Aula 4 Replicação do DNA

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Fonte: 
http://www.nature.co
m/news/researchers-
turn-off-down-s-
syndrome-genes-
1.13406 
Cientistas 'silenciam' cromossomo que causa síndrome de Down 
 Cientistas da Escola Médica da Universidade de Massachusetts introduziram 
um gene RNA chamado XIST em células-tronco derivadas de pessoas 
portadoras da síndrome. 
 
 
 O XIST "encobriu" o terceiro exemplar do cromossomo 21, cuja existência 
origina a síndrome de Down, fazendo com que seus genes deixassem de atuar. 
 
 
 Ao comparar células com e sem o cromossomo "silenciado", observaram que 
o XIST ajudou a corrigir padrões incomuns de crescimento e diferenciação 
observados nas células que têm Down. 
 
 A pesquisa se baseou em um fenômeno ocorre naturalmente: durante o 
desenvolvimento do bebê, o XIST "desliga" um dos dois cromossomos X 
presentes em embriões femininos, garantindo que as meninas não tenham 
uma "dose dupla" da ação desses cromossomos. 
 
 
 O estudo pode contribuir para o desenvolvimento de tratamentos para os 
diferentes sintomas degenerativos da síndrome. 
 
 
 O problema da técnica apresentada é que o XIST não silencia por 
completo o cromossomo 21. Isso pode comprometer os resultados dos 
estudos que comparam células com e sem o gene “silenciador” ativado. 
REPLICAÇÃO DO DNA 
A replicação é o processo de duplicação de uma 
molécula de DNA de dupla cadeia (hélice). 
“A fiel transmissão da informação 
hereditária depende da replicação 
precisa do material genético.” 
Devido a complementaridade das bases, cada um dos 
dois filamentos únicos irá agir como molde, e irá ocorrer 
a reconstituição da dupla hélice, idêntica a que foi 
aberta. 
 
 
Os nucleotídeos recém-adicionados, supostamente vêm 
de pool de nucleotídeos que esta presente na célula. 
DUPLICAÇÃO/REPLICAÇÃO DO DNA 
- A duplicação é semiconservativa - cada dúplex filha contém 
um filamento parental e um recém-sintetizado. 
 
 
 
 
 
 
Origem da Replicação 
 
 
 Sequencias ricas em AT; 
 Bactérias, vírus, plasmídeos: Uma origem; 
 Genomas eucarióticos: múltiplas origens; 
 Proteínas especificas fazem o reconhecimento; 
ORIGEM DA REPLICAÇÃO 
Replicon: Origem + Término 
 Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 
 A replicação é bidirecional e em ambas as fitas de forma simultânea. 
 Este processo gera “bolhas de replicação”. 
 
Célula procariótica Célula eucariótica 
Origem da replicação - ponto único na molécula, caracterizado por uma 
sequência de bases específicas, a partir de onde a dupla fita se abre. 
5’ 
3’ 5’ 
3’ 
As terminações destes são pontos dinâmicos, chamados de forquilhas de 
replicação, onde as fitas de DNA são separadas e replicadas. 
O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 
3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’ 
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos 
A cadeia que cresce no mesmo sentido que o deslocamento da forquilha de 
replicação, e cuja síntese ocorre continuamente, é chamada de cadeia leading, 
A cadeia que cresce no sentido oposto ao deslocamento da forquilha de replicação, e 
cuja síntese ocorre descontinuamente, é chamada de cadeia lagging. 
ESTÁGIOS DA REPLICAÇÃO OU DUPLICAÇÃO 
1. INICIAÇÃO - Origem da replicação, consiste numa sequência de 245 pb 
altamente conservada. A iniciação é única fase regulada da replicação, de 
forma que ela a replicação só ocorra uma vez por ciclo celular. 
 
 
2. ALONGAMENTO – Síntese das fitas 
 
 
 
3.TERMINAÇÃO - momento em que as duas forquilhas de replicação 
 (que progridem direcionalmente) se encontram um uma sequência 
chamada região Ter, para que possa dar fim a replicação. 
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS 
(SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA) 
Proteína DnaA – São proteínas que se ligam a sequência de 
nucleotídeos específicos na origem da replicação e faz com as fitas de 
DNA se separem. 
 
Helicase – Rompe as pontes de hidrogênio, abrindo as moléculas de 
DNA. 
 
DNA topoisomerase – são responsáveis pelo mecanismo de remoção 
do superdobramento, responsáveis por aliviar a torção na parte da fita 
que não está sendo replicada. 
DNA B helicase – São enzimas que se ligam a fita simples de DNA, 
próximo a zona de replicação e se movem na direção da fita dupla, 
forçando as fitas se separarem e provocando um desenrolamento. 
 
 
SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o 
re-anelamento das mesmas. 
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de 
reações biológicas. 
“As DNA polimerases podem ampliar a cadeia, mas não podem 
começar a cadeia.” 
 
 
PRIMASE – um tipo de RNA polimerase responsável por 
sintetizar pequenas moléculas de RNA utilizadas como 
iniciadores (“Primer”) durante o processo de replicação do 
DNA. 
 
Primer = uma região curta de aproximadamente 10 nucleotídeos, com 
um grupo hidroxila livre no carbono - 3’, que serve como primeiro 
aceptor de um nucleotídeo. 
DNA Polimerases: (Pol I, Pol II e Pol III) – São as enzimas 
responsáveis por catalizar o alongamento da cadeia adicionando 
nucleotídeos, um de cada vez, complementando a sequência das 
bases nitrogenadas da fita molde. 
 
 
Estas enzimas somente conseguem ler os nucleotídeos da fita de 
DNA parental na direção 3’  5’ e sintetizar novas fitas na direção 
5’  3’. Desta maneira, os alongamentos das fitas são em sentidos 
opostos. 
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS 
(SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA) 
A fita que cresce na direção oposta a zona de replicação 
é sintetizada descontinuamente, copiando pequenos 
fragmentos de DNA denominados fragmentos de 
Okazaki. Estes fragmentos são posteriormente unidos 
para se tornar uma única fita contínua. 
DNA Ligase – É a enzima responsável por realizar a junção entre os 
fragmentos de DNA (fragmentos de Okazaki). 
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS 
(SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA) 
Replicação “in vitro” 
 
 
 
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase 
1983: Kary Mullis 
Termocicladores 
Mecanismo da PCR 
 O sequenciamento automático de DNA é uma realidade. 
Considerando que você seja um pesquisador e esteja buscando um 
gene responsável por uma doença genética grave, você isolou um 
segmento de DNA e mandou realizar o seqüenciamento da fita 5´ - 3´. 
 O resultado obtido que lhe foi enviado está abaixo: 
A partir deste resultado determine : 
a) A seqüência do DNA da fita não molde. 
 Uma outra técnica utilizada é o PCR (Reação da Polimerase em 
cadeia), onde a partir de um segmento de DNA e um iniciador 
podemos amplificar em milhares de vezes este segmento. No caso 
abaixo, foram utilizados diferentes marcadores e associados a 
presença da doença o marcador M” que amplifica dentro da região 
do gene que causa a doença. De acordo com estes resultados pinte 
como indivíduo afetados quais dos filhos poderão ter a doença. 
M”” 
M” 
M´ 
 M”´