipetagem, 
contaminações, problemas de leitura do aparelho etc. É recomendada em 
número ímpar, geralmente em triplicata. 
18 
 
Replicata biológica: é a repetição do experimento biológico. Permite a 
identificação de variações entre indivíduos, não decorrentes do tratamento 
aplicado. Pode ser realizada em duplicata. 
 
5.2 Qualidade do RNA 
 A qualidade da molécula alvo também é um ponto importante e sua 
quantidade inicial deve ser a mesma em todas as reações. A obtenção de DNA 
de boa qualidade é fundamental para o êxito nas reações. No caso de ensaios 
realizados com cDNA, o cuidado deve ser ainda maior. A síntese de cDNA 
devepartir de RNA de alta qualidade e sua quantificação deve ser bem precisa. 
Métodos como o uso de equipamentos como NanoDrop (Thermo Scientific) ou 
Qubit (Invitrogen) são indicados para a quantificação do RNA. Um RNA de boa 
qualidade deve ter a razão entre a medida da absorbância a 260 e 280 nm 
(A260/A280) entre 1,8 e 2,0. Os métodos mencionados acima não dispensam a 
necessidade de verificação da qualidade do RNA por eletroforese em gel de 
agarose para que possíveis degradações possam ser identificadas. Se 
acessível, é recomendado o uso do equipamento Bioanalyzer para a 
quantificação e análise da qualidade do RNA e também do cDNA sintetizado. O 
RNA utilizado deve estar livre de contaminações com DNA genômico e o 
tratamento do material com DNase livre de RNase é fortemente recomendado 
para que não haja risco de amplificação de DNA genômico na reação de qPCR. 
A contaminação com DNA genômico nas amostras de RNA pode ser 
identificada, por exemplo, pelo NAC. Neste controle, o RNA é utilizado com 
alvo na qPCR. A detecção de amplificação indica contaminação da amostra 
com DNA genômico. Outra forma de se detectar uma contaminação com DNA 
genômico é utilizar primers que flanqueiam uma região intrônica, a qual estará 
presente no DNA genômico, mas não no cDNA. Sendo assim, serão gerados 
amplicons com tamanhos distintos, dependendo do alvo utilizado na 
amplificação. Recomenda-se que a diferença entre os amplicons possa ser 
distinguida em um gel de agarose. Os pontos destacados no item dois, para a 
síntese de cDNA, devem ser considerados para a obtenção de resultados de 
boa qualidade. 
 
 
19 
 
5.3 Desenho e mascaração de primers 
 
 Para a definição da sequência dos pares de primers a serem utilizados 
na qPCR, recomenda-se fortemente o uso de programas especializados para 
este fim, como Primer3 Plus (Untergasser et al., 2007) ou PrimerExpress . Os 
primers devem ter tamanho entre 20 e 30 nucleotídeos, conter cerca de 50% 
de conteúdo de GC e a temperatura de dissociação (Tm, ou melting 
temperatura) deve estar em torno de 60oC. A diferença entre a temperatura de 
hibridização dos primers reverse e forward deve ser menor que 4 ˚C. Além 
disso, é importante não somente evitar a formação de mismatches entre os 
primers e o gene alvo, mais como também evitar sequências repetidas de Gs 
ou Cs, especialmente na região 3´do primer. A formação de hairpins dentro do 
primer e de dímeros deve ser evitada. Para tanto, os primers não devem conter 
regiões complementares, principalmente de dois ou mais pares de bases na 
região terminal 3´do primer. 
Uma análise criteriosa deve ser realizada para a identificação de 
formação de dímeros entre os primers, geralmente realizada pelos programas 
acima citados. Por último, é necessário checar os primers quanto à 
especificidade (mascaração). Para este fim, programas como BLAST poderão 
ser usados na busca de identidade significativa. 
No caso de experimentos do tipo TaqMan, deve-se também considerar 
as mesmas condições na análise e desenho dos primers. A sonda deve ter o 
tamanho ideal de 20 nucleotídeos, porém pode variar entre 18 e 30 
nucleotídeos. Contudo, é possível o uso de sondas de tamanhos maiores que 
30. Recomenda-se, no entanto, que a molécula silenciadora esteja posicionada 
mais internamente, entre 18 e 25 bases da região 5´, e normalmente acoplado 
a uma base de timina. O conteúdo de GC da sonda poderá variar entre 30 a 
80% e idealmente ter concentrações de 40 a 60%. A sonda deve ser 
desenhada de maneira que fique o mais próximo dos primers e sem 
sobreposição. Regras de complementariedade devem ser observadas, 
evitando assim sequências repetitivas do mesmo nucleotídeo dentro da sonda, 
especialmente de guanosina trifosfato na região 5´ terminal, que pode interferir 
com a eficiência de vários fluoróforos, incluindo o FAM (qPCR Guide, 
20 
 
Eurogentec). Sondas que serão utilizadas em análises de multiplex ou em 
genotipagem devem ter o polimorfismo locado na região central da sonda. 
Finalmente, o amplicon deve ter um tamanho ideal entre 80 e 120 pares 
de bases, lembrando-se que quanto menor o amplicon, maior será a eficiência 
do PCR e maior será a eficiência das reações com atividade nucleásica. 
 
66.. PPAARRÂÂMMEETTRROOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS PPAARRAA AA PPAADDRROONNIIZZAAÇÇÃÃOO DDAA qqPPCCRR 
 
6.1 Two-step ou one-step qPCR 
 A reação de qPCR pode ser realizada em two-step ou one-step. Na 
reação em two-step, primeiramente o RNA é usado na reação de transcriptase 
reversa para a síntese de cDNA que, em seguida, é utilizado na qPCR em 
concentrações variadas. Uma alíquota de cDNA, diretamente da reação de 
transcriptase reversa, sem necessidade de purificações, pode ser utilizada 
como alvo na qPCR, entretanto, não deve ultrapassar 10% do volume da 
reação, a fim de se evitar inibição da qPCR pelos reagentes usados na síntese 
de cDNA. Sugere-se a realização de um teste com diferentes diluições do 
cDNA para a padronização da melhor diluição, aquela em que não ocorre 
inibição da qPCR e que os valores de Ct encontram-se entre 15 a 31. Os 
valores de Ct podem ser manipulados alterando-se a concentração da 
molécula alvo ou dos primers. O cDNA sintetizado pelo método two-step pode 
ser utilizado para a medição da expressão de diferentes genes de interesse e 
ser estocado para análises futuras. 
Na reação em one-step, as reações de RT-PCR e qPCR são realizadas 
em um mesmo tubo. Este processo é rápido e permite o processamento de 
diversas amostras simultaneamente. A diminuição de etapas permite maior 
reprodutibilidade entre as repetições e minimiza o risco de contaminações. No 
entanto, quando se deseja analisar a expressão de uma série de genes, é 
necessária a realização da reação de síntese de cDNA para cada um 
separadamente, o que demanda a utilização de mais reagentes e RNA, que 
pode ser um fator limitante. 
 A escolha da estratégia para a realização das reações dependerá do tipo 
do experimento realizado e quantidade de recursos disponíveis. 
 
21 
 
6.2 Curva padrão e eficiência de amplificação da PCR 
 A eficiência de amplificação indica o quanto as moléculas alvo são 
duplicadas a cada ciclo da reação de qPCR, ou seja, o quanto a reação é 
exponencial. Uma reação ideal tem eficiência igual a 100% e alguns programas 
indicam essa eficiência como 1 ou 2. 
A eficiência da amplificação é calculada com a construção de uma curva 
padrão (Figura 8), em que são utilizadas amostras padrão em diluições 
seriadas. Os valores de Ct são plotados em função do log da quantidade de 
molécula alvo. Obtém-se uma reta de regressão linear de função inversa, pois 
quanto maior a quantidade inicial de molécula alvo, menor será o valor de Ct. O 
coeficiente angular da reta (slope) indica a eficiência da PCR e seu valor deve 
ser 100 ± 10%: 
 
Eficiência da PCR = 10 (-1/slope) – 1 
 
 
Figura 8 – Exemplo de curva padrão gerada pelo programa StepOne (Applied Biosystems). As 
amostras padrão foram diluídas 0,2, 0,1, 0,02 e 0,01 vezes. Slope = -3,322, eficiência = 
100,005%, R2 = 0,997. 
 
Um slope de - 3,322 significa que a eficiência da PCR é de 100% (ou 1 
ou 2). Neste caso, a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo da reação. Um 
slope menor que -3,322 mostra que a eficiência é menor que um. A maioria das 
reações não atinge 100% de eficiência devido a limitações experimentais, 
como erros de manipulação ou excesso ou exaustão dos reagentes da reação. 
22 
 
Valores de slope acima de -3,322 indicam eficiência superior a 100%. Isso 
ocorre quando os valores medidos das amostras padrão não são lineares ou 
quando há presença de inibidores na reação. 
Diversosfatores influenciam a eficiência da amplificação, como 
qualidade da molécula alvo, sequência e concentração dos primers, sequência 
e concentração da sonda e sequência e tamanho do amplicon (fragmentos 
menores, de até 150 pb, geralmente geram eficiências maiores). 
O valor de R2 indica o quanto os valores das amostras padrão se 
sobrepõem à reta e deve ser maior ou igual a 0,985. 
 
6.3 Titulação de primers 
 Para que a qPCR ocorra em alta eficiência e sem a formação de 
dímeros entre os primers, muitas vezes é necessária a realização da titulação 
de primers. Para isso, é realizada uma série de reações em que se varia a 
concentração dos primers, conforme exemplificado na Tabela 3. Esta etapa é 
essencial quando se deseja realizar experimentos do tipo multiplex, em que 
mais de um par de primers é utilizado em uma mesma reação. No caso de 
experimentos do tipo TaqMan, a concentração da sonda deve estar entre 50 e 
250 nM. 
 
Tabela 3 – Variações das concentrações de primers (primers) para a titulação. 
 
R
ev
er
se
 p
rim
er
 (n
M
) Forward primer (nM) 
 100 300 600 
100 100/100 100/300 100/600 
300 300/100 300/300 300/600 
600 600/100 600/300 600/600 
 
 
 
23 
 
6.4 Curva de dissociação (melt curve) 
 Para experimentos que utilizam SYBR Green como fluorescência 
repórter, é necessária a construção de uma curva de dissociação, a qual é 
realizada automaticamente pelos equipamentos ao final da reação de qPCR. 
Esta curva é necessária para a certificação da especificidade do primer à 
molécula alvo e identificação de possíveis contaminações na reação, já que o 
SYBR Green liga-se inespecificamente a qualquer molécula de DNA de fita 
dupla. Para a construção da curva de dissociação, ao final da PCR, as 
moléculas são rapidamente desnaturadas a 94-95oC e, em seguida, 
renaturadas a 60oC. Esse procedimento é realizado para que, ao final, todas as 
moléculas estejam na forma de fita dupla. A partir deste ponto, inicia-se 
novamente o aumento da temperatura para a desnaturação da molécula até a 
temperatura de 94-95oC. Durante esse processo, o equipamento capta o sinal 
da fluorescência do SYBR Green, que diminui com a desnaturação das 
moléculas (Figura 9). Determina-se então a temperatura de dissociação, aquela 
em que metade dos pares de bases de uma molécula encontra-se desnaturada 
e que é específica para cada par de primers utilizados (Figura 10 e 11). 
 
 
24 
 
 
Figura 9 – Curva de dissociação (melt curve) do sinal do fluoróforo repórter (SYBR Green) normalizado 
(Rn) em função da temperatura. O aumento da temperatura provoca a desnaturação das moléculas de 
DNA e, consequentemente, a redução do sinal do fluoróforo repórter, uma vez que a detecção da 
fluorescência do SYBR Green é possível somente quando este se encontra ligado a moléculas de DNA 
de dupla fita. A linha azul pontilhada indica a Tm de 84,73oC. 
 
25 
 
 
Figura 10 – Dinâmica da determinação da Tm (temperatura de dissociação). O aumento de 
temperatura provoca a desnaturação progressiva do DNA até o ponto em que todas as 
moléculas encontram-se na forma de fita simples. 
 
 
 
Figura 11 – Curva de dissociação (melt curve) ideal do sinal do fluoróforo repórter (SYBR 
Green) (-Rn) em função da temperatura. Observa-se a formação de um pico único referente à 
Tm (81,43oC), sem sinais interferentes. Curva gerada pelo programa Step One 2.1 (Applied 
Biosystems). 
 
26 
 
6.5 Anormalidades da curva de dissociação 
 Algumas anormalidades detectadas na curva de dissociação refletem 
problemas na qPCR. Algumas dessas alterações, exemplos reais gerados em 
nosso laboratório, estão comentadas a seguir: 
 
 Presença de contaminantes 
 Se ocorrer amplificação no controle negativo sem molécula alvo NTC (no 
template control), com a curva padrão é possível identificar a natureza da 
contaminação, que pode ser com o amplicon de interesse ou com um 
fragmento de DNA outro. No primeiro caso, o pico da curva de dissociação da 
amostra NTC irá se sobrepor ao pico das demais amostras (Figura 12), 
indicando uma possível contaminação do master mix ou do poço do NTC com 
a molécula alvo. Esta contaminação pode ocorrer também devido a selagem ou 
fechamento inadequado da placa ou do tubo, respectivamente. Recomenda-se 
a repetição da reação com a substituição de seus reagentes. 
 
 
Figura 12 – Curva de dissociação indicando contaminação do controle negativo NTC (no 
template control) com a molécula alvo. A amplificação no NTC iniciou-se no Ct 34. Curva 
gerada pelo programa Step One 2.1 (Applied Biosystems). 
 
27 
 
 Amplificação inespecífica 
A amplificação inespecífica ocorre quando os primers utilizados na reação 
amplificam mais de um amplicon e não especificamente o amplicon desejado. 
Este problema é identificado na curva de dissociação pela presença de mais de 
um pico (Figura 13). 
 
 
Figura 13 - Curva de dissociação evidenciando a amplificação inespecífica do amplicon de 
interesse pela presença de múltiplos picos. Nesta reação, houve ainda contaminação ou 
formação de dímeros de primers, já que um pico também foi detectado para a amostra NTC. 
Curva gerada pelo programa Step One 2.1 (Applied Biosystems). 
 
 Formação de dímeros de primers 
A formação de dímeros de primers também pode ser identificada pela 
análise da curva de dissociação. Estes são identificados pela presença de um 
pico menor e anterior ao pico referente ao amplicon de interesse (Figura 14). O 
problema pode ser resolvido com a titulação de primers (item 6.3), em que a 
concentração dos primers é otimizada na reação, mas o desenho de um novo 
par de primers muitos vezes é necessário. A detecção de formação de dímeros 
pode ser confundida com uma contaminação, que também poderia se 
28 
 
manifestar como um pico menor e anterior ao pico do amplicon de interesse. 
Para distinguir a contaminação da formação de dímeros, pode-se repetir a 
reação com novos reagentes, como estratégia para se livrar de contaminações, 
ou realizar a titulação dos primers. 
 
 
Figura 14 - Curva de dissociação evidenciando a formação de dímeros na reação de PCR pela 
presença de um segundo pico menor e anterior ao pico do amplicon de interesse. A linha azul 
pontilhada indica a temperatura de dissociação (Tm = 83,23). Curva gerada pelo programa 
Step One 2.1 (Applied Biosystems). 
 
77.. MMÉÉTTOODDOOSS DDEE QQUUAANNTTIIFFIICCAAÇÇÃÃOO GGÊÊNNIICCAA 
 
 Existem dois métodos de quantificação gênica: quantificação absoluta, 
em que é determinada a quantidade absoluta da sequência alvo, expressa em 
número de moléculas, cópias ou concentração, e quantificação relativa, em 
que se deseja identificar alterações da expressão gênica de uma amostra teste 
em relação a uma amostra calibradora. 
 
 
 
29 
 
7.1 Quantificação Absoluta 
A quantificação absoluta permite a determinação precisa da quantidade 
de moléculas, cópias ou concentração de uma molécula alvo. Para tanto, em 
cada corrida é necessário o estabelecimento de uma curva padrão. A curva 
padrão é constituída de uma série de diluições de padrões com número de 
cópias conhecidas, que devem variar entre 101 a 1010 moléculas. Portanto, é 
importante que os padrões sejam originados de uma molécula única e pura e 
não devem estar contaminados, para que não haja superestimação do número 
de cópias calculado. Os padrões devem ser diluídos em concentrações 
próximas às do alvo nas amostras biológicas. 
O material usado na curva padrão em quantificações absolutas pode ser 
de diferentes origens (Bustin, 2000, 2002; Pfaffl & Hageleit, 2001). Padrões 
feitos com DNA plasmidial e genômico sãomais estáveis, duráveis e de maior 
reprodutibilidade em relação aos padrões feitos com RNA. O material usado na 
curva padrão deve ser quantificado da forma mais precisa possível, já que o 
conhecimento de sua concentração é essencial para o sucesso da técnica. 
Abaixo estão listados os tipos de moléculas que podem ser usadas como 
padrões: 
DNA plasmidial: a sequência de interesse é clonada em um plasmídeo. As 
vantagens desse método são a facilidade de gerar grandes quantidades do 
padrão, de verificar a sequência clonada por sequenciamento e de 
quantificação. Recomenda-se que o plasmídeo utilizado na curva padrão esteja 
linearizado, uma vez que a eficiência de amplificação difere quando este está 
na forma linearizada ou superenrolada. Estando linearizado, terá eficiências 
mais próximas daquelas da amplificação de DNA genômico ou cDNA. Se a 
eficiência de amplificação do plasmídeo superenrolado for similar a das 
amostras teste, a etapa de linearização pode ser eliminada. Os valores de 
concentração de DNA são convertidos para número de moléculas pela fórmula 
abaixo: 
(X g/ µl DNA/ [tamanho do plasmídeo em pb x 660]) x 6,022 x 1023 
 
Fragmentos de PCR: o produto da PCR contendo a sequência de interesse em 
diluições seriadas também pode ser usado para a construção da curva padrão. 
Recomenda-se incluir pelo menos 20 pb upstream e downstream aos sítios de 
30 
 
ligação dos primers. O número de cópias é calculado pela fórmula acima, 
substituindo-se o tamanho do plasmídeo pelo tamanho do fragmento de PCR. 
 
Primers sintetizados comercialmente: seguem o mesmo princípio descrito para 
o uso de fragmentos de PCR. 
 
DNA genômico: pode ser usado se o gene alvo estiver presente em cópia única 
por genoma haplóide. O número de cópias da sequência alvo presente no DNA 
genômico pode ser diretamente calculado se o tamanho do genoma é 
conhecido. Por exemplo, o tamanho do genoma haplóide do camundongo Mus 
musculus é 2,7 x 109 e peso molecular de 1,78 x 1012 Daltons. 1,78 x 1012 g de 
DNA genômico corresponde a 6,022 x 1023 cópias do gene de cópia única. 
Sendo assim, em 1 μg de DNA genômico haverá 3,4 x 105 cópias do gene de 
cópia única. De acordo com esses valores, procede-se as diluições para a 
curva padrão. 
 
RNA/cDNA: os padrões de RNA podem ser criados clonando-se parte ou todo 
transcrito de interesse em um vetor. O inserto a ser clonado é gerado por RT-
PCR e o vetor deve conter promotores para a RNA polimerase, como T3, T7 ou 
SP6. Realiza-se então a transcrição in vitro para a geração do transcrito no 
sentido senso. Em seguida, o DNA plasmidial é removido com uma DNase, 
pois podem interferir na quantificação do transcrito ou até mesmo servir de alvo 
em PCR subseqüentes. Após a quantificação do RNA, o número de moléculas 
pode ser estimado pela fórmula abaixo. O RNA quantificado é convertido a 
cDNA que é usado como padrão. 
(X g/μl RNA/[tamanho do transcrito em nucleotídeos x 340]) x 6,022 x 1023 = Y 
moléculas/μl. 
 
Finalmente, deve-se usar, no mínimo, cinco séries de diluições com 
número de cópias ou concentração conhecidas. Com isso, se estabelecerá 
uma curva de regressão linear dos valores de Ct em função da quantidade 
absoluta logarítmica da molécula alvo (item 6.2). Os primers e sondas 
utilizados para a construção da curva padrão e análise das amostras teste 
devem ser os mesmos, pois os amplicons devem ser idênticos. A reação de 
31 
 
amplificação do material genético usado na curva padrão e do gene alvo deve 
ocorrer com eficiências o mais próximas possível. O número de cópias do gene 
alvo pode ser calculado a partir da regressão linear obtida da curva padrão, ou 
seja, pela interpolação dos valores de Ct obtidos na curva padrão (Figura 15). 
A vantagem desse método é que os valores das quantidades são gerados 
diretamente, sem a necessidade de análises intermediárias. 
 
 
Figura 15 – Curva padrão realizada com cinco diferentes diluições do padrão (standard 
sample). A concentração da amostra de interesse é obtida diretamente pela interpolação do 
valor de Ct à curva padrão. 
Fonte: Critical Factors for Successful Real - Time PCR (Qiagen) 
 
Exemplo de quantificação absoluta para o cálculo de cópia viral 
 O objetivo é estimar o número de cópias virais que infectam uma planta. 
Neste caso, a curva padrão é feita com um plasmídeo em que a sequência viral 
está clonada. Seguem-se os passos descritos abaixo: 
 
1. Construção da curva padrão usando plasmídeo para o cálculo do número de 
cópias de DNA viral 
 
32 
 
Número de Cópias em 100 ng/µl 
=(
ࢄࢍ
µ࢒ ࡰࡺ࡭
࢚ࢇ࢓ࢇ࢔ࢎ࢕ ࢊ࢕ ࢖࢒ࢇ࢙࢓íࢊࢋ࢕ ࢋ࢓ ࢈࢖ ࢞ ૟૟૙)x 6,022x10
23 
=(
૚૙షૠࢍµ࢒ࡰࡺ࡭
૞૞ૡ૜ ࢞ ૟૟૙)x 6,022x10
23 
=( ૟.૙૛૛࢞૚૙
૚૟
૜.૟ૡ૝ૠૡ࢞૚૙૟)
 
=1,6x1010 cópias 
 
Portanto, em 100 ng/µl de DNA tem-se 1,6 x 1010 cópias de DNA viral. A partir 
deste resultado, são realizadas diluições de 10 x até se obter 102 cópias virais: 
 
100 ng/µl .................................1010 cópias 
10 ng/µl ...................................109 
1 ng/µl .....................................108 
100 pg/µl .................................107 
10 pg/µl ...................................106 
1 pg/µl .....................................105 
0.1 pg/µl ..................................104 
 As diluições são usadas para a construção da curva padrão. 
 
2 – Para a determinação da carga viral na planta infectada, seu DNA é utilizado 
como alvo na qPCR, com os primers que amplificam a sequência viral, a 
mesma utilizada para a construção da curva padrão. Obtém-se o valor de Ct, 
que é interpolado à curva padrão para a obtenção da concentração de DNA 
viral. Vale lembrar que um único valor de threshold deve ser fixado para todas 
as amostras e que as reações para a construção da curva padrão e as 
amostras testes devem ser analisadas em uma mesma corrida. 
 O mesmo princípio é utilizado para a detecção de transgênicos e na 
segurança alimentar, por exemplo. 
 
 
 
 
 
33 
 
7.2 Quantificação Relativa 
 Os métodos de quantificação relativa da expressão gênica permitem a 
quantificação das diferenças dos níveis de expressão de um alvo (gene) 
específico entre diferentes amostras. Os dados gerados não são expressos em 
números absolutos e sim, em quantidades de vezes a mais ou a menos em 
relação a uma amostra, denominada amostra calibradora. Os métodos de 
quantificação relativa são: método da curva padrão relativa e método do Ct 
comparativo (∆∆Ct). A quantificação relativa demanda a avaliação da 
expressão gênica do gene alvo e de um gene de referência. Este último serve 
como controle para a normalização da quantidade inicialmente adicionada da 
molécula alvo nas reações. 
 
7.2.1 Genes de referência 
 Para a obtenção da quantificação dos níveis de mRNA, deve-se também 
realizar a avaliação da expressão de um gene de referência. Um gene de 
referência é aquele cuja expressão não varia significativamente entre tecidos, 
estágio de desenvolvimento e tratamentos, ou seja, a relação entre os valores 
de expressão no controle e no tratamento deve ser próxima ou igual a um. 
Genes envolvidos em processos celulares básicos e que são expressos 
constitutivamente na célula, como o da actina, ubiquitina e gliceraldeído 3-
fosfato desidrogenase, são comumente utilizados como genes de referência 
(Czechowski et al. 2005). No entanto, estudos indicam que a expressão desses 
genes constitutivos pode variar e não há um gene de referência universal para 
todos os experimentos. Sendo assim, para que a interpretação dos dados 
possua o máximo de consistência, o teste e a identificação de genes de 
referência de boa qualidade, isto é, que não apresentem variaçãosignificativa 
de sua expressão entre as amostras, é etapa essencial em análises por RT-
qPCR e deve ser realizada para cada experimento. O uso de múltiplos genes 
de referência também aumenta a exatidão das análises (Vandesompele et al., 
2002). Existem softwares que medem a estabilidade dos genes de referência 
ao longo das amostras analisadas, entre eles estão o GeNorm (Vandesompele 
et al. 2002), BestKeeper (Pfaffl et al., 2004), NormFinder (Andersen et al., 
2004). 
 
34 
 
 
7.2.2 Método da curva padrão relativa 
 O princípio deste método é o de interpolação dos dados de Ct de uma 
amostra de interesse a uma curva padrão. Uma vantagem do método é que a 
quantificação dos padrões para a construção da curva não é necessária. 
Realiza-se apenas a diluição seriada de uma mesma amostra. Este método é 
recomendado para um número pequeno de genes a serem analisados e 
quando as eficiências dos genes alvo e de referência não são tão próximas, o 
que facilita a etapa de padronização do gene de referência a ser utilizado. 
Trata-se de um método simples de análise, com boa precisão e que emprega 
análises estatísticas simples, uma vez que os dados são obtidos diretamente 
por interpolação na curva padrão. A desvantagem do método é que a 
construção da curva padrão para o gene alvo e de referência é obrigatória a 
cada corrida, o que demanda o uso de mais reagentes e aumenta os gastos do 
procedimento. Além disso, as amostras de diluição seriada para a construção 
das curvas padrão demandam mais espaço na placa, o que limita a quantidade 
de genes ou amostras que podem ser analisados em uma mesma corrida. 
 No exemplo abaixo, retirado do texto Guide to Performing Relative 
Quantitation of Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR, Applied 
Biosystems, o cDNA de células Raji, uma linhagem de células em cultura de 
linfoblastóides, foi utilizado como padrão para a construção da curva. Neste 
caso, a amostra padrão é considerada independente, pois não faz parte do 
experimento, ou seja, não contém o cDNA de nenhuma amostra a ser testada. 
Três reações de transcriptase reversa foram realizadas com 1 µg de RNA total 
de células Raji, da amostra calibradora e da amostra teste. Em seguida, os 
cDNAs obtidos foram diluídos de forma seriada (Figura 16). 
 
35 
 
 
Figura 16 – Amostras de RNA utilizadas para a reação com transcriptase reversa: RNA de 
células Raji, para a construção da curva padrão, da amostra calibradora (não tratada) e da 
amostra teste (tratada). Após a síntese de cDNA, as amostras foram diluídas em série. 
Fonte: Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystems. 
 
 Para a reação de qPCR, 10-1 do cDNA das células Raji foi utilizado como 
a amostra mais concentrada da curva padrão e diluições seriadas na ordem de 
dez vezes foram realizadas (Tabela 4). As amostras calibradora e teste foram 
usadas na diluição de 10-3. 
 
Tabela 4 – Diluições utilizadas para a construção da curva padrão 
 
Fator de diluição 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 
Massa (ng) 100 10 1 0,1 0,01 
 
 
 Duas séries de qPCR foram realizadas em uma mesma placa, uma com 
o gene alvo (IL-4) e outra com o gene de referência (18S). Desta forma, a curva 
padrão, com as amostras das células Raji, foi construída tanto para o gene alvo 
como para o gene de referência. Os valores de Ct obtidos para as amostras 
calibradora e alvo foram interpolados à sua respectiva curva padrão (gene alvo 
ou referência) (Figura 17). 
36 
 
 
 Gene Alvo Gene de Referência 
 
Figura 17 – Curvas padrão do gene alvo e de referência realizadas com as diluições da 
amostra de cDNA de células Raji. Os valores de Ct das amostras teste (em vermelho) e 
calibradora (em azul) foram interpolados às curvas para a obtenção de valores de quantidade 
de RNA. 
Fonte: Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystem 
 
 Com a interpolação dos valores de Ct à curva padrão, valores de 
quantidade de RNA total foram obtidos para as amostras calibradora e teste 
(Tabela 5). 
 
Tabela 5 – Valores de quantidades de RNA obtidos com a interpolação dos 
dados de Ct 
 
 
37 
 
 Em seguida, os valores de obtidos para o gene alvo, tanto para a 
amostra teste como para a calibradora, foram normalizados em relação ao 
gene de referência. Este procedimento corrige possíveis erros técnicos da 
metodologia. 
 
Normalização da amostra = valor gene alvo/valor gene de referência 
 
No exemplo, o valor normalizado para a amostra teste é 14/0,5 = 28 e 
para a amostra calibradora, 2/5 = 0,4. Os valores normalizados são então 
divididos um pelo outro para a obtenção de um valor relativo em quantidade 
entre a amostra teste e a calibradora. 
 
Valor relativo = valor normalizado amostra teste/valor normalizado amostra 
calibradora 
 
 Desta forma, o valor relativo neste exemplo é 28/0,4 = 70. Isso significa 
que o gene alvo analisado (IL-4) é 70 vezes mais expresso na amostra alvo 
(tratada) em relação à amostra calibradora (não tratada). 
 
7.2.3 Método do Ct comparativo (∆∆Ct) 
 Este método é similar ao da curva padrão relativa, porém utiliza fórmulas 
aritméticas para a obtenção dos valores relativos (método ∆∆Ct). É possível 
eliminar a necessidade da curva padrão a cada corrida e as eficiências de 
amplificação dos genes alvo e de referência devem ser próximas. A 
confirmação da compatibilidade das eficiências entre os genes analisados é 
realizada com a etapa de validação do experimento. Para isso, é feita uma 
análise para a verificação de como os valores de ∆Ct (Ctalvo – Ct referência) variam 
com a diluição seriada da amostra padrão. Sendo assim, são construídas 
curvas padrão para o gene alvo e de referência, usando sempre a mesma 
amostra padrão nas mesmas diluições. Os valores médios de Ct gerados 
(média das replicatas) são usados para o cálculo de ∆Ct, conforme 
exemplificado na Tabela 6. 
 
 
38 
 
Tabela 6 – Cálculo dos valores de ∆Ct para a validação do experimento 
Quantidade de 
RNA total (ng) 
Log da 
quantidade de 
RNA total (ng) 
Ct médio ± desvio padrão ∆Ct 
(Ctalvo – Ct referência) Gene alvo Gene de 
referência 
1,0 0,0 25,59 ± 0,04 22,64 ± 0,03 2,95 ± 0,05 
0,5 -0,3 26,77 ± 0,09 23,73 ± 0,05 3,04 ± 0,10 
0,2 -0,7 28,14 ± 0,05 25,12 ± 0,10 3,02 ± 0,11 
0,1 -1,0 29,18 ± 0,13 26,16 ± 0,02 3,01 ± 0,13 
0,05 -1,3 30,14 ± 0,03 27,17 ± 0,06 2,97 ± 0,07 
0,02 -1,7 31,44 ± 0,16 28,62 ± 0,10 2,82 ± 0,19 
0,01 -2,0 32,42 ± 0,12 29,45 ± 0,08 2,97 ± 0,14 
Modificado de: Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystems. 
 
 O desvio padrão (SD) dos valores de ∆Ct é calculado pela seguinte 
fórmula: SD (∆Ct) = (SD2(alvo) + SD2(referência))1/2. 
 
 Os valores calculados de ∆Ct são usados para a construção de uma 
curva de regressão linear em função do log da quantidade de RNA (Figura 18). 
 
 
Figura 18 – Curva para a validação do experimento. Os dados de ∆Ct foram plotados em 
função do log da quantidade de RNA. 
Modificado de: Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystems. 
 
39 
 
 O valor de slope (coeficiente angular) de uma curva ideal deve ser 
menor que 0,1. Isso indica que os primers em questão possuem eficiências 
próximas e podem ser utilizados na análise pelo método do Ct comparativo. 
 Após a validação do experimento, deve-se calcular a eficiência de 
amplificação e fixar o valor de threshold para cada par de primers. Esses 
valores são obtidosa partir da curva padrão. Deve-se ainda estabelecer a 
diluição das amostras teste a ser utilizada. Recomenda-se a utilização de uma 
diluição em que os valores de Ct encontram-se no intervalo de 15 a 31. 
Amostras muito concentradas e que apresentam um valor baixo de Ct atingem 
o plateau precocemente. Já em amostras diluídas, com Ct mais alto, observa-
se que a incidência de formação de dímeros de primers é maior. Em seguida, 
realiza-se a reação com as amostras teste na diluição definida. Recomenda-se 
manter a mesma diluição para as todas as amostras. É possível fazer a 
correção dos valores de uma amostra mais diluída ou concentrada que as 
demais, porém torna as análises mais trabalhosas e trata-se de mais uma fonte 
de erro. As reações com os genes alvo e referência devem ser analisados em 
uma mesma corrida e devem ser realizadas em replicatas, geralmente 
triplicatas. Se não houver diferenças significativas entre as replicatas 
biológicas, estas podem ser utilizadas como replicatas técnicas. Na Tabela 7 
estão exemplos de valores médios de Ct obtidos em uma análise em que os 
valores de expressão do gene alvo foram normalizados com o gene de 
referência para a obtenção do ∆Ct. Esta normalização é realizada para corrigir 
a quantidade de molécula alvo usada inicialmente. O desvio padrão (SD) do 
valor de ∆Ct é calculado pela fórmula descrita anteriormente. 
 
∆Ct = Ctalvo - Ctreferência 
 
40 
 
Tabela 7 – Valores relativos de expressão do gene alvo calculados pelo 
método ∆∆Ct 
Amostra Ct médio ± SD ∆Ct ∆∆Ct Valor relativo
alvo Referência
Não tratado 30,49±0,15 23,63±0,09 6,86±0,19 0,00±0,19 1 
Tratamento A 27,03±0,06 22,66±0,08 4,37±0,10 –2,4±0,10 5,6 
Tratamento B 26,25±0,07 24,60±0,07 1,65±0,10 –5,11±0,10 37 
Tratamento C 25,83±0,07 23,01±0,07 2,81±0,10 –3,95±0,10 16,5 
Modificado de: Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR, Applied Biosystems 
 
 Uma vez obtidos os dados de ∆Ct, os valores de ∆∆Ct são calculados. O 
∆∆Ct é a diferença entre os ∆Ct da amostra teste e da amostra calibradora 
(Tabela 7). O valor de desvio padrão do ∆∆Ct é o mesmo daquele do ∆Ct. 
 
∆∆Ct = ∆Ct (amostra teste) – ∆Ct (amostra calibradora) 
 
 O valor relativo de expressão da amostra teste em função da amostra 
calibradora é dado por 2- ∆∆Ct, com ∆∆Ct + SD∆∆Ct e ∆∆Ct – SD∆∆Ct, em que 
SD∆∆Ct é o desvio padrão do valor de ∆∆Ct. 
 Na Tabela 7, a amostra calibradora escolhida é o não tratado e, 
portanto, seu valor relativo é igual a 1. Todos os valores calculados serão 
relativos à amostra não tratado, por exemplo, o gene alvo é 5,6 vezes mais 
expresso no tratamento A em relação à amostra não tratada. Valores relativos 
abaixo de 1, quando o valor de ∆∆Ct é positivo, indicam que o gene em 
questão é reprimido em relação à amostra calibradora. 
 Existem programas que fazem a análise e já calculam estatisticamente o 
erro. Programas bem conhecidos são REST (Pfaffl et al., 2002), qBASE 
(Hellemans et al., 2007) e programas disponibilizados pelas empresas 
fabricantes de equipamentos de qPCR, como o StepOne2.1 e Data AssistTM 
(Applied Biosystems). 
 
41 
 
88.. CCOONNSSIIDDEERRAAÇÇÕÕEESS FFIINNAAIISS 
 
 A técnica de qPCR, desenvolvida no início da década de 90, hoje 
apresenta uma série de inovações que a torna mais precisa e acessível à 
comunidade científica como um método de análise simples, que não demanda 
uso de reagentes tóxicos, que pode ser altamente automatizada e com 
tendência de redução de custos. Já estão disponíveis no mercado 
equipamentos que fazem a análise em larga escala de mais de 3.000 amostras 
em uma mesma corrida, assemelhando-se a uma análise em arrays. 
 Independentemente das inovações disponíveis, a etapa mais importante 
na análise por qPCR é a de delineamento experimental, em que os objetivos 
devem ser bem traçados, bem como os tratamentos e as repetições, tanto 
técnicas como biológicas. Uma grande pergunta pode ser respondida por um 
experimento relativamente simples bem delineado. 
 Devido ao crescente número de publicações envolvendo a técnica de 
qPCR, cientistas bem conceituados na área reuniram-se para o 
estabelecimento de um guia para a publicação dos dados (Bustin et al. 2009). 
Eles denominaram-no MIQE (Minimum Information for Publication of 
Quantitative Real-Time PCR Experiments) e descrevem o mínimo de 
informação necessária para a avaliação de experimentos de qPCR. Os 
objetivos são assegurar a integridade das publicações científicas, promover 
consistência entre laboratórios e aumentar a transparência dos experimentos. 
A descrição detalhada dos reagentes utilizados, sequências e métodos de 
análises é necessária para permitir aos pesquisadores a reprodutibilidade dos 
resultados, essencial para a metodologia científica. 
 
42 
 
99.. GGLLOOSSSSÁÁRRIIOO 
 
AMPLICON: é o produto da PCR gerado a partir de um DNA ou cDNA alvo, 
 
BACKGROUND ou sinal de fundo: é o sinal de fluorescência não específico da 
reação que pode ser gerado pela fluorescência dos reagentes e tubos, excesso 
de sonda ou de molécula alvo, É calculado e matematicamente removido pelos 
softwares dos equipamentos de qPCR, 
 
CALIBRADOR: é amostra usada como base em análises de quantificação 
relativa, O resultado final será o gene A é Y vezes mais (ou menos) expresso 
em uma amostra teste em relação ao calibrador, 
 
cDNA: DNA complementar ao RNA mensageiro, 
 
CONTROLE POSITIVO: reação controle em que uma quantidade conhecida da 
molécula alvo, é usado para certificação de que os primers ou primers-sondas 
funcionam, 
 
Ct ou Cq: é o ciclo em que o sinal da fluorescência gerada pela amplificação 
cruza a linha de threshold. Os valores de Ct são dados em uma escala 
logarítmica e podem ser usados diretamente, no método de Ct comparativo, ou 
indiretamente, por interpolação dos dados a uma curva padrão para criar 
valores lineares, 
 
∆Ct: é o valor da diferença entre o Ct do gene alvo e do gene de referência. É 
usado para a normalização da quantidade de moléculas alvo utilizada 
inicialmente, ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene de referência), 
 
∆∆Ct: é a diferença entre a o valor de ∆Ct de uma amostra de interesse e da 
amostra calibradora usada na quantificação relativa, ∆∆Ct = ∆Ct (amostra teste) – 
∆Ct (amostra calibradora), 
 
43 
 
CURVA PADRÃO: curva construída com pelo menos cinco padrões em 
diluições seriadas e conhecidas. Os valores de Ct são plotados em função do 
log da quantidade da molécula alvo. Obtém-se uma reta de regressão linear de 
função linear. O coeficiente angular da reta (slope) deve estar entre -3,6 e 3,1 e 
é diretamente proporcional à eficiência de amplificação, 
 
EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO: é a taxa em que o amplicon é gerado, 
comumente medida em valor percentual. Se durante a PCR a quantidade do 
amplicon dobra na fase geométrica, a eficiência será de 100%, 
 
GENE DE REFERÊNCIA: parte de sua sequência é amplificada e usada para a 
normalização das quantidades dos alvos que estão sendo testados. É usado 
para corrigir problemas metodológicos, como erros de quantificação e 
pipetagem, É um exemplo de referência ativa, 
 
LINHA DE BASE (BASELINE): é a fluorescência de fundo emitida durante os 
primeiros ciclos antes do equipamento detectar a amplificação do produto de 
PCR pelo sinal repórter. Este ruído é ocasionado pela fluorescência emitida 
pelos reagentes da PCR, plástico e produtos estocásticos formados nos 
primeiros ciclos da PCR. O valor da linha de base é usado na normalização do 
sinal repórter, 
 
MULTIPLEX: reação de PCR em que dois ou mais pares de primers são 
utilizados simultaneamente, gerando diversosamplicons diferentes, 
 
NO AMPLIFICATION CONTROL (NAC): é uma reação controle que contém 
todos os componentes essenciais e RNA como molécula alvo. A detecção de 
amplificação nessa reação indica contaminação do RNA com DNA genômico. É 
usado como controle quando se trabalha com cDNA como molécula alvo, 
 
NO TEMPLATE CONTROL (NTC): é uma reação controle que contém todos os 
componentes essenciais para a amplificação, exceto a molécula alvo. Permite 
a identificação de contaminações, 
44 
 
PADRÃO: amostra com concentração, número de moléculas ou diluição 
conhecidas que é utilizada para a construção da curva padrão, 
 
PCR: reação em cadeia da polimerase, 
 
qPCR: PCR quantitativa em tempo real, 
 
REFERÊNCIA ATIVA: trata-se de um sinal ativo, gerado como resultado da 
amplificação por PCR, usado para normalizar os resultados do experimento. É 
o sinal gerado pela amplificação do gene de referência, 
 
REFERÊNCIA PASSIVA: é um sinal de fluorescência de referência, de 
preferência não variável, que será utilizado para a normalização do sinal 
repórter. O fluoróforo usado como referência, normalmente o ROX, não 
participa da PCR. Esta normalização corrige flutuações do sinal da 
fluorescência causada por mudanças da concentração e volume da reação. 
 
REPLICATA TÉCNICA: é a repetição de uma reação mantendo as mesmas 
condições. Usada para detecção de erros técnicos, como pipetagem, 
contaminações, problemas de leitura do aparelho etc, Recomendada em 
número ímpar, geralmente em triplicata. 
 
REPLICATA BIOLÓGICA: é a repetição do experimento biológico. Na replicata 
biológica, as condições da reação são mantidas. O que muda é o DNA ou 
cDNA alvo, Ex: tratamento com diferentes indivíduos (cada indivíduo é uma 
replicata biológica). Permite a validação estatística do experimento, 
 
Rn: é a intensidade de emissão de fluorescência repórter dividida pela 
intensidade de emissão de fluorescência passiva, 
 
Rn +: é o valor de Rn da reação que contém todos os ingredientes, inclusive a 
molécula alvo, 
 
45 
 
Rn -: é o valor de Rn de uma amostra não reagente, por exemplo, do controle 
negativo, sem molécula alvo (ou DNA), 
 
∆Rn: é a magnitude do sinal gerado pela qPCR, È calculado subtraindo-se de 
Rn+ o valor de Rn-. Esse é o valor considerado nas quantificações, 
 
RT-PCR: PCR de transcrição reversa, 
 
RT-qPCR ou qRT-PCR: PCR quantitativa em tempo real em que o alvo é o 
cDNA, gerado por uma reação de transcrição reversa, 
 
SEQUÊNCIA ALVO: sequência de DNA, cDNA, RNA ou um gene de interesse, 
 
SINAL REPÓRTER: é aquele associado à amplificação na PCR do seu alvo, 
Ex: sinal da fluorescência do SYBR Green, 
 
SLOPE: é o coeficiente angular da reta de regressão linear da curva padrão. 
Refere-se à eficiência de amplificação da PCR. Um slope de -3,222 indica uma 
eficiência de 100% (1 ou 2) em que a quantidade do amplicon dobra a cada 
ciclo da reação, 
 
TEMPERATURA DE DISSOCIAÇÃO ou melting temperature (Tm): temperatura 
em que metade dos pares de bases de uma molécula de DNA encontram-se 
desnaturados, 
 
THRESHOLD: nível do sinal repórter normalizado pela linha de base e 
referência passiva para a determinação de valores de Ct. O valor de threshold 
é traçado acima da linha de base e na fase exponencial da curva de 
amplificação. É calculado automaticamente pelos programas de análise, mas 
pode ser ajustado manualmente. 
 
46 
 
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