Anemia Infecciosa Equina: diagnostico laboratorial por Imunodifusão dupla

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1. OBJETIVOS  
Realizar imunodifusão dupla em gel de ágar para pesquisar a presença de anticorpos contra vírus 
da Anemia Infecciosa Equina em soros de animais possivelmente infectados. 
 
2. METODOLOGIA 
A Imunodifusão dupla em gel de ágar utiliza o ágar Noble a 1% (p/v) em Tampão Borato (pH 
8,6).  
Em banho de ebulição, o ágar foi fundido por 30 minutos, ou pode ser autoclavado por 15 minutos 
ou colocado em forno microondas por 3 minutos, mexendo a cada 1 minuto. O ágar fundido, após 
resfriamento até cerca de 50°­60°C foi colocado em uma lâmina de microscopia desengordurada com 
álcool, para que seja possível a fixação do ágar, com uma pipeta de vidro, colocou­se 4,5 mL  do ágar na 
lâmina. Aguardou­se o tempo de solidificação do ágar entre 15 e 20 minutos em uma câmara úmida para 
que o ágar não resseque. 
  Após o preparo do gel na lâmina, furou­se a lâmina com um furador que continha um orifício 
central e seis periféricos, de modo que os orifícios ficaram equidistantes para que a reação não apresente 
tendência para nenhum lado. Foram feitos 3 rosetas com o furador. O ágar contido nos orifícios foi 
retirado com o auxílio de uma ponteira aclopada a uma bomba a vácuo. 
  Antes de iniciar a colocação dos antígenos, anticorpos e controles foi feito um mapa da lâmina de 
forma que na hora da aplicação e do resultado fosse mais fácil visualizar a reação e os locais em que 
deveriam ser colocados as amostras e o antígeno. 
 
Imagem 1: mapa da lâmina com Ágar usada para o teste do tipo imunodifusão simples.  
Legenda: Ag corresponde ao poço do antígeno. Os números nomeiam os poços onde se  
coloca os controles e amostras.  
 
 
  A lâmina foi marcada para saber a partir de qual lado se iniciou a aplicação. Nos orifícios 
1 e 4 foram colocados os controles e nos orifícios 2, 3, 5 e 6 as amostras teste. E no orifício central 
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foi colocado o antígeno. A aplicação se iniciou com a colocação das amostras de teste, seguida 
pelos controles e por último o antígeno. 
I. Na primeira roseta foi feito o seguinte esquema: 
● Orifício central ­ Antígeno a ser testado 
● Orifício 1 ­ controle positivo 
● Orifício 2 ­ amostra 3 
● Orifício 3 ­ amostra 13 
● Orifício 4 ­ controle positivo 
● Orifício 5 ­ amostra 59 
● Orifício 6 ­ amostra 55 
 
II. Segunda roseta: 
● Orifício central ­ antígeno 
● Orifício 1 ­ Controle positivo 
● Orifício 2 ­ amostra 15 
● Orifício 3 ­ amostra 16 
● Orifício 4 ­ Controle positivo 
● Orifício 5 ­ amostra 17 
● Orifício 6 ­ amostra 23 
 
III. Terceira roseta: 
● Orifício central ­ antígeno 
● Orifício 1 ­ Controle positivo 
● Orifício 2 ­ amostra 3 
● Orifício 3 ­ amostra 7 
● Orifício 4 ­ Controle positivo 
● Orifício 5 ­ amostra 3 
● Orifício 6 ­ amostra 7 
 
  Após a aplicação as lâminas foram colocadas em câmara úmida à temperatura ambiente. 
Após 1 semana, as lâminas haviam desidratado mas haviam outras para serem analisadas, que 
foram as usadas para realizar a leitura.  
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  A análise foi feita em fundo escuro usando luz indireta para que seja possível a 
visualização de linhas de precipitação mais finas. 
 
3. RESULTADOS 
Houveram resultados positivos (formação de linha de precipitação de qualquer intensidade                     
entre o soro e o antígeno.) e negativos (ausência de linha de precipitação entre o soro e o antígeno).                                     
Nas imagens e tabelas a seguir estão os resultados para cada soro nas 3 rosetas na lâmina do teste. 
 
● Imagem 2: Ilustração demonstrativa da roseta 1. Os soros testes correspondem aoa números 1, 3 e 5. 
 Legenda: S+ significa soro controle positivo; Neg. significa Negativo; Ag significa antígeno).  
Crédito da foto: Isabela Conceição 
 
● Tabela 1: Resultados para cada reagente em relação ao antígeno na roseta 1, com identidade das linhas. 
 
 
 
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● Imagem 3: Ilustração demonstrativa da roseta 2. Os soros testes correspondem aos números 1, 3 e 5. 
 Legenda: S+ significa soro controle positivo; Neg. significa Negativo; Pos.significa Positivo; Ag significa antígeno. 
Crédito da foto: Isabela Conceição. 
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● Tabela 2: Resultados para cada reagente em relação ao antígeno na roseta 2, com identidade das linhas. 
 
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● Imagem 4: Ilustração demonstrativa da roseta 3. Os soros testes correspondem aos números 1, 3 e 5. 
Legenda: S+ significa soro controle positivo; Neg. significa Negativo; Pos.significa Positivo; Ag significa antígeno. 
Crédito da foto: Isabela Conceição 
 
 
● Tabela 3: Resultados para cada reagente em relação ao antígeno na roseta 3, com identidade das linhas. 
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4. DISCUSSÃO 
A imunodifusão dupla em gel de ágar constitui­se um teste qualitativo, ou seja, a presença ou 
ausência da linha de precipitação entre antígeno e anticorpo correspondente apresenta um resultado 
positivo ou negativo. Os casos positivos apresentaram linhas de identidade antigênica entre o antígeno 
controle e a amostra. Já os casos em que houveram negativos nas rosetas (sem formação de linha de 
qualquer intensidade) podem ter ocorrido devido a pequena quantidade de anticorpos para reagirem com o 
antígeno central, que é feito com proteínas extraídas do vírus causador da doença. 
A reação apresenta a desvantagem de haver risco de falso negativo, ou seja, a baixa sensibilidade 
em casos de quantidade baixa de anticorpos pode dar um resultado errôneo.  
 
5. CONCLUSÃO 
Após a observação dos resultados do teste percebeu­se que a linha de precipitação sempre será 
formada no controle positivo, entre o poço do antígeno e o poço do controle, e que esta linha valida o teste 
feito. 
Percebemos que as amostras 3 (da primeira roseta), 1 (da segunda roseta) e 1 (da terceira roseta) 
deram resultado positivo, o que indica que as amostras citadas são de animais que apresentam anticorpos 
contra o vírus AIE  no soro, ou seja, eles estão infectados. 
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Após a aula em questão aprendemos a realizar a imunodifusão dupla em gel de ágar e à observar 
a formação da linha de precipitação. 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
REIS, Jenner K. Roteiro da aula prática de Imunodifusão em gel de ágar, 2014. 
1 AEI, abreviação de Anemia Infecciosa Equina. 
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