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CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E ANÁLISE DE ADULTERAÇÃO DO LEITE Bruna Caroline Pontes¹, Judá de Andrade Alves¹. ¹Estudante de graduação do curso de Engenharia de Alimentos - UFC Resumo O objetivo desse artigo é apresentar as análises realizadas para avaliar as características físico-químicas de uma determinada amostra de leite, identificando seu tipo, e verificar a presença de possíveis substâncias não permitidas, como espessantes e estabilizantes, caracterizando adulteração. As principais análises realizadas para a verificação das características físico-químicas foram: acidez, pH, ponto de congelamento, densidade, teor de gordura, prova da peroxidase e determinação do extrato seco e desengordurado. Esses parâmetros devem atender à Legislação, conforme a Instrução Normativa 62, de 29 de dezembro de 2011. Para verificar possíveis adulterações na amostra, foram realizadas as seguintes análises: Teste de Alizarol, medição do índice crioscópico, determinação da densidade, verificação da presença de cloro e hipoclorito, determinação de cloretos, análise da presença de substâncias alcalinizantes e verificação da presença de água oxigenada. Foi possível concluir, através da realização das análises, que a primeira amostra de leite foi pasteurizada. Das análises de fraudes realizadas, a única observada no leite foi a adição de água sanitária,tornando impróprio para consumo. Palavras-chave: leite; composição; fraude; água sanitária. 1. Introdução O leite é um alimento amplamente consumido mundialmente, e a detecção da ocorrência de fraudes é de suma importância para assegurar a qualidade do leite que chega ao consumidor, como alimento saudável e nutritivo, e para garantir o correto rendimento e as boas condições dos produtos derivados. A Instrução Normativa nº 62 (BRASIL, 2011) estabelece as características físico-químicas e valores a serem respeitados do leite cru destinado ao processamento, bem como os métodos de referência para a análise. As principais análises realizadas para verificar as características físico-químicas do leite são o Teste de Alizarol, a análise de Acidez Dornic, a determinação do índice crioscópico, a medição do pH, as determinações da densidade e do teor de gordura, o Extrato Seco Total e Desengordurado e a prova da peroxidase. (VENTURINI et al., 2007). A legislação brasileira considera como fraude de produtos alimentícios um procedimento astucioso, destinado a mascarar as características do produto ou enganar o consumidor. A adulteração pode ser considerada uma prática que pode ser realizada de diversas formas, como a elaboração do produto em condições que não respeitem as especificações, quando há emprego de matéria-prima impura, ou quando são empregadas substâncias de qualidade, tipo e espécie que não estejam na composição normal do produto, estabelecida pelo Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal. Também podem ser consideradas adulterações a intenção dolosa de mascarar a data de fabricação e a utilização de corantes e aromatizantes que não possuem autorização e não constam no rótulo do produto. Existem diversas substâncias que podem ser utilizadas para adulterar o leite, como a água, substâncias alcalinizantes, água sanitária e cal virgem (VENTURINI et al., 2007). Essas substâncias alteram as propriedades físico-químicas do leite. A adição de água, por exemplo, tende a diminuir o valor de densidade do leite (PIRES, 2000) e a aumentar o seu índice crioscópico(SILVA, 2004). Alguns autores relataram que a adição de água ao leite é uma prática comum realizada em diversas partes do mundo (MABROUK et al., 2006). Para identificar adulterações no leite, podem ser realizadas diversas análises específicas, dentre elas: densidade, índice crioscópico e Teste de Alizarol. As principais análises e determinações têm como objetivo a verificação da presença de possíveis substâncias que podem ter sido adicionadas à matéria-prima, como a identificação do amido, cloro e hipoclorito, água oxigenada e de substâncias alcalinizantes (VIOTO; CUNHA, 2006). O objetivo deste estudo foi analisar a qualidade do leite, para posterior identificação quanto ao seu tipo, através de análises físico-químicas e detecção de possíveis adulterações. 2. Material e Métodos Para as análises físico-químicas, usou-se uma amostra de leite de processamento desconhecido para posterior identificação. Para as análises de possíveis adulterações, usou-se uma amostra de leite UHT integral da marca betânia. 2.1 Características Físicas-Químicas do Leite 2.1.1 pH Transferiu-se 10 mL da amostra para um béquer e determinou-se o pH, com o aparelho pHmetro previamente calibrado, operando-o de acordo com as instruções do manual do fabricante. O resultado foi verificado a partir uma determinação direta do pH fornecida pelo potenciômetro. 2.1.2 Teste Do Alizarol Transferiu-se 2 mL de Leite e 2 mL de álcool 72°GL para um tubo de ensaio e misturou-se cuidadosamente. O resultado foi verificado a partir do aparecimento de uma coloração que poderia variar entre violeta, róseo-salmão e amarelo. 2.1.3 Dornic (Acidez) Transferiu-se 10 mL de Leite , com auxílio de pipeta volumétrica, para um erlenmeyer de 125 mL. Adicionou-se de 3 a 5 gotas de fenolftaleína e titulou-se por uma solução de hidróxido de sódio 0,111 mol/L S.V. (Dornic). O resultado foi verificado a partir do dado: cada 0,1 mL corresponde a 1°D e cada 1°D corresponde a 0,01% de acidez expressa como ácido lático. 2.1.4 Depressão Do Ponto De Congelamento Usou-se o equipamento Crioscópio Eletrônico para aferição da depressão do ponto de congelamento. 2.1.5 Determinação De Densidade Transferiu-se para a proveta 250 mL de Leite, evitando a formação de espuma. Mediu-se a temperatura do Leite (Tlida) e introduziu-se cuidadosamente o lactodensímetro. Após a estabilização, anotou-se a densidade (dlida). O intervalo de densidade considerado normal para o leite a 15°C está entre 1,028 g/mL a 1,034g/mL (Pereira et al, 2001). O resultado foi verificado a partir da conversão da densidade lida na temperatura de 26°C para a densidade a 15°C, através da tabela fornecida no laboratório. 2.1.6. Determinação De Gordura (Método De Gerber) Transferiu-se 10 mL de ácido sulfúrico para um butirômetro e adicionou-se cuidadosamente, 1 mL de Leite e 1 mL de álcool amílico. Limpou-se o gargalo com papel absorvente que foi vedado. Envolveu-se com toalha e agitou-se vigorosamente, e posteriormente a solução foi centrifugada por 4 a 5 minutos e deixada em banho-maria por 2 a 3 minutos. Fez-se a leitura na escala do próprio butirômetro.O resultado foi verificado a partir de resultado direto em % (m/v). 2.1.7 Determinação De Extrato Seco Total (Método Indireto) O equipamento utilizado foi o Disco de Ackermann. Fez-se coincidir as graduações dos círculos interno e médio, correspondentes à densidade corrigidae a porcentagem de gordura. A posição da seta indicou no círculo externo a porcentagem de extrato seco total. Nota: A porcentagem de extrato seco total poderia ser também calculada através das seguintes fórmulas: Fórmula de Fleischmann: % extrato seco =1,2 G + 2,665 [(100 D - 100)/D] .Fórmula Prática: % extrato seco = G/5 + D/4 + G + 0,26.Onde: D = densidade e G = % gordura. 2.1.8 Determinação De Extrato Seco Desengordurado Obteve-se a porcentagem de extrato seco desengordurado, subtraindo da porcentagem de extrato seco total a porcentagem de gordura da amostra. 2.1.9. Prova De Peroxidase Transferiu-se cerca de 10 mL da amostra para um tubo de ensaio de 20 mL, aqueceu-se em banho-maria a 43°C por 5 minutos. Na capela, adicionou-se 2mL da solução de guaiacol pelas paredes do tubo e 3 gotas de peróxido de hidrogênio.O resultado foi verificado a partir do desenvolvimento de uma coloração salmão, indicando peroxidase positiva. 2.2 Adulteração Do Leite 2.2.1 Teste do Alizarol Transferiu-se 2 mL de leite e 2 mL de solução de alizarol 72° GL para um tubo de ensaio, e misturou-se cuidadosamente. 2.2.2 Depressão do Ponto de Congelamento Transferiu-se 2 mL da amostra para o tubo de crioscopia. O tubo foi colocado no crioscópio, e o suporte do sensor foi acionado para baixo. O crioscópio acionou um sinal sonoro intermitente, indicando que o teste foi concluído. 2.2.3 Determinação da densidade Transferiu-se 25 mL da amostra de leite para uma proveta, evitando uma possível formação de espuma. A temperatura do leite foi lida, por meio de valores tabelados. Introduziu-se cuidadosamente o lactodensímetro na proveta, para que ocorresse estabilização. O valor da densidade foi anotado, considerando que a densidade do leite deve ser lida a uma temperatura de 15°C. 2.2.4 Identificação do amido Transferiu-se 10 mL de leite para um tubo de ensaio, que foi aquecido durante 5 minutos em banho-maria. Em seguida, o leite foi resfriado em água corrente, e adicionou-se 2 gotas de solução de lugol, a fim de que se verificasse a coloração produzida. 2.2.5 Identificação de cloretos Colocou-se 10 mL da amostra em um tubo de ensaio e adicionou-se 0,5 mL de solução de cromato de potássio a 5% e 4,5 mL de solução de nitrato de potássio 0,1 N. A solução foi agitada. 2.2.6 Identificação de cloro e hipoclorito Transferiu-se 5 mL de leite a um tubo de ensaio e adicionou-se 0,5 mL de solução de iodeto de potássio 7,5 %. A solução foi agitada. 2.2.7 Identificação de peróxido de hidrogênio - Método B: Guaiacol Não foi realizada,pois a amostra de leite utilizada durante as análises era UHT, não apresentando a enzima Peroxidase (destruída durante o tratamento térmico). 2.2.8 Neutralizantes da acidez - Método B: Fenolftaleína Transferiu-se 11 mL de leite para um béquer de 150 mL e adicionou-se 3 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a 1%. Titulou-se com solução de hidróxido de sódio 0,1N até o aparecimento de coloração rosa persistente. Reacidificou-se com 1 mL de solução de ácido sulfúrico 0,025 N, e aqueceu-se até a ebulição. Esfriou-se rapidamente em banho de gelo e adicionou-se 1 mL de solução alcoólica de fenolftaleína a 1%. 3. Resultados e Discussão 3.1 Características Físicas Químicas do Leite Tabela 1: Valores médios das análises físico-químicas para as amostras do leite C1. Testes físico-químicos Resultados Legislação pH 6,64 6,5 - 6,8 Crioscopia (°H) -0,534 -0,550 a -0,530 Densidade à 23° C (g/mL) 1,02443 1,028 - 1,034 Alizarol Cor rosa-salmão Cor rosa-salmão Acidez Dornic (°D) 14,5 14 - 18 Peroxidase Ausência Depende do Tratamento Térmico Gordura (%) 1,7 3 EST (Extrato Seco Total) (%) 14,7 ESD (Extrato Seco Desengordurado) (%) 13,0 8,4 3.1.1 pH Segundo Brito et al. (2016) ,o pH do leite fresco apresenta reação ligeiramente ácida, variando entre 6,6 e 6,8, com média de 6,7 a 20oC ou 6,6 a 25oC. Leite de glândulas mamárias com inflamação (mastite) fica alcalino e pode chegar a 7,3 - 7,5 (CORTEZ; CORTEZ, 2008). A média dos resultados obtidos ,(6,64), está dentro do intervalo considerado normal, para leite de vaca, segundo Rodrigues et al. (1995), a faixa de pH para leite fresco normal de uma vaca sadia é de 6,6 - 6,8. 3.1.2 Teste Do Alizarol Esse teste teve o objetivo de indicar a acidez e a estabilidade térmica do leite analisado. Através da reação da amostra com uma solução alcoólica contendo um indicador de pH (alizarina), foi verificado o surgimento da coloração róseo-salmão, indicando que o leite analisado apresentava-se no estado normal, sem suspeita de fraude com alcalinos ou com água (JOÃO,2008). Também não havia acidez excessiva,a partir disso, pode-se verificar que o leite apresentava-se dentro da legislação (IN 62/2011 do MAPA) quanto a sua estabilidade ao Alizarol 72 % (v/v). 3.1.3 Dornic (Acidez) Para a análise de acidez, cada 0,1 mL corresponde a 1°D, e cada 1°D corresponde a 0,01% de acidez expressa como ácido lático. 1,45 ml corresponde a 14,5 °D e 0,145% de acidez. A média dos resultados obtidos está dentro do intervalo permitido pela IN 62/2011 do MAPA, em g de ácido láctico/100 mL, que é 0,14 a 0,18 esse valor é semelhante aos encontrados por Rodrigues et al. (1995). 3.1.4 Depressão Do Ponto De Congelamento A depressão do ponto de congelamento baseia-se na modificação do ponto de congelamento em razão direta da concentração molecular de solutos (VENTUROSO,2007). De acordo com a legislação (BRASIL, 2011), considera-se para o requisito índice crioscópico valores de -0,530 a -0,550°H (ou -0,512 a -0,530°C), e dessa forma a amostra analisada, que apresentou índice crioscópico médio de -0,534 °H, está dentro do padrão. 3.1.5 Determinação De Densidade A determinação da densidade serve como método de detecção de fraudes no leite no que se refere à destruição ou a adição de água, apesar de não ser um teste conclusivo, pois leites com alto teor de gordura apresentam-se com valores de densidade menor em virtude da baixa densidade das gorduras (TRONCO,2003). O desnate do leite e a adição de amido são alterações que fazem a densidade aumentar (AGNESE et al., 2002). Sob temperatura de 26°C,o Lactodensímetro forneceu o valor de 22,0. Após realizar a conversão da densidade lida no lactodensímetro e a temperatura lida no termômetro para a densidade a 15°C,com o auxílio da tabela apresentada na laboratório,obteve-se o valor de densidade relativa 1,02443 g/mL, um pouco abaixo do mínimo exigido pela legislação ,que é de 1,028 a 1,034g/mL. A densidade abaixo do nível serve para identificar fraude no leite (água), problemas nutricionais ou ainda problemas na saúde do animal (VILA ,2007). 3.1.6 Determinação De Gordura (Método De Gerber) Segundo Fonseca e Santos (2001), os teores de proteína e gordura são importantes por fornecer informaçõessobre parâmetros nutricionais, metabólicos, ocorrência de fraudes e desnate, além de constituir um dado fundamental para a produção de derivados. Essa análise fundamenta-se no ataque seletivo da matéria orgânica por meio de ácido sulfúrico, com exceção da gordura que é separada por centrifugação (auxiliada pelo álcool amílico; modifica a tensão superficial). A leitura do butirômetro forneceu o valor de 1,7g de gordura para cada 100ml de leite, resultado foi verificado diretamente em % (m/v), o valor encontrou-se abaixo do exigido por legislação no requisito gordura (g/100 g) que é de no mínimo 3,0. 3.1.7 Determinação De Extrato Seco Total e Extrato Seco Desengordurado O Disco de Ackermann forneceu o valor de Extrato Seco Total equivalente a 14,7. A partir desse dado,realizou-se a subtração do mesmo pelo valor da gordura, 1,7g (calculado anteriormente através do Método De Gerber). Subtraindo o extrato seco total da gordura, anteriormente mensurada, obteve-se o valor de extrato seco desengordurado. O valor de Sólidos Não-Gordurosos (g/100g) mínimo exigido pela Instrução Normativa Nº 62, de 29 De Dezembro De 2011, é de 8,4. Desta forma,pode-se afirmar que a amostra analisada apresentou um valor maior que o exigido na legislação, (13g/100g), satisfazendo, portanto, esse requisito. Este dado vai de acordo com Rezer (2015), que em trabalho semelhante verificou médias de valores de acidez dentro do estabelecido pela legislação vigente. 3.1.8 Prova De Peroxidase A amostra desenvolveu uma coloração salmão, indicando peroxidase positiva. Portanto, segundo Andrioli (2001) o processo de pasteurização da amostra não atingiu temperaturas mais elevadas do que as indicadas para processamento do leite (pasteurização rápida e lenta) , ou seja: o leite não foi aquecido acima de 75°C, por mais de 20 segundos, e portanto não é um leite UHT . 3.2 Adulteração Do Leite Tabela 2: Valores dos testes de adulteração para a amostra do leite C2. Testes de adulteração Resultados obtidos Alizarol Cor rosa padrão Crioscopia (ºC) -0,600 Densidade (23ºC) (g/mL) 1,0304 Amido Ausência Cloreto Presença Cloro e hipoclorito Presença Peroxidase Ausência Neutralizante da acidez Ausência 3.2.1 Teste do Alizarol A amostra apresentou o desenvolvimento da coloração rosa na solução, indicando que o leite estava no padrão considerado estável, portanto, sem suspeita de fraude com alcalinos ou com água, nem acidez excessiva (JOÃO,2008). A partir disso,pode-se verificar que o leite apresentava-se dentro do exigido pela legislação (BRASIL, 2011) quanto a sua estabilidade ao Alizarol 72 % (v/v). 3.2.2 Depressão do ponto de congelamento O ponto de congelamento normal do leite varia de -0.530º H até -0.550º H. A adição de água aumenta o ponto de congelamento do leite na escala, fazendo-o ficar próximo de zero. Substâncias químicas que quando dissolvidas ficam em solução perfeita, possuem efeito contrário, diminuindo o ponto de congelamento do leite. Dessa forma, substâncias como o sal, o açúcar, o álcool e o citrato podem compensar a adição fraudulenta de água (BERNARDI,2006). O ponto de congelamento do leite apresentou valor de -0,600°C, e ,portanto, abaixo do intervalo exigido na IN 62/2011 do MAPA ,no requisito índice crioscópico, que é - 0,530ºH a -0,550ºH (equivalentes a -0,512ºC e a -0,531ºC). 3.2.3 Análise da Densidade A adição de água também dilui a concentração de proteínas. Assim, para mascarar esse efeito diluidor, substâncias como a ureia e a melamina podem ser adicionadas de maneira fraudulenta. Esses constituintes possuem nitrogênio em sua composição (QUINTANA,2006). Como as análises de rotina não diferenciam o nitrogênio protéico do nitrogênio não protéico, a uréia e a melamina são mensurados como proteína total. A ureia é um componente natural do leite, dificultando a detecção dessa fraude (CECCHI, H. M.,2003). Valores acima de 40 mg/dl podem indicar fraude ou desequilíbrio nutricional dos animais. Sob temperatura de 25C°, o Lactodensímetro forneceu o valor de 1,028 . Após realizar a conversão, densidade do leite apresentou valor de 1,0304 g/mL a 15°C, considerando os valores tabelados. Esse valor está adequado, visto que a densidade permitida para o leite a 15°C está no intervalo de 1,028 g/mL a 1,034 g/mL. 3.2.4 Análise do Amido Segundo Fagnani (2016),a densidade normal do leite varia de 1,028 a 1,034 g/cm3. A adição de água, cuja densidade é de 1,00 g/cm3, diminui a densidade do leite, aproximando-a de um. Substâncias químicas que quando dissolvidas ficam em suspensão, possuem efeito contrário na densidade, aumentando esse valor. Dessa forma, substâncias que contém amido, como por exemplo a farinha, também podem compensar a adição fraudulenta de água, mas com efeitos apenas na densidade, e não na crioscopia (MENDES, 2010). A análise do amido apresentou resultado negativo, o que foi indicado pela manutenção da coloração da solução e não aparecimento da coloração azul causada através da junção do amido com o iodo formando um composto de adsorção. 3.2.5 Identificação de cloretos A análise qualitativa de cloretos é baseada na reação do nitrato de prata com os cloretos em presença de cromato de potássio como indicador ,ou seja: os cloretos são precipitados sob a forma de cloreto de prata em pH levemente alcalino em presença de cromato de potássio como indicador. O ponto final da titulação é visualizado pela formação do precipitado de cromato de prata (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2005).O resultado foi positivo, comprovado pela modificação da cor da solução para amarelo, evidenciando a presença de sal em quantidades superiores a faixa (0,08 a 0,10). 3.2.6 Identificação do cloro e hipoclorito Devido ao seu metabolismo, os micro-organismos podem facilmente deteriorar o leite. Para impedir que isso aconteça, substâncias conservantes são fraudulentamente adicionadas, possuindo a capacidade de destruir os micro-organismos e/ou impedir a sua multiplicação (MENDES, 2010). Os conservantes mais utilizados nas fraudes são também aqueles mais baratos e de fácil aquisição, como água oxigenada, hipoclorito de sódio, popularmente chamado de água sanitária, e também o formol (MACIEL,2008). A análise que baseia-se na formação do iodo livre a partir do iodeto de potássio, pela ação do cloro livre ou hipoclorito,apresentou resultado positivo. Comprovado pela coloração da solução, que se apresentou amarela. 3.2.7 Neutralizantes da acidez O ácido lático diminui o pH do leite. É o que popularmente chamamos de leite azedo. Para encobrir esse processo, substâncias básicas são adicionadas para recompor o pH natural do leite, que varia de 6,4 a 6,8. Essas substâncias são chamadas de neutralizantes, e podemos citar o bicarbonato de sódio, a cal e o hidróxido de sódio, também chamado de soda cáustica (FAGNANI,2016). A análise que consiste na neutralização do leite com hidróxido de sódio e logo após na acidificação com ácido sulfúrico,apontou resultado negativo, visto que a solução não apresentou mudança de coloração após adição da fenolftaleína. 4. Conclusão A partir do resultados das análises realizadas, verificou-se que a primeira amostra de leite se apresentava adequada aos requisitos físico-químicos exigidos pela legislação, quanto ao índice crioscópico, Sólidos Não-Gordurosos, Estabilidade ao Alizarol, Índice crioscópico, e Acidez, em g de ácido láctico. O pH dispôs de valores considerados normais. A Densidade relativa e Gordura (g/100 g) apresentaram resultados abaixo dos exigidos para leite integral. Quanto a Peroxidase, Positiva. Com isso, pôde-se sugestionar que a amostra tratava-se de leite pasteurizado Semidesnatado. Evidenciou-se também que a segunda amostra de leite estava adulterada, com provável adição de água sanitária, também conhecida como hipoclorito de sódio. Referências Bibliográficas AGNESE, A. P. et al. Avaliação físico-química do leite cru comercializado informalmente no Município de Seropédica – RJ. Revista Higiene Alimentar, São Paulo, v. 16, n. 94, p. 58-61, 2002. ANDRIOLI, A. S. et al. Padrões físico-químicos de identidade do leite “longa vida” (UHT) comercializado na cidade de Juiz de Fora (MG). Revista do Instituto de Laticínios Candido Tostes, Juiz de Fora, v. 56, n.321, p. 50-54, 2001. BRASIL. Ministério da Agricultura, pecuária e Abastecimento. 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