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Programa de Educação Continuada a Distância Curso de DNA Forense Aluno: EAD - Educação a Distância Parceria entre Portal Educação e Sites Associados 2 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Curso de DNA Forense MÓDULO I Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores descritos na bibliografia consultada. 3 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores SUMÁRIO Módulo I Introdução Breve histórico do DNA forense Fundamentos de biologia molecular Módulo II DNA genômico x DNA mitocondrial Marcadores de variação genética Análise do DNA forense: aspectos gerais Estudo da metodologia aplicada à identificação humana Exame pericial em local de crime Módulo III Coleta do material biológico Extração de DNA Quantificação de DNA Reação de amplificação pela polimerase - PCR Módulo IV Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA Gel de agarose Gel de poliacrilamida Eletroforese capilar 4 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Módulo V Interpretação dos resultados Análise de outros perfis genéticos Cromossomo Y DNA mitocondrial Controle de qualidade dos laboratórios Controle de qualidade externo: testes de proficiência em genética forense Considerações finais Glossário Referências bibliográficas 5 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores MÓDULO I Introdução A identificação humana pelo estudo do perfil genético é amplamente utilizada em casos de caracterização de vínculo genético familiar, seja em processos cíveis (ex.: exclusão ou não da paternidade), como também em processos criminais (ex.: cadáveres e materiais biológicos encontrados na cena do crime). Atualmente, a mídia tem contribuído de forma significativa para a divulgação e popularização dessa tecnologia, que vem evoluindo sobremaneira nas últimas duas décadas. No entanto, algumas considerações sobre essa tecnologia não passam de mito, pois não se pode concluir que “o DNA resolve tudo”, mas que a análise do perfil genético pode auxiliar na identificação humana fazendo parte das provas periciais de um determinado caso criminal ou civil. Segundo Butler (2005), os testes de DNA para identificação humana podem ser utilizados para: Casos forenses: análise do DNA do suspeito com aquele obtido da evidência biológica encontrada na cena do crime ou nas vítimas; Teste de paternidade ou caracterização de vínculo genético familiar: exclusão ou não de supostos pais, filhos, mães e outros membros da família; Desastres em massa: identificação dos fragmentos humanos e dos corpos encontrados em um desastre com inúmeras vítimas; Investigações históricas; Investigações de pessoas desaparecidas; 6 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Identificação de militares; Banco de DNA de criminosos ou de evidências biológicas. Para isso, é necessário que alguns conhecimentos sejam adquiridos para sua posterior realização laboratorial. Tais conhecimentos teóricos serão ensinados nesse curso, que englobará desde os fundamentos básicos da biologia molecular até a elaboração de protocolos para a realização do estudo do DNA forense. 7 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Breve Histórico do DNA Forense Antes da utilização do DNA para identificação humana, os genes e suas estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente descrito a seguir: 1856-1863: Gregor Mendel Figura 1: Gregor Mendel → Considerado o “pai da genética moderna” → Estabeleceu as regras da herança genética → Realizou experimentos com 21.000 plantas híbridas para estabelecer o conceito de herança genética (Figura 2). 8 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 2: Resumo dos experimentos realizados por Mendel, com diversos tipos de plantas e sua herança genética, com a presença de genes dominantes YY e recessivos yy. 1900-1933: Thomas Hunt Morgan (Figura 3) Figura 3: Thomas Hunt Morgan contribuiu para a genética moderna ao descobrir a herança cromossômica e a recombinação genética. 9 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores → Descobriu a herança cromossômica (Figura 4) e a recombinação genética, na qual os ocorre a troca de fragmentos cromossômicos antes da divisão celular (Figura 5). Figura 4: Representação esquemática dos resultados dos experimentos de Morgan: herança de genes ligados ao cromossomo X. Figura 5: Esquema ilustrativo do método de recombinação genética dos cromossomos. 10 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores 1944: Avery, MacLeod e McCarty (Figura 6) → Atribuíram ao DNA a herança genética Figura 6: Fotografias dos pesquisadores que estudaram a herança genética do DNA. 11 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Grupos sanguíneos: Antes dos testes utilizando-se ácidos nucléicos, muitos tipos de exames sanguíneos eram utilizados para auxiliar na investigação de paternidade. Esses testes, baseados em diferentes sistemas de grupos sanguíneos ofereciam resultados de até 70 a 90%, se todos fossem analisados e combinados. Os grupos sanguíneos recomendados pela Associação Médica Americana eram os sistemas eritrocitários: ABO, Rh, MNs, Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguíneo leucocitário HLA (PAGE-BRIGHT, 1982). 1953: James Watson e Francis Crick (Figura 7). → Descoberta da estrutura do DNA (Figuras 8 e 9) Figura 7: Watson e Crick. 12 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 8: Fórmula química de uma cadeia simples de ácido nucléico e diagrama da molécula de DNA. Figura 9: Modelo original da molécula de DNA descrita por Watson e Crick em 1953.13 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores 1985 – Alec Jeffreys (Figura 10): Figura 10: Alec Jefreys em seu laboratório – a origem da análise do perfil de DNA. → DNA fingerprint ou impressão digital de DNA (Figura 10 e 11) foi descrito pela primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a análise do DNA visando a caracterização de vínculo genético. A identificação das regiões polimórficas é realizada empregando-se Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (Restriction Fragment length polymorphism – RFLP), no qual o DNA é submetido à digestão utilizando-se enzimas de restrição específicas que cortam a dupla fita de DNA em regiões determinadas. Os fragmentos são separados eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um processo denominado Sourthen blotting. Mediante a presença de uma solução de hibridização com sondas específicas contendo fósforo radioativo, os fragmentos de DNA fita simples irão 14 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores hibridizar e aqueles não correspondentes serão removidos. Após a autorradiografia, os VNTRs poderão ser visualizados para análise (Figura 11 e 12) (COMMITTEE ON DNA TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992; JEFFREYS, 1985). Figura 11: Análise da impressão digital de DNA por Alec Jeffreys. 15 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 12: Representação esquemática da análise de Repetições Consecutivas de Número Variável ou VNTR. Desde então, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a análise de Repetições Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por gel de poliacrilamida corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados por equipamentos semiautomáticos que utilizam gel de poliacrilamida e realizam a leitura por laser dos fragmentos amplificados pela PCR com iniciadores marcados com fluoróforos que emitem fluorescência (Kimpton et al, 1993; Gill et al, 1995). Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) é amplamente utilizada e possui o mesmo princípio que a eletroforese em gel analisados por laser, com a 16 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores diferença de que possui capilares para a separação eletroforética dos fragmentos de DNA (Butler, 2005). Há também relatos da utilização de microchips de DNA para a análise de STRs (Radtkey et al, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al, 2005), podendo também ser um potencial para a análise futura dos STRs (Figura 13). Figura 13: Eventos históricos no mundo e no Brasil relacionados à análise de DNA forense. O Projeto Genoma concluído agora pode identificar pelo sequenciamento do DNA humano a localização de genes, revelando que há provavelmente cerca de 20.500 genes humanos. Tal fato revelou ao mundo informações detalhadas sobre a estrutura, organização e funcionamento do conjunto completo de genes humanos. O Consórcio 17 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Internacional para Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunho do genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequência de todo o genoma de três milhões de pares de bases, cerca de 90% completo. A surpreendente conclusão desta primeira versão era de que o número de genes humanos pareceu ser significativamente menor do que estimativas anteriores, a qual variou de 50.000 genes a 140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). A sequência completa foi concluída e publicada em abril de 2003. Após a publicação da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, diretor do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human Genome Research Institute – NHGRI), observou que o genoma poderia ser pensado em termos de um livro com várias utilizações: “Trata-se de um livro de história, uma narrativa da viagem da nossa espécie através do tempo. É um trabalho manual, com um projeto para construção incrivelmente detalhado de cada célula humana. E é um livro-texto transformador da medicina, com informações que darão aos profissionais da saúde novos poderes para tratar, prevenir e curar as doenças” (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). As ferramentas criadas através do Projeto Genoma também estão sendo utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados extensivamente em pesquisa biológica como ratos, moscas e frutas. Tal pesquisa é importante porque a maioria dos organismos tem genes muito semelhantes ou “homólogos”, possuindo funções similares. Estes objetivos são necessários e continuarão a exigir uma variedade de novas tecnologias que tornarão possível e relativamente rápido construir um primeiro esboço do genoma humano, assim como aperfeiçoar este projeto (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 18 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores As técnicas utilizadas no projeto genoma incluem: → Sequenciamento de DNA; → O emprego da técnica de análise de Fragmentos de Restrição dos Polimorfismos de Comprimento (RFLP); → Cromossomos artificiais em levedura (YAC); → Cromossomos artificiais em bactéria (TAS); → A reação em cadeia da polimerase (PCR); → Eletroforese. Fonte: An Overview of the Human Genome Project. Disponível em http://www.genome.gov/12011238 19 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Fundamentos de Biologia Molecular O DNA (ácido desoxirribonucléico) armazena toda a informação genética, sendo encontrado nos cromossomos do núcleo e nas mitocôndrias, a maior parte localizada no primeiro (Figuras 14 e 15). Figura 14: A célula é a unidade básica de todos os indivíduos vivos. 20 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 15: DNA a molécula da vida: do cromossomo a cadeia dupla de DNA. 21 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores O DNA pode ser extraído de amostras de sangue, de esfregaços bucais, de saliva, de osso, de dente, de tecidos e órgãos, de fios de cabelos, de sêmen, entre outros materiais biológicos (Brettell et al, 2005) (Figura 16). Figura 16: Amostras biológicas para análise do DNA forense. 22 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores As moléculas de DNA caracterizam-sepor polímeros de alto peso molecular, compostos de unidades básicas de nucleotídeos contendo 2-desoxirribose ligados entre as posições 3’ e 5’ de carbonos por ligações fosfodiéster. A estrutura do DNA é uma dupla hélice de cadeias complementares opostas, na qual as duas moléculas são mantidas juntas por fracas pontes de hidrogênio (Figuras 17 e 18) (Watson & Crick, 1953). A) 23 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores B) Figura 17: A) Representação esquemática da dupla hélice da molécula de DNA segundo Watson & Crick, 1953; B). Estrutura química da molécula de DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3’ com o carbono 5’. As bases C e G são ligadas por três pontes de hidrogênio e as A e T, por duas. 24 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 18: Representação esquemática da molécula de DNA. A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de duas ou três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina - T, citosina - C e guanina – G ou g) (Figura 19), ao se ligarem com o açúcar, constituem o nucleosídeo; sendo que o último ligado com um grupamento fosfato, constitui o nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953) (Figura 20). 25 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 19: Estrutura química das bases nitrogenadas e suas respectivas pontes de hidrogênio. 26 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 20: O nucleotídeo e par de bases (“base pair” - bp) Determinados fragmentos de DNA especificam a síntese de RNA em um processo denominado transcrição. O ácido ribonucléico (RNA) é um polímero linear composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas posições 3’ e 5’ por intermédio de grupamentos fosfodiéster, tendo como função a síntese protéica e também pode constituir o genoma de alguns vírus. O gene é uma unidade de transcrição que consiste de um segmento de DNA específico que se estende do início do sítio de transcrição ao sítio de término de transcrição. O RNA especifica a síntese de polinucleotídeos que formarão as proteínas, sendo tal processo denominado tradução, ocorrendo nos ribossomos, nas mitocôndrias e cloroplastos (Figuras 21, 22 e 23) (Beard & Armentrout, 1967; Srinivasan & Yathindra, 1977). 27 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 21: Fluxograma da transcrição e translação. 28 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 22: Mecanismo de produção de aminoácidos pelas células. 29 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 23: Ilustração da transcrição e translação. As regiões de um gene que codificam proteínas são denominadas éxons e aquelas que não a realizam, íntrons. Cada éxon codifica uma porção específica da proteína completa. Em algumas espécies, incluindo a humana, os éxons são separados por longas regiões de DNA denominadas íntrons ou DNA “lixo”, que aparentemente não estão associadas à codificação de DNA (National Human Genome Research Institute, 2008) (Figura 24 e 25). 30 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 24: Diferenças entre os éxons e íntrons. Observe a remoção da parte amarela, correspondente ao íntron. 31 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 25: Diferenças entre os éxons e íntrons. 32 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Os alelos constituem as variantes de um gene em uma região particular, ou lócus, em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variações nas características individuais como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo sanguíneo (National Human Genome Research Institute, 2008) (Figura 26). Figura 26: Alelos correspondentes à cor dos olhos, ligados ao cromossomo X. 33 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A duplicação celular ocorre através da mitose (Figura 27) e a formação de gametas masculinos e femininos ocorre através da meiose (Figura 28). Figura 27: A mitose é responsável pelo crescimento e desenvolvimento dos indivíduos, bem como a reposição de células injuriadas ou destruídas do corpo. 34 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 28: A meiose é um processo de divisão celular pelo qual uma célula diplóide (pares de cromossomos, sendo um materno e outro paterno) origina quatro células haplóides (um cromossomo), reduzindo à metade o número de cromossomos constante de uma espécie. 35 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A transferência das informações genéticas de uma geração a outra ocorre através da replicação do DNA, catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas enzimas mediam a síntese da nova fita de DNA in vivo, utilizando como molde (template) a fita complementar da molécula existente. Inicialmente, a molécula de DNA tem as suas fitas separadas pelo rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm a dupla hélice, em um processo denominado desnaturação, que ocorre in vivo em pH alcalino. Além da fita molde, é necessária a presença de um oligonucleotídeo iniciador ou primer, ou seja, um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita molde, desoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que serão incorporados à fita duplicada. A replicação do DNA ocorre em regiões específicas denominadas origem de replicação (Marmur & Doty, 1959). Sucintamente, a replicação ocorre com a adição de um nucleotídeo à fita de DNA pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último nucleotídeo presente na cadeia replicada. Por esse motivo, descreve-se que a síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´ (Figura 29) (Marmur & Doty, 1959;). Todo o processo descrito acima será a base do princípio da amplificação do DNA in vitro denominada reação em cadeia pela polimerase (PolymeraseChain Reaction – PCR), que será estudado nos tópicos adiante. 36 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 29: Posição 5´- 3´das fitas de DNA. ----------------FIM DO MÓDULO I---------------
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