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UENF, CBB, LQFPP Prof. Gustavo Rezende Bioquímica Geral 6ª aula: Enzimas O que vimos na última aula: Cada resíduo de aminoácido é ligado ao vizinho por uma ligação covalente, a ligação peptídica Um pentapeptídeo: Extremidade amino-terminal Extremidade carboxi-terminal Proteínas e peptídeos biologicamente ativos ocorrem em uma vasta faixa de tamanhos As ligações peptídicas são rígidas e planares Formação de pequeno dipolo elétrico e ressonância: caráter parcial de ligação dupla Assim, há restrição de rotação da ligação peptídica. Mas… no esqueleto principal da proteína as ligações N-C α e C α -C têm rotação. Os quatro níveis hierárquicos de organização de estruturas protéicas: Classificação das proteínas com estrutura quaternária 1. Fibrosas – cadeias polipeptídicas arranjadas em longas fitas ou folhas 2. Globulares – cadeias polipeptídicas enoveladas em forma esférica ou globular – consistem principalmente de um único tipo de estrutura secundária – vários tipos de estrutura secundária – proteínas estruturais (forma e suporte) e proteção externa – proteínas regulatórias e enzimas Importância das proteínas: - As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células; - Grande variedade de tamanhos e tipos; - Grande variedade de funções biológicas - São a maior parte dos produtos da informação gênica! - Compõem quase todos os instrumentos pelos quais a informação gênica é expressa! - Quase todo o trabalho celular é feito pelas proteínas. O que veremos hoje: 1) Definição de enzima 2) Mecanismo de ação enzimática 3) Cinética enzimática 4) Inibição enzimática 5) Regulação, alosteria e cofatores 3) Ribozimas O que é uma enzima? Molécula orgânica, produzida por um ser vivo, que catalisa uma reação. A maioria das enzimas são proteínas. O que é uma enzima? Molécula orgânica, produzida por um ser vivo, que catalisa uma reação. O que é um catalisador? Substância que aumenta a velocidade de uma determinada reação Um catalisador nunca é consumido na reação. A maioria das enzimas são proteínas. O que é uma enzima? Molécula orgânica, produzida por um ser vivo, que catalisa uma reação. O que é um catalisador? Substância que aumenta a velocidade de uma determinada reação Um catalisador nunca é consumido na reação. A maioria das enzimas são proteínas. O que é uma reação enzimática? É a transformação de um substrato (S) em um produto (P): Reação Enzimática: E + S ES EP E + P E: enzima S: substrato P: produto S P E E + S ES EP E + P Reação Enzimática: E: enzimaS: substrato P: produto S P E E + S ES EP E + P Enzimas são altamente específicas Reação Enzimática: E: enzimaS: substrato P: produto S P E E + S ES EP E + P Enzimas são altamente específicas Reação Enzimática: E: enzimaS: substrato P: produto Funcionamento Enzimático Enzimas aumentam a velocidade de uma reação: Entre 105 e 1017 vezes mais rápido! Enzimas aumentam a velocidade de uma reação: Entre 105 e 1017 vezes mais rápido! 1 segundo sacarose (açúcar) glicose + frutose E 1010 vezes: Enzimas aumentam a velocidade de uma reação: Entre 105 e 1017 vezes mais rápido! 1 segundo sacarose (açúcar) glicose + frutose E sacarose (açúcar) glicose + frutose EX 317 anos 1010 vezes: sem enzima Enzimas aumentam a velocidade de uma reação: 1 segundo sacarose (açúcar) glicose + frutose E sacarose (açúcar) glicose + frutose EX 317 anos 1010 vezes: sem enzima Sem as enzimas, as reações químicas necessárias para possibilitar a vida não acontecem em uma escala de tempo útil. Enzimas aumentam a velocidade de uma reação: As enzimas são catalisadores biológicos Poder catalítico extraordinário, maior do que o de catalisadores sintéticos; Alto grau de especificidade para seus substratos As enzimas organizam a liberação de energia Atuam nas condições fisiológicas! Entendendo com uma enzima funciona: Energia livre de Gibbs: energia que pode realizar trabalho durante a reação em temperatura e pressão constantes. ubstrato roduto O substrato (S) possui mais energia que o produto (P). Entendendo com uma enzima funciona: ubstrato roduto Energia de ativação: Energia de ativação é uma barreira energética entre S e P, requerida para alinhar os grupamentos reativos, formação de ligações transientes instáveis, rearranjo de ligações e outras transformações necessárias para a reação ocorrer para qualquer um dos lados. = Energia de ativação ubstrato roduto Enzimas atuam diminuindo a energia de ativação de uma reação. Entendendo com uma enzima funciona: ubstrato roduto Enzimas alteram a Velocidade, mas não o Equilíbrio Químico de uma reação: Essa é a relação entre a Energia livre de Gibbs (G) e a constante que define o Equilíbrio Químico de uma reação (Keq): Constante de equilíbrio da reação (Keq): A + B C + D Keq: uma constante, característica de cada reação química, relaciona as concentrações específicas de todos os reagentes e produtos no equilíbrio, em uma dada temperatura e pressão. Reação: Keq = [A] [B] [C] [D] onde é a concentração do composto X em Molar, no equilíbrio. [X] As enzimas aceleram as reações químicas mas não alteram a constante de equilíbrio ou o ∆G da reação. E onde as reações acontecem, dentro das enzimas protéicas? Sítio catalítico é a “alma” da enzima! Quimotripsina É no sítio catalítico que ocorre a reação em si; onde a energia de ativação da reação é diminuída. O S está mostrado em vermelho, bem como alguns aminoácidos essenciais do sítio catalítico. A estrutura da proteína é importante para sua catálise! Quimotripsina Hexocinase Como as enzimas diminuem a energia de ativação? Como as enzimas diminuem a energia de ativação? 1) Formação de ligações covalentes transientes entre enzima e substrato: • Rearranjo de ligações covalentes • Grupamentos catalíticos das enzima formam ligação transiente com substrato ativando-o para a reação ou ocorre a transferência transiente de um grupo do substrato para a enzima. • Interagem e diminuem a energia de ativação ao proporcionar uma via alternativa com energia necessária mais baixa para reação ocorrer. Como as enzimas diminuem a energia de ativação? 2) Interações fracas, não covalentes, entre enzima e substrato: • Contribuem com expressiva parcela da energia necessária para diminuir a energia de ativação. • Isto diferencia enzimas da maioria dos demais catalisadores, pois forma o complexo ES. • Interações ES são mediadas pelos mesmos tipos de interações que estabilizam a estrutura das proteínas: ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações iônicas. • A formação de cada interação fraca no complexo ES promove a liberação de um pouco de energia livre que fornece um grau de estabilidade à interação. • As ligações fracas entre E e S distorcem S, favorecendo a reação. Interações fracas entre enzima e substrato são otimizadas no estado de transição: As interações fracas são otimizadas no estado de transição: os sítios ativos NÃO são complementares ao substrato por si, mas SIM complementares ao estado de transição pelo qual o substrato passa quando é convertido à produto durante a reação enzimática. Interações fracas entre enzimae substrato são otimizadas no estado de transição: As interações fracas são otimizadas no estado de transição: os sítios ativos NÃO são complementares ao substrato por si, mas SIM complementares ao estado de transição pelo qual o substrato passa quando é convertido à produto durante a reação enzimática. seria uma péssima enzima (esse modelo é o de chave e fechadura) Modelo do ajuste induzido (induced fit): A ligação da enzima ao substrato leva a alterações na conformação da enzima que são importantes para o alinhamento dos grupos funcionais da enzima para promover a catálise. Esse é o modelo do ajuste induzido. O que ocorre no complexo ES: 1) Associação ES segura os substrato na orientação própria, alinhamento com grupamentos funcionais da enzima. 2) Ligação enzima-substrato leva à dessolvatação do mesmo. Interações enzima substrato substituem pontes de Hidrogênio do substrato com a água. 3) A energia de ligação no estado de transição, envolvendo interações fracas ajuda a compensar termodinamicamente qualquer distorção e redistribuição eletrônica que o substrato tenha que passar. 4) Ajuste induzido: a enzima muda de conformação quando o substrato liga. Importante para a orientação correta dos grupamentos funcionais para que haja catálise. A mudança na conformação também permitirá a formação de mais interações fracas no estado de transição. Cinética Enzimática Determina a velocidade de uma reação e como ela se altera com a mudança nos parâmetros experimentais. Cinética Enzimática Determina a velocidade de uma reação e como ela se altera com a mudança nos parâmetros experimentais. É a abordagem central no estudo do mecanismo de catálise enzimática As constantes relacionadas com a ação da enzima: 1 segundo S P E E + S ES E + P K1 K-1 K2 K-2 As enzimas são estudadas em condições de velocidade inicial ou instantânea (V0) Velocidade medida imediatamente após o início da reação… POR QUÊ? Para evitar qualquer diminuição na taxa de reação devido a: � Depleção de substrato � Acúmulo de produto Nesta abordagem assume-se que: [S], que é a concentração do substrato, é praticamente constante e acúmulo de produto [P] é negligenciável. Assume-se também que [S] é muito maior do que a de [E]. [P] 0 Sn S1 S2 S3 tta ti A concentração de substrato afeta a velocidade inicial de reação: empo Maior concentração de substrato em S1 do que em S2 [P] 0 Sn S1 S2 S3 tta ti A concentração de substrato afeta a velocidade inicial de reação: empo Maior concentração de substrato em S1 do que em S2 Enzima Substrato A concentração de substrato afeta a velocidade inicial de reação: Ou seja: quanto maior a quantidade de substrato, mais rápida é a formação do produto. A concentração de substrato afeta a velocidade inicial de reação: V0: [S] > > [E] Vmax: Velocidade máxima da reação Equação de Michaelis-Mentem Equação de Michaelis-Mentem A equação de Michaelis e Mentem relaciona a velocidade inicial V0 com a concentração do substrato [S]. Equação de Michaelis-Mentem A equação de Michaelis e Mentem relaciona a velocidade inicial V0 com a concentração do substrato [S]. Km: Constante de Michaelis. É a concentração do substrato onde a reação enzimática ocorre com metade de sua velocidade máxima. É dada na mesma grandeza que a concentração do substrato (nesse caso em mM). Equação de Michaelis-Mentem A equação de Michaelis e Mentem relaciona a velocidade inicial V0 com a concentração do substrato [S]. Equação de Michaelis-Mentem Quando V0 = ½ Vmax, Km = [S] Equação de Michaelis-Mentem Em concentrações muito baixas ou muito altas de S, a equação de Michaelis e Mentem pode ser simplificada. Os dois lados da equação de Michaelis-Mentem podem ser invertidos e suas partes separadas: Equação de Michaelis-Mentem e gráfico de duplo-recíprocos: Os dois lados da equação de Michaelis-Mentem podem ser invertidos e suas partes separadas: V0 1 Km Vmax [S] [S] = + Vmax [S] Que pode ser simplificado para: Equação de Michaelis-Mentem e gráfico de duplo-recíprocos: Os dois lados da equação de Michaelis-Mentem podem ser invertidos e suas partes separadas: V0 1 Km Vmax [S] [S] = + Vmax [S] V0 1 Km Vmax [S] 1 = + Vmax Equação de Michaelis-Mentem e gráfico de duplo-recíprocos: Equação de Michaelis-Mentem e gráfico de duplo-recíprocos: Esse gráfico é de 1/V0 versus 1/[S], que é o “duplo-recíproco” do gráfico V0 versus [S] visto até agora. V0 1 Km Vmax [S] 1 = + Vmax Nesse gráfico, a interseção da linha com os eixos, bem como a inclinação da mesma fornece importantes parâmetros: Parâmetros cinéticos são usados para comparar atividades enzimáticas: Leituras: A concentração de substrato da catalase para a atividade máxima da catalase é maior do que a concentração de substrato da treonina desidratase para a atividade máxima da treonina desidratase. Parâmetros cinéticos são usados para comparar atividades enzimáticas: Leituras: A concentração de substrato necessária para que a Quimiotripsina atinja sua velocidade máxima irá variar, dependendo do substrato. Enzimas podem ser inibidas: Inibidores de enzimas são compostos que interferem com a catálise enzimática, diminuindo ou interrompendo a ação das enzimas. Inibidores de enzimas estão entre alguns dos mais importantes agentes farmacêuticos. Exemplo: A aspirina inibe uma enzima envolvida com a síntese de prostaglandinas que, por sua vez, são compostos que estão envolvidos com a produção da sensação de dor. Inibidores de enzimas são utilizados para o tratamento de diversas patologias, como o câncer, infecção por HIV, dentre outras. Enzimas podem ser inibidas de forma reversível ou irreversível: 3 tipos de inibição reversível: competitiva, incompetitiva e mista Inibidor se liga no sítio catalítico Enzimas podem ser inibidas de forma reversível ou irreversível: 3 tipos de inibição reversível: competitiva, incompetitiva e mista Inibidor se liga em outro sítio apenas no complexo ES Inibidor se liga no sítio catalítico Enzimas podem ser inibidas de forma reversível ou irreversível: 3 tipos de inibição reversível: competitiva, incompetitiva e mista Inibidor se liga em outro sítio apenas no complexo ES Inibidor se liga no sítio catalítico Inibidor se liga em outro sítio tanto em E quanto ES Enzimas podem ser inibidas de forma reversível ou irreversível: 3 tipos de inibição reversível: competitiva, incompetitiva e mista Inibições e o gráfico de duplo-recíprocos: Km é alterada, mas a Vmáx não. Inibições e o gráfico de duplo-recíprocos: Km e Vmáx são alteradas. Inibições e o gráfico de duplo-recíprocos: Km e Vmáx são alteradas. Inibição irreversível: Na inibição irreversível o inibidor se combina com um grupo funcional da molécula ou destrói esse grupo funcional ou ainda se liga covalentemente à enzima. Atividade enzimática é afetada pelo pH: Atividade enzimática é afetada pela temperatura: Cofatores: Íons inorgânicos ou coenzimas que agem como componentes químicos essenciais para a atividade de certas enzimas. Cofatores: Íons inorgânicos ou coenzimas que agem como componentes químicos essenciais para a atividade de certas enzimas. Coenzimas: Moléculas complexas orgânicas ou metalo-orgânicas. Íons inorgânicos: Coenzimas: Metabolismo: Alosteria e regulações Uma via metabólica simples: Mapa metabólico: Vias metabólicas precisam ser reguladas:Vias metabólicas precisam ser reguladas: Enzima regulatória: a que define a velocidade total da via Modos de regular uma enzima: 1) Sítio alostérico, 2) Modificação covalente reversível, 3) Interação com proteínas regulatórias 4) Clivagem proteolítica Sítio alostérico, modulação positiva: Sítio alostérico, modulação negativa: Sítio alostérico, modulação negativa: Inibição retroativa Modificação covalente reversível: Fosforilações reguladoras: glicogênio fosforilase fosforilase fosfatase fosforilase quinase Clivagem proteolítica Zimogênio: pró-enzima que precisa ser clivada para ser ativa. Clivagem proteolítica tripsina quimotripsina Tipos de Reações Classificação das Enzimas: número EC Classificação das Enzimas: número EC Classificação das Enzimas: número EC glicose + ATP glicose 6-fosfato + ADP HK EC 2.7.1.1 2: Transferase 7: de grupos contendo fósforo 1: com um grupo álcool como aceptor 1: sendo este uma hexose Classificação das Enzimas: número EC EC 5.3.1.9 5: Isomerase 3: de oxido-redução intramolecular 1: interconvertendo aldoses e cetoses 9: sendo a aldose uma glicose 6-fosfato G6PI Classificação das Enzimas: número EC Ribozimas Ribozimas são RNAs que possuem atividade catalítica! Também são chamados Enzimas de RNA. Ribozima foi descoberta em Tetrahymena thermophila, um protozoário, por Thomas Cech e colegas em 1982. Essa ribozima é um intron do tipo I. Introns I fazem auto splice (união), splice de outros RNAs e outras reações de transesterificação. ribozima Estrutura secundária e terciária de ribozimas: Ribozima “hairpin” Estrutura secundária e terciária de ribozimas: Ribozima do tipo Intron I Ribozimas artificiais: Ribozimas naturais: A maior parte das ribozimas encontradas na natureza atuam como catalizadores em reações do metabolismo de RNA. Enzimas protéicas possuem atividade catalítica melhor do que ribozimas: 20 aminoácidos vs. ATCG. Porque existem RNA catalizadores? Qual a importância deles? Proteínas são melhores catalizadores... Dogmas biológicos: DNA RNA Proteína Toda Enzima é uma proteína Dogmas biológicos: DNA RNA Proteína Toda Enzima é uma proteínaNem Dogmas biológicos: DNA RNA Proteína Toda Enzima é uma proteínaNem Thomas Cech - Prêmio Nobel RNA na evolução: Primeira molécula? Hipótese do mundo do RNA 1) Apenas ribozimas RNA na evolução: Primeira molécula? 2) Ribozimas com cofatores aa 3) Ribozimas com cofatores 2aa, 3aa 4) Ribozima encolhendo, enzima proteica aumentando 5) Enzima protéica com cofatores nucleotídicos RNA na evolução: Primeira molécula? Last Universal Cellular Ancestor (Último Ancestral Celular Universal) Mundo das Ribonucleoproteínas (RNPs) Química prébiótica Mundo do RNA Mundo das RNPs Conclusão: Enzimas: catalisadores biológicos (proteínas ou RNA), RNAs como primeiras enzimas na evolução? A Estrutura é importantes para catálise enzimática, Sua cinética pode ser interpretada por equações, Afetam a velocidade, não o equilíbrio das reações, Possuem especificidade de substratos, Essenciais para a homeoestase, Podem precisar de cofatores São reguláveis
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