Fisiologia dos fungos

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FISIOLOGIA DE FUNGOS
Prof. Sidney T.G. Bastos
Dept. de Micologia/CCB/UFPE
	Fungos filamentosos são organismos cuja parede celular é constituída por celulose ou quitina. Constituem um grupo de organismos a parte, Reino Fungi, uma vez que não ingerem alimentos (como os animais) e nem produzem o seu próprio alimento através de pigmentos fotossintéticos (como as plantas). Os fungos secretam enzimas sobre seus substratos que atuam sobre moléculas grandes e complexas quebrando-as em substâncias menores prontamente assimiláveis através da parede celular.
	Fisiologicamente os fungos se adaptam a condições mais severas do que a maioria dos microorganismos:
	a. podem crescer em substratos com concentração de açúcar intolerável para as bactérias, uma vez que não são muito sensíveis as altas pressões osmóticas;
	b. podem tolerar e crescer em altas concentrações de ácidos, suportando variações de pH entre 2 e 9, embora o ótimo para a maioria esteja situado em torno de 5,6;
	c. podem sobreviver em ambientes bastante secos que inibiriam as bactérias não esporuladas. Quando ocorre condição adversa de umidade (ambiente seca), os fungos produzem esporos ou entram em estado de vida latente;
	d. podem desenvolver-se em uma ampla faixa de temperatura (0 a 62°C), embora o ótimo esteja entre 22 a 30°C, para a grande maioria.
NUTRIÇÃO
	As necessidades nutricionais por elementos essenciais podem ser divididos em duas grandes categorias:
	a. macronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-3 M, aproximadamente.
	b. micronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-6 M ou menos.
	Entre os macronutrientes (C, H, O, N, P, K, N, S, Mg e Ca) o carbono é o principal elemento requerido uma vez que este elemento faz parte de substâncias estruturais dos fungos em combinação, principalmente, com hidrogênio, oxigênio e nitrogênio.
	Os elementos minerais essenciais aos fungos estão resumidos nas tabelas a seguir (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1. Macronutrientes minerais essenciais aos fungos (Griffin, 1994).
	Elemento
	Forma utilizada
	Concentração requerida (M)
	Função
	K
	KCl
K2HPO4
	10-3
	Atividade enzimática; metabolismo de carboidratos; balanço iônico.
	P
	KH2PO4
	10-3
	Composição de ácidos nuclêicos; transferência de energia; metabolismo intermediário.
	Mg
	MgCl2
MgSO4
	10-3
	Ativação enzimática; metabolismo de ATP.
	N
	NaNO3
NH4Cl
	10-3
	Constituinte de aminoácidos, nucleotídeos e vitaminas.
	S
	K2SO4
	10-4
	Constituinte de aminoácidos (metionina, cisteína e cistina).
	Ca
	CaCl2
	10-4 a 10-3
	Ativador enzimático; estrutura de membranas; não universalmente requerido.
Tabela 2. Micronutrientes minerais essenciais aos fungos (Griffin, 1994).
	Elemento
	Forma utilizada
	Concentração requerida (M)
	Função
	Fe
	FeCl3
Fe citrato
	10-6
	Constituinte de citocromo, pigmentos e apoenzimas.
	Cu
	CuSO4
	10-6 a 10-7
	Ativação enzimática; biossíntese de pigmentos.
	Mn
	MnCl2
	10-7
	Ativador de enzimas; atuação no ciclo dos ácidos tricarboxílicos; atuação na síntese de ácidos nucleicos.
	Zn
	ZnCl2
	10-8
	Ativação enzimática; metabolismo intermediário dos ácidos orgânicos.
	Mo
	Na2MoO4
	10-9
	Ativação enzimática; metabolismo de nitratos.
	1. NITROGÊNIO E OXIGÊNIO
	Nitrogênio na forma de nitrato é a fonte mais utilizada, entretanto, muitos fungos não podem utilizá-lo.
	Outra forma utilizável de nitrogênio é a amônia (NH3). Contudo, quando sais de amônia (NH4NO3, (NH4)2SO4 ou NH4Cl) são adicionados ao meio de cultura ocorre, geralmente, uma queda acentuada do pH. Este fato decorre da utilização preferencial do cátion amônia, o que pode refletir no crescimento fúngico (redução do crescimento, por exemplo).
	A maioria dos fungos são aeróbicos ou microaerófilos e, portanto o seu crescimento é estimulado pelo fornecimento de oxigênio.
	2. CARBONO
	Os fungos, patogênicos ou saprófitas, utilizam carbono e energia de uma grande variedade de compostos produzidos por organismos vivos.
	A capacidade dos fungos em utilizar estes compostos depende de três processos diferentes:
	a. digestão de materiais oligo e poliméricos,
	b. transporte de monômeros através da plasmalema e
	c. fosforilação dos carboidratos.
	A glicose é a principal fonte de carbono para praticamente todas as espécies fúngicas. Até certo ponto, isto não surpreende, pois muitos açúcares comuns são à base da celulose (glicose beta-1,4), amido (glicose alfa-1,6 e alfa-1,4) e de outros carboidratos.
	Existe uma controvérsia sobre a capacidade de utilização da glicose por Leptomitus lacteus e Araiospora spp. (Ordem Leptomitales).
	Os açúcares frutose e manose, após a glicose, são os mais utilizados pelos fungos, seguidos da galactose. Entretanto, geralmente, existe um período de adaptação antes do crescimento iniciar, mas após este período o crescimento é, particularmente, tão rápido e extenso quanto com glicose (ver curva de crescimento fúngico). Isto pode ser observado durante a fase de adaptação de Allomyces macrogynus. O crescimento, durante a fase de adaptação, foi retardado com manose e frutose, contudo, uma vez iniciado, a taxa de crescimento foi aproximadamente igual que com glicose. A adição de uma pequena quantidade de glicose, a fim de iniciar o crescimento, diminuiu a fase de adaptação permitindo o início do crescimento e proporcionando material e energia suficientes para a indução de enzimas que assimilam a manose. Deste modo, ocorre crescimento rápido sem a existência de uma fase de adaptação longa e irregular observada na ausência de glicose.
	A utilização de manose e frutose segue claramente o modelo de formação de enzimas indutivas (sistema indutivo: enzimas que são sintetizadas somente em resposta a presença de certos substratos). O sistema enzimático para assimilação da glicose é do tipo constitutivo (sistema constitutivo: enzimas que estão sempre presentes em quantidades quase constantes em uma célula) e, portanto, não existe um período de adaptação para o crescimento fúngico iniciar.
	Ao iniciar um estudo com um determinado fungo sobre o qual não há nenhuma informação nutricional, a glicose deve ser escolhida como a fonte mais provável de utilização de carbono pelo fungo.
	Os compostos de carbono tem duas funções essenciais no metabolismo fúngico:
	a. proporcionar o carbono necessário para a síntese de compostos celulares (proteínas, aminoácidos, ácidos nuclêicos, substâncias de reserva, etc.) e,
	b. proporcionar quantidades apreciáveis de energia através do processo de oxidação dos compostos de carbono.
	Fungos que utilizam dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos para o seu crescimento requerem a síntese de enzimas indutivas e, portanto, a curva de crescimento mostrará um período de adaptação antes do crescimento ser iniciado.
	Muitas fontes de carbono são estáveis ao calor, contudo, podem ser significativamente, alteradas por reações com outras substâncias que entram na composição do meio de cultura e, portanto, devem ser esterilizadas separadamente. A sacarose pode ser hidrolisada em pH levemente ácido enquanto que a inulina, um polímero de frutose, é degradada durante a autoclavagem.
	Experimentos sobre a utilização de compostos como única fonte de carbono e energia são geralmente monofatoriais, isto é, os compostos são testados separadamente. Experimentos monofatoriais não são naturais, os fungos no ambiente vivem sobre uma mistura de substratos potencialmente fornecedores de carbono e energia.
	A habilidade de um fungo utilizar um composto como única fonte de carbono e energia pode di-
ferir de sua habilidade para usar este mesmo composto quando em conjunto com outro.
	Em estudos envolvendo a utilização de uma mistura de compostos foram observados que:
	a. a glicose tem efeito repressivo e inibidor sobre a utilização de outras fontes de carbono (a glicose é utilizada em primeiro lugar sendo que a utilização do segundo composto é retardada até a glicose ser totalmenteconsumida).
	b. compostos que são pouco utilizados ou não utilizados como única fonte de carbono podem ser usados quando misturados com outros.
	Em um estudo realizado com Sporotrichum termophile sobre a utilização de glicose e de outros substratos, concluiu-se que:
	a. o fungo crescendo em meio com glicose apresenta um baixo nível de atividade celulase;
	b. o fungo crescendo em substrato que não celulose ou celobiose, apresentou atividade celulase 2 a 10 vezes maior, sugerindo um certo grau de desrepressão na ausência de glicose;
	c. celulose e celobiose, contudo, atuam como verdadeiros indutores resultando em atividade celulase 100 vezes maior quando presentes como única fonte de carbono;
	d. quando o fungo cresce em meio com celobiose, a adição de glicose resulta em uma parada imediata da utilização de celobiose (o efeito da glicose na repressão da síntese enzimática é geralmente denominada de repressão catabólica).
	Por outro lado, as ligninas parecem ser usadas somente na presença de outros compostos. Embora, muitos fungos sejam capazes de degradar as ligninas a CO2, são incapazes de utilizá-las como única fonte de carbono e energia. Entretanto, podem degradar a lignina somente na presença de uma outra fonte de carboidrato como a celulose, celobiose ou glicose. A habilidade para metabolizar um composto somente na presença de outro é conhecida como cometabolismo.
	Um outro ponto de grande interesse na assimilação de carbono é a eficiência de conversão do substrato em micélio.
	Eficiência sintética é o quociente, expresso em %, entre o peso seco do micélio e o peso da fonte de carbono consumida. Substrato consumido pode ser convertido em micélio, CO2 e vários produtos metabólicos de interesse industrial (álcool, ácidos orgânicos, polissacarídeos extracelulares e outros metabólitos secundários). Eficiência sintética tem grande importância para a indústria de fermentação, onde o principal interesse está na produção de metabólitos fúngicos de uso comercial.
	3. VITAMINAS E FATORES DE CRESCIMENTO
	Compostos orgânicos que são requeridos em quantidades diminutas para o crescimento fúngico podem ser denominados de vitaminas ou fatores de crescimento.
	Alguns autores fazem distinção entre estas duas categorias. As vitaminas (Tabela 3) são geralmente requeridas em concentrações micromolares a nanomolares e atuam como coenzimas enquanto que, fatores de crescimento são requeridos em concentrações mais altas, acima de 100 M e atuam como elementos estruturais (aminoácidos, bases púricas e pirimídicas).
Tabela 3. Algumas vitaminas requeridas por fungos (Griffin, 1994).
	Vitaminas
	Concentração requerida (M)
	Função
	Forma ativa
	Tiamina (B1)
	10-9 a 10-6
	cocarboxilase
	Tiamina pirofosfato
	Piridoxina (B6)
	10-9 a 10-7
	Coenzima para
transaminações
	Piridoxal e piridoxamina fosfato
	Riboflavina (B2)
	10-7 a 10-5
	Coenzima para
dehidrogenases
	Flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD)
	Ácido nicotínico (B3), nicotinamida e niacina
	10-8 a 10-7
	Coenzima para
dehidrogenases
	Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) e NAD fosfato (NADP)
	Ácido p-amino benzóico
(PABA)
	10-8 a 10-6
	Coenzima na transferência de 1 C
	Ácido tetrahidrofólico
	Ácido pantotênico (B5)
	10-7
	Coenzima na transferência de 2 C
	Coenzima A
	Cianocobalamina (B12)
	10-12 a 10-6
	Coenzima na transferência de CH3
	Vários derivados da cobalamina
	Um fungo é chamado de auxotrófico quando requer uma determinada substância para o seu crescimento e de prototrófico quando o próprio fungo pode sintetizar a substância necessária para o seu crescimento.
	Alguns fungos apresentam um requerimento absoluto por uma determinada vitamina sob condições específicas:
	a. Myrothecium sp requer biotina para germinação do esporo, mas o micélio é prototrófico.
	b. Histoplasma sp requer tiamina e biotina na fase leveduriforme, mas na fase micelial é prototrófico.
	c. Mucor rouxii requer tiamina e ácido nicotínico sob condições anaeróbicas, mas é prototrófico sob condições aeróbicas.
	d. Pythium sp torna-se auxotrófico para tiamina quando a concentração de sal alcança um certo nível no meio de cultura.
	A temperatura, geralmente, afeta o requerimento por vitamina. Alguns mutantes de Neurospora crassa quando cultivados em temperaturas inferiores à 25°C são prototróficos, contudo, quando cultivados em temperaturas superiores a 28°C requerem riboflavina.
	4. ÁGUA
	Os fungos, de modo semelhante a todos os organismos, requerem água em alta quantidade, contudo, o requerimento por água não é nutricional. A água é utilizada como solvente (as enzimas não apresentam atividade na ausência de água, por exemplo).
	O movimento da água dentro e fora da hifa ocorre por difusão, em resposta a gradientes físico-químicos, através da plasmalema que é semipermeável. Este processo é denominado de osmose.
	Vários pesquisadores têm utilizado uma série de termos para descrever as forças que estão envolvidas no movimento da água (pressão osmótica, potencial osmótico e atividade de água).
	A umidade relativa e a atividade de água estão relacionadas com a pressão de vapor da água em solução e água pura através das fórmulas:
	UR = 100 P/Po,
	onde UR é a umidade relativa da atmosfera em equilíbrio com a solução, P é a pressão de vapor da água em solução e Po é a pressão de vapor da água pura.
	Aw = P/Po,
	onde Aw é a atividade de água (water activity).
	Agregando-se as duas fórmulas temos:
	UR = 100 Aw ou Aw = UR/100.
	Fungos que tem a capacidade de crescer em Aw (Tabela 4) baixo são denominados de xerotolerantes. Estes fungos são extremamente importantes na indústria de alimentos como agentes de deterioração.
Tabela 4. Valores de Aw para crescimento de alguns microorganismos.
	Aw
	Bactérias
	Leveduras
	Fungos filamentosos
	1,0
	Caulobacter, Spirillum
	-
	Mastigomycota
	0,90
	Lactobacillus, Bacillus
	Ascomycetes
	Fusarium
	0,80
	-
	Debaryomyces
	Penicillium
	0,75
	Bactérias halofílicas
	-
	Aspergillus
	0,60
	-
	Saccharomyces rouxii, Xeromyces bisporus
	-
	0,55
	Abaixo deste valor ocorre desnaturação do DNA
	5. HIDROGÊNIO
	Não há muito o que comentar sobre os efeitos do íon hidrogênio sobre o crescimento de fungos devido aos experimentos serem realizados de forma inadequada. Em vários experimentos o pH é ajustado inicialmente e o pH final é ou não relatado, portanto, os resultados são freqüentemente analisados com base em um único ponto durante o período de incubação. Por outro lado, os fungos alteram o pH do meio de cultura de forma drástica durante o seu crescimento, tornando difícil o controle do pH.
	Estas alterações de pH podem ser causadas pela assimilação diferencial de cátions e ânions do meio de cultura ou mesmo através da produção de ácidos orgânicos que são liberados para o meio de cultura. Por exemplo, o íon NH4+ é assimilado como NH3 liberando H+ para o meio de cultura tornando-o ácido ou, ânions de sais orgânicos são assimilados como ácidos livres tomando um próton da água e liberando um OH- para o meio, tornando-o básico.
	O uso de tampões para controlar o pH é geralmente dificultado devido à limitada efetividade do tampão, normalmente pK = ± 0,5 pH.
	A despeito destas limitações, os fungos crescem adequadamente quando o pH inicial é ajustado para uma faixa de 4 a 7.
AMBIENTE FÍSICO E CRESCIMENTO
	Além do conhecimento sobre os nutrientes apropriados para os fungos, há necessidade de se conhecer em que condições físicas ambientais ocorre o crescimento fúngico mais adequado.
	Assim como os fungos variam amplamente quanto às exigências nutricionais, também demonstram os mais diferentes tipos de respostas às condições físicas do ambiente. Em outras palavras, o êxito no processo de crescimento de uma cultura fúngica requer uma combinação adequada de nutrientes e fatores físicos.
	Fatores físicos ambientais que afetam o crescimento fúngico são temperatura, luz e outras formas de radiação, gravidade,pressão hidrostática e viscosidade. Existem pouquíssimos estudos sobre os três
últimos fatores.
	O fator mais importante em determinadas condições, o mais estudado ao longo dos anos e o que tem maior quantidade de dados é a temperatura.
	A luz tem mais efeito sobre a reprodução dos fungos do que sobre o crescimento. Outras formas de radiação tem a sua utilização em condições específicas e o interesse maior reside nas radiações mutagênicas (raios gama, X e ultravioleta).
	1. TEMPERATURA
	Geralmente são utilizados três parâmetros para descrever a influência da temperatura sobre o crescimento dos fungos: mínimo, ótimo e máximo.
	Existem muitos estudos sobre o ótimo de temperatura para o crescimento fúngico e pouco interesse para as condições extremas de temperatura (mínima e máxima)
	Os fungos podem ser classificados de acordo com a temperatura para o seu crescimento em:
	a. psicrófilos: não crescem acima de 20°C, têm um mínimo abaixo de 0°C e um ótimo entre 0 e 17°C.
	b. mesófilos: têm um mínimo acima de 0°C, máximo abaixo de 50°C e um ótimo entre 15 e 40°C.
	c. termófilos: têm um mínimo de ou acima de 20°C e um máximo de ou acima de 50°C.
	Alguns fungos podem situar-se entre uma classe e outra de acordo com suas exigências em termos de temperatura. Por exemplo, Aspergillus fumigatus que cresce numa faixa de 12 a 52°C é classificado como mesófilo termotolerante.
	A maioria dos fungos crescem numa ampla faixa de temperatura, de 0 a 62°C, com um ótimo variando entre 22 e 30°C.
	2. CRESCIMENTO FÚNGICO
A curva hipotética de crescimento dos fungos pode ser vista na figura abaixo (Figura 1).
Figura 1. Curva típica de crescimento fúngico.
 peso
 seco
 (mg) fase
 log
 fase de fase
 declínio estacionária
 fase
 lag fase de morte
 (autólise)
 tempo (h)
	2.1. FASE LAG (fase de adaptação – lag phase)
	Quando o inóculo (esporos ou fragmentos de hifas) é transferido para um novo meio de cultura e incubado em condições favoráveis, o crescimento não ocorre imediatamente. Existe, geralmente, um período denominado de fase lag, que varia com as espécies fúngicas, com a natureza do inóculo e com as condições nutricionais do meio de cultura. Nesta fase, não ocorre crescimento visível.
	Quando o inóculo consiste de esporos, esta fase é o período necessário para ocorrer a germinação dos esporos. Quando são utilizados fragmentos de hifas como inóculo, por estarem, geralmente, danifica-
das, há necessidade de um período de tempo para que o crescimento possa iniciar.
	Os fatores nutricionais podem afetar a duração da fase lag. Em Allomyces sp a concentração baixa de ácido glutâmico no meio de cultura, apesar de estimular o crescimento tem como efeito principal a redução do comprimento da fase lag. Por outro lado, Giberella sp não apresenta a fase lag, contudo, a utilização de acetato de amônia como fonte de nitrogênio ou alta concentração de glicose provoca o aparecimento da fase lag.
	Entre os fatores físicos, a temperatura também pode atuar na duração da fase lag. Temperatura abaixo do ótimo aumenta o período de duração da fase lag.
	2.2. FASE LOG (fase exponencial ou logarítmica – exponential or logarithmic phase)
	Esta fase é marcada por uma taxa de crescimento acelerado na qual o logaritmo do peso seco fornece uma reta com o tempo de incubação.
	A fase log é fortemente afetada pelo suprimento de nutrientes. Outros fatores podem também afetar a taxa de crescimento nesta fase (culturas fúngicas agitadas em agitador crescem significativamente mais rápido que culturas estacionárias).
	2.3. FASE DE DECLÍNIO (decline phase)
	A fase de declínio é provocada pela exaustão de alguns nutrientes que se tornam limitantes ou, ainda, pelo acúmulo de substâncias tóxicas produzidas pelo fungo durante a fase log.
	Em Giberella fujikuroi foi observado que a exaustão de nitrogênio marcou o fim da fase log e, que o aumento de peso seco foi devido, principalmente, ao acúmulo de carboidratos e lipídeos.
	2.4. FASE ESTACIONÁRIA E DE MORTE (stationary and death phase)
	Nesta fase cessa o aumento de peso seco, embora continue ocorrendo utilização de glicose pelo fungo. A paralisação completa da utilização de glicose resulta em autólise e, consequentemente, morte da cultura.
LITERATURA RECOMENDADA
BLACK, J.G. Microbiologia – Fundamentos e Perspectivas. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. 2002.
GRIFFIN, D.H. Fungal Physiology. New York, John Wiley & Sons. 1994. 458 p
LEHNINGER, A.L. Biochemistry. New York, Worth Publishers. 1976. 1104 p.
ROBINSON, P.M. Practical Fungal Physiology. New York, John Wiley & Sons. 1978. 123 p