AULA 5 Teste imunoenzimático elisa

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TESTE IMUNOENZIMÁTICO - ELISA 
Profª. Drª. Mariane Arnoldi da Silva 
ELISA 
 substrato 
 (incolor) 
 Qualitativos 
 Quantitativos 
 Direto = Ag 
 Indireto = Ac 
+ + = COR Ag 
Fosfatase alcalina 
Peroxidase 
B-galactosidase 
Ac marcados com Enzimas 
ELISA 
1. Ag purificado; 
 
2. Ac purificado; 
 
3. Controles (positivos, negativos, ponto de corte; 
 
4. Padrões (concentrações conhecidas – dosagem quantitativa; 
 
5. Amostras; 
 
6. Placa de poliestireno; 
 
7. Tampão de lavagem; 
 
8. Conjugado – AC ou AG ligados a enzima; 
 
9. Cromógeno: substância incolor que ao ser oxidada pela reação 
enzimática produz cor; 
 
10.Leitora de ELISA; 
CUT OFF 
VALOR DE CORTE DO TESTE 
 
SITUAÇÃO HIPOTÉTICA: 
 
↑CUTOFF REAGENTE 
↓CUTOFF NÃO REAGENTE 
 
Ex: cutoff 0, 500 
Resultado A 0,100 NÃO REAGENTE 
Resultado B 0,900 REAGENTE 
CUT OFF 
 Ex: cutoff 0, 500 
 
 ZONA CINZA/ BODERLAINE/INDETERMINADO 
 
0,450 – 0,550 
 
 Resultado A 0,100 NÃO REAGENTE 
 Resultado B 0,900 REAGENTE 
 Resultado C 0,501 INDETERMINADO 
TIPOS DE ELISA 
Pode ser usado para pesquisa de anticorpo: 
- Indireto; 
- Captura de Ig classe especifica; 
- Sanduíche 
 
Pode ser usado para pesquisa de antígenos: 
 
- Competitivo com antígeno marcado; 
- Competitivo com anticorpo marcado; 
- Captura de antígeno ou sanduíche 
MÉTODO INDIRETO 
Placas plásticas são sensibilizadas com o antígeno que reage com os 
anticorpos da amostra. O conjugado anti imunoglobulina humana reage 
com o anticorpo capturado pelo antígeno e a reação é revelada com a 
solução cromógena. 
A reação é interrompida, e a intensidade da cor é estabelecida 
fotometricamente. 
MÉTODO INDIRETO 
MÉTODO DE CAPTURA PARA IGM 
INDICADO PARA FASES AGUDAS DE 
DOENÇAS 
A fase sólida é sensibilizada com anti-IgM específica para a região Fc. 
Os soros em teste são incubados, havendo a captura de qualquer IgM da 
amostra. 
Incubação com antígeno 
Incubação com anticorpo marcado 
Lavagem 
Lavagem 
MÉTODO DE CAPTURA PARA IGM 
MÉTODO DE CAPTURA (SANDUÍCHE) = ANTÍGENO 
. 5. A taxa de degradação é proporcional a concentração do antígeno. 
É o mais utilizado para antígenos polivalentes. 
1. Fase sólida é sensibilizada com anticorpo específico. 
2. Os soros em teste, onde se vai pesquisar o antígeno, são incubados com a fase sólida e, 
a seguir, 
3. incuba-se com excesso de anticorpo específico marcado com a enzima. 
4. A reação é revelada pela adição do substrato 
MÉTODO COMPETITIVO 
São métodos empregados na 
detecção quantitativa de moléculas 
(antígenos). 
O resultado positivo resulta no desenvolvimento mínimo ou ausência de coloração, pois a 
quantidade de antígeno conjugado com a enzima que se ligou ao anticorpo da fase sólida é 
inversamente proporcional à quantidade de antígenos na amostra. 
O método de competição com antígeno marcado 
utiliza reagentes em quantidades limitadas 
O anticorpo utilizado deve ligar com a mesma avidez ao 
antígeno da amostra e ao antígeno marcado. 
USO 
 Hormônios; 
 Marcadores tumorais; 
 Antígenos patógenos (desde que não sejam 
moléculas muito pequenas). 
5. Quanto maior a concentração de Ag no soro = menor a coloração produzida 
1. Fase sólida é sensibilizada com anticorpo específico. 
2. Adicionado Ag (amostra do paciente) e uma quantidade de Ag marcado (conjugado) = 
COMPETEM PELO MESMO SÍTIO DE LIGAÇÃO (o de maior concentração, se ligará mais ao 
AC. 
3. Adição do cromógeno e substrato 
LAVAGEM 
LAVAGEM 
IMUNOBLOT (IMMUNOBLOTTING) OU WESTERN-
BLOT 
Permite identificar um antígeno em uma mistura 
complexa de proteínas. 
ETAPAS 
Primeira etapa: separação 
das proteínas virais por 
eletroforese em gel de 
poliacrilamida 
Segunda etapa: transferência eletroforética dos antígenos para uma membrana de 
nitrocelulose. 
ETAPAS 
Terceira etapa: a membrana é bloqueada com proteínas que são adsorvidas por sítios não 
ocupados pelos antígenos. Após a membrana é colocada em contato com o soro que se 
deseja pesquisar. As reações antígeno-anticorpo são detectadas por meio da reação com 
anti - imunoglobulina humana, conjugada com um radioisótopo ou uma enzima. 
A revelação é feita por auto-
radiografia ou por substrato 
cromogênico 
ETAPAS 
1 2 3 
Eletroforese em gel 
Análise 
Transferência 
Detecção 
 Eletroforese de proteínas 
 Diferença de tamanho (PM) 
 Mobilidade da proteína 
 Detecção Ag ou Ac 
 
USO E INTERPRETAÇÃO 
Uso: o teste é utilizado para confirmação do resultado reagente ao teste ELISA (ou seja, 
teste confirmatório da infecção. 
 
Interpretação 
A visualização de uma "banda" permite determinar a presença de anticorpos específicos 
para um antígeno do extrato proteico. 
 
 
Alta especificidade e sensibilidade 
RESULTADOS 
 
RESULTADOS