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Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 1 Material Didático Patologia Clínica Veterinária Carmen Lucia Garcez Ribeiro 2009 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE VETERINÁRIA DEPARTAMENTO DE CLÍNICA VETERINÁRIA DISCIPLINA DE PATOLOGIA CLÍNICA LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 2 COLHEITA, CONSERVAÇÃO E REMESSA DE MATERIAL PARA EXAMES LABORATORIAIS 1. Introdução: A Medicina Veterinária expande os recursos e aprimora constantemente técnicas para realização de exames laboratoriais, tornando mais acessível, prático e econômicos o uso de meios auxiliares de diagnóstico na rotina profissional. O Médico Veterinário ao chegar à região onde irá desenvolver suas atividades profissionais deve procurar informar-se sobre o serviço de apoio que poderá dispor tanto na área de diagnósticos veterinários, quanto do(s) laboratório(s) de análises clínicas da cidade, visitando os laboratórios. Os laboratórios da área veterinária geralmente pertencem a instituições de ensino ou pesquisa estaduais ou federais, sendo necessário receber informações dos serviços disponíveis, áreas de atuação (patologia, bacteriologia, virologia, toxicologia,...), técnicas utilizadas, tipos de amostras e conservação das mesmas para os diferentes tipos de técnicas, meios de transporte mais rápidos e eficientes, além de conhecer e manter contato com os profissionais dessas instituições contando com seu apoio quando necessário. Os laboratórios de análises clínicas principalmente em cidades do interior, trabalham na sua maioria para medicina humana, cabendo ao Veterinário informar-se do tipo de equipamentos disponíveis para realização do hemograma, pois a maioria dos contadores são ajustados ao tamanho dos eritrócitos humanos inviabilizando a sua utilização para a maioria das espécies domésticas, exceto a canina. Como os eritrócitos de quase todas as espécies animais, são menores que os humanos a cada amostra deveria ser calibrado o aparelho. Nesses casos o médico veterinário deve solicitar a hemocitometria manual em câmara de Neubauer, e o microhematócrito(mais preciso que a avaliação anterior). O contato prévio com os laboratórios facilita a conduta do profissional para acessar esses recursos, abre um canal de discussão com outros profissionais especialistas em diferentes áreas, padroniza o tipo de recipiente, conservantes e outras variáveis em conformidade com as normas e orientações técnicas de cada laboratório. O exame mais confiável, realizado em laboratório extremamente adequado e modernamente equipado, conduzido por profissionais excepcionalmente qualificados e interpretado pelos mais conceituados especialistas não supera o erro causado por uma técnica de coleta, tratamento ou conservação não apropriada da amostra. É fundamental que o profissional adote algumas medidas que passarão a ser rotina, iniciando pela preparação do paciente, passando pela coleta, manuseio, conservação e remessa da amostra ao laboratório. O Veterinário deve, portanto padronizar a coleta de amostras minimizando o máximo possível as variáveis que possam interferir nos resultados. 2. Variáveis relacionadas ao paciente: Alguns fatores relacionados ao paciente podem influenciar o resultado dos exames laboratoriais, e devem ser levados em consideração no momento da coleta da amostra, ou quando impossível evita-los serem considerados ao interpretar os resultados, são eles: 2.1. exercício- Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 3 O animal submetido a exercício físico pode ter seus parâmetros hematológicos totalmente alterados. Amostras colhidas nessas condições apresentarão hematócrito elevado, sobretudo naqueles animais que apresentarem elevada resposta esplênica. Também ocorre elevação na contagem total de leucócitos, devido ao fluxo sangüíneo acelerado e a liberação dos hormônios de estresse. Essas são alterações que voltam a normalidade alguns minutos ou horas após a realização de exercício. Quando a atividade física excessiva for prolongada poderá causar elevação de enzimas resultantes da atividade muscular (creatinaquinase-CK, aspartato-aminotansferase-AST e lactato desidrogenase-LD). 2.2. estresse emocional- Animais que saem do ambiente familiar e são levados para local estranho comumente ficam estressados, determinando alterações sistêmicas. O mesmo pode ocorrer com alguns animais quando são levados ao veterinário, nesses casos pode ocorrer liberação de epinefrina, que determina elevação da glicose sangüínea e aumento no número de leucócitos circulantes (leucocitose), no gato principalmente pela elevação do número de linfócitos (linfocitose) e nas demais espécies devido a migração ou recirculação de leucócitos, principalmente neutrófilos, do compartimento vascular marginal para o circulante (neutrofilia). Se houver liberação de glicocorticóides endógenos ocorrerá neutrofilia pelo aumento de neutrófilos segmentados, linfopenia e eosinopenia, o que caracteriza o que podemos denominar de “leucograma de estresse”. 2.3. dieta- Os animais devem ser submetidos a jejum de 8 a 10 horas prévio a coleta de amostra de sangue, caso contrário podem apresentar taxas de glicose e colesterol elevados, interferindo em outros testes. Animais monogástricos podem apresentar lipemia pós-prandial que predispõe a hemólise “in vitro”, alterando resultados do eritrograma, bem como elevando AST e LD séricas. 2.4. drogas- O uso de algumas drogas pode interferir nos resultados de exames laboratoriais. A tetraciclina interfere na determinação da glicose sérica, enquanto o ácido ascórbico quando administrado ou produzido endogenamente (cão), pode influenciar os testes de glicose e nitrato do exame químico da urina. A administração terapêutica de glicocorticóides altera a atividade fisiológica do paciente, aumentando a contagem total e diferencial de leucócitos, podendo em cães aumentar a atividade hepática elevando fosfatase alcalina(ALP) e alanina aminotransferase(ALT). Já a administração de insulina diminui as concentrações séricas de glicose, fosfato e potássio. A padronização do procedimento de colheita é indispensável e própria de cada clínica e/ou profissional minimizando fatores externos que possam interferir nos resultados das análises laboratoriais, mantendo o animal em ambiente tranqüilo, o menos estressado possível, preservando as condições de jejum , quando possível e necessário,antes de adotar qualquer medida terapêutica (salvo casos de monitoramento da eficácia terapêutica), etc. Essas atitudes são de plena responsabilidade do Médico Veterinário, que deve estar consciente de todas as conseqüentes alterações e repercussão de suas atitudes no resultado final e confiabilidade dos exames laboratoriais. 3. Variáveis relacionadas à amostra: Conforme os exames solicitados devem-se proceder à coleta do material biológico adequado. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 4 3.1 Amostras de sangue total 3.1.1 Amostras de sangue total contendo anticoagulante- São usadas para confecção de esfregaços e pesquisa de hemoparasitas, além da realização do hemograma no máximo até 24 horas após coleta, quando conservadas sob refrigeração. Anticoagulante e indicações: Amostras de sangue total poderão ser colhidas em tubos com o anticoagulante fornecido ou indicado pelo laboratório que executará o hemograma. Em veterinária o anticoagulante de eleição é o etileno diamino-tetraacetatode sódio ou potássio (EDTA), na concentração de 10 mg para 5ml de sangue, ou seja, 0,1 ml de solução de EDTA a 10%/5 ml de sangue total. São encontradas no comércio soluções aquosas de EDTA, prontas para uso, ele interage com o cálcio sérico impedindo sua ação no processo de coagulação,preserva a morfologia celular e seu custo é baixo. Laboratórios humanos preferem usar heparina como anticoagulante (1 mg/5 ml de sangue ou 0,1 ml a 1%/5 ml de sangue), porém em poucas horas poderá alterar a morfologia dos leucócitos dificultando a contagem diferencial à nível de esfregaço, e tem preço elevado. A heparina tem ação antitrombínica e antitromboplastínica. Para determinação de níveis séricos de glicose deve ser utilizado plasma com EDTA e fluoreto de sódio, pois esse último inibe a glicólise que seria efetuada pelos eritrócitos e leucócitos “in vitro”. 3.1.2 Amostras de sangue total sem anticoagulante- São colhidas em tubos de ensaio e deixadas em repouso por 30 a 60 minutos, para que ocorra coagulação, retração do coágulo e separação do soro. Dessas amostras é extraído o soro que é indicado para análises bioquímicas, e também quando é necessário a titulação ou simplesmente a pesquisa da presença de anticorpos contra determinados agentes infecciosos. Alguns veterinários remetem soro ao laboratório para determinação de níveis séricos de glicose, o que não é recomendado. 3.2 Recipientes de coleta e transporte: Amostras de sangue colhidas com seringas descartáveis ou de vidro, sempre que possível devem ser transferidas para tubos contendo anticoagulante, quando necessário. Nesses casos a agulha deve ser desacoplada da seringa e o sangue deve ser vertido lentamente escorrendo pela parede do frasco, exercendo suave pressão no êmbolo da seringa e misturando com o anticoagulante por sucessivos e suaves movimentos de inversão (10 X). Hemólise A hemólise "in-vivo" (patologia) é rara. Pode-se evitar a hemólise "in-vitro" através de: • uso de agulha limpa e afiada. • evitar pressão negativa excessiva na seringa durante a aspiração do sangue. • permitir que o álcool aplicado no local da punção do vaso seque completamente antes de se proceder à coleta. •desacoplar agulha da seringa e deixar o sangue escorrer lentamente pela parede do frasco, exercendo suave pressão no êmbolo da seringa • agitação e manuseio delicados da amostra e do tubo, inclusive ao homogeneizar com o anticoagulante Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 5 • centrifugação adequada. • remoção imediata do soro do coágulo. • não usar material quente (recém tirado de fornos de esterilização) • evitar umidade do material (recipiente ou tubo de armazenagem, seringa de vidro) que entrar em contato com a amostra. Para coleta podem ser usados tubos de auto-enchimento (à vácuo), que existem à disposição no comércio, cuja coloração da rolha varia de acordo com o exame ao qual se destina a amostra de sangue (Figura 1). Deve-se ter o cuidado de não encher demais os tubos de auto-enchimento com rolha lilás ou rocha, pois quando coletado sangue em maiores quantidades que as recomendadas teremos formação de coágulos, que também ocorrerão quando não houver perfeita homogeneização do sangue com o anticoagulante. Recipientes limpos, secos, frios (não usa-los logo após retirados de fornos ou estufas), herméticos (fechados com rolhas de borracha), geralmente aqueles frascos tipo de penicilina são os mais econômicos para colocar amostras para hemograma. Figura 1. Tubos comerciais para coleta de sangue Rolhas Anticoagulante Setor Material EDTA Hematologia Vidro ou plástico Gel separador com ativador de coágulo Sorologia e bioquímica Vidro ou plástico Citrato de Sódio Hematologia (Coagulação) Vidro Siliconizado sem anti-coagulante Sorologia e bioquímica Vidro ou plástico Heparina Sódica Bioquímica e Imunologia Vidro Fluoreto de sódio + EDTA Bioquímica Vidro ou plástico Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 6 3.3. Manuseio da amostra: As análises químicas e bioquímicas são feitas na porção extra-celular do sangue(plasma ou soro). O manuseio da amostra deve ser o mínimo e mais delicado possível, pois substâncias intra-celulares podem surgir quando ocorrer hemólise (proteínas, albumina, cálcio, ALT, AST), o que fatalmente afetará os exames.Também os parâmetros do eritrograma são alterados em função de hemólise. 3.4. Conservação da amostra: Sangue total com anticoagulante deve ser mantido em refrigeração por períodos máximos de 24 horas. Soro pode ser refrigerado por algumas horas ou para preservar por períodos mais longos deve ser congelado, evitando-se congelamentos e descongelamentos repetidos que afetam as proteínas séricas. Esfregaços de sangue em lâminas de vidro devem secar no ambiente, podendo ser remetidos ao laboratório fixados, ou não, em metanol. Devem ser confeccionados dois ou três esfregaços de cada material coletado. 3.5. Remessa da(s) amostra(s) ao laboratório As amostras devem ser identificadas individualmente com etiquetas auto-adesivas, fita crepe ou diretamente no vidro escrevendo com caneta tipo retro projetor. Lâminas de vidro devem ser acondicionadas em embalagens adequadas, ou embaladas de modo que não haja atrito para não danificar os esfregaços, sendo remetidas sem qualquer conservante. Todo o material deve ser acompanhado de ficha de identificação, com o maior número de informações possíveis, onde deve constar história clínica, suspeita diagnóstica, análises requisitadas, telefone para contato, etc. As amostras devidamente acondicionadas em caixa de isopor, contendo gelo embalado em saco plástico (o que dificulta o contato da amostra com o gelo ou água de degelo), devem ser encaminhadas ao laboratório o mais rápido possível, evitando os fins de semana. Os locais recomendados para punção venosa para obtenção de amostras de sangue para triagem diagnóstica ,como hemograma e perfil bioquímico, são veia jugular, em caninos pequenos, felinos, eqüinos e bovinos, e veia cefálica ou jugular, em caninos de médio a grande porte. Esses exames geralmente requerem de 5 a 12mL de sangue, dependendo do laboratório e da complexidade dos procedimentos de triagem. Tabela 1. LOCAIS DE COLETA DE SANGUE E AGULHAS INDICADAS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS ESPÉCIE ANIMAL VEIA AGULHA CANINOS CEFÁLICA,JUGULAR,SAFENA 25x7; 25x8; 25x9; 25x12 FELINOS CEFÁLICA,JUGULAR,SAFENA 25x7; 25x8 BOVINOS JUGULAR, COCCÍGEA 40x12; 40x16 EQÜINOS JUGULAR 40x12; 40x16 OVINOS E CAPRINOS JUGULAR 40x10; 40x12; 40x16 SUÍNOS CAVA ANTERIOR 40x12; 40x16 25x7 = 25 mm DE COMPRIMENTO E 0,7 mm DE CALIBRE Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 7 ERITROGRAMA/ERITROGÊNESE 1. INTRODUÇÃO Os exames hematológicos estão entre os mais práticos e econômicos, além de maior utilidade na rotina clínica. Isto deve - se ao fato de que o tecido sangüíneo tem por função principal manter a homeostase corpórea; deste modo, é um "espelho" do animal no momento da colheita Juntamente com o exame de fezes e a urinálise, o hemograma forma a primeira linha de exames, ou seja, exames de triagem clínica. Quando bem indicado e o material bem colhido e adequadamente acondicionado, pode prestar auxílio ao clínico quer no diagnóstico, no prognóstico como no controle terapêutico. 1.1 SANGUE: 1.1.1 Composição: O sangue é composto por uma parte líquida (55 a 60% do sangue total) e outra celular (40 a 45 %). A parte líquida, chamada plasma "in vivo", ou "in vitro" quando comanticoagulante, possui 90% de água, 7% de proteínas(fibrinogênio, albumina e globulinas) ,e 3% dos mais variados solutos orgânicos, como minerais, enzimas, hormônios, gordura, etc. Quando ocorrer coagulação do sangue, a parte líquida é chamada soro, e não contém fibrinogênio. A parte celular é composta pelos eritrócitos, leucócitos e plaquetas. Os leucócitos são constituídos pelos granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e os agranulócitos (linfócitos e monócitos). 1.1.2 Funções: A principal função do sangue é o transporte, tanto de substâncias essenciais para a vida das células ( oxigênio, gás carbônico, nutrientes, hormônios ), quanto de produtos oriundos do metabolismo e indesejáveis para o organismo, que são levados aos órgãos de excreção. Ao sangue também é atribuído o papel de defesa imunológica, hemostasia e diversos outros, como o transporte de calor. 1.1.3 Volume: O volume sangüíneo normal nas espécies domésticas está em torno de 6 a 10 % do peso corporal, com grande variação entre e intra - espécies. Dentre os pequenos animais, o cão possui aproximadamente 9 a 10 % e o gato 7 % ; por esse motivo a anemia nos gatos é mais severa. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 8 Tabela 2. VOLEMIA X PESO CORPORAL EM ANIMAIS DOMÉSTICOS Peso corporal Animal ml de sangue/kg % Vacas leiteiras jovens, cavalos de corrida 88 - 110 10 - 11 Cães 77 - 78 8 - 9 Vacas lactantes, bovinos em crescimento 66 - 77 7 - 8 Vacas não lactantes, ovelhas, cabras, gatos, cavalos de trabalho 62 - 66 6 - 7 Suínos adultos 55 5 - 6 Animais de laboratório - 6 - 7 2.1 HEMATOPOIESE PRÉ - NATAL: A hematopoiese durante a vida uterina inicia-se no vitelino, fígado, baço e medula óssea que tornam - se sucessivamente hematopoiéticamente ativos. O saco vitelino inicialmente é colonizado por células pluripotenciais embrionárias, surgindo os primeiros eritroblastos; neste estágio, há o início da formação vascular do embrião. As células pluripotenciais migram até o fígado, iniciando a produção de hemácias, leucócitos e plaquetas. A hematopoise esplênica se segue, mas na maioria das espécies é pouco representativa. A medula óssea assume gradativamente o papel da hematopoiese, até que ao nascimento torna-se o principal sítio de produção eritrocitária. 2.2 HEMATOPOIESE PÓS - NATAL : A hematopoise ocorre extravascularmente na medula dos mamíferos; nas aves a granulopoiese ocorre em sítios extravasculares e a eritropoiese ocorre intravascularmente. Não existem megacariócitos na medula das aves e os trombócitos provavelmente são produzidos intravascularmente por uma linhagem celular específica A medula óssea de todos os ossos é hematopoiéticamente ativa ao nascimento e durante a vida neonatal. Esta atividade envolve a produção vigorosa de eritrócitos e outras células mielóides. A fase de crescimento rápido do jovem é associada à expansão do volume sangüíneo, com grande demanda de eritrócitos na medula. Como a demanda por eritrócitos diminui na idade adulta, a hematopoiese se restringe a medula de alguns ossos do corpo. Nos demais locais a medula vermelha, hematopoieticamente ativa, é substituída por medula amarela. A medula continua ativa (medula vermelha) nos ossos chatos (esterno, costelas, crânio e vértebras) e nas epífises dos ossos longos (úmero e fêmur). Quando houver aumento da demanda eritrocitária, a medula amarela pode ser novamente ativada; entretanto na fase senil esta medula amarela passa a medula cinzenta, já fibrosada de difícil e vagarosa expansão. ÓRGÃOS ENVOLVIDOS NA HEMATOPOIESE � MEDULA: a medula óssea vermelha é composta de várias células sangüíneas e seus precursores, células reticulares, fibras reticulares, camadas endoteliais de sinusóides e células adiposas. As células adiposas ocupam o lugar das ilhas hematopoiéticas na substituição da medula vermelha por medula amarela. 2. HEMATOPOIESE Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 9 � BAÇO: - armazena e elimina hemácias; - hematopoiese inicial. � FÍGADO : - hematopoiese inicial; - depósito de vitamina B¹² e ácido fólico (fatores de multiplicação das hemácias); - depósito de ferro na forma ferrosa (fator de maturação de hemácias); produz os fatores de coagulação, com exceção do VII; - produz albumina, eritropoietinogênio, α e β globulinas; - realiza o metabolismo das bilirrubinas. � ESTÔMAGO: - produz o fator intrínseco que facilita a absorção da vitamina B¹²( ruminantes sintetizam essa vitamina); - auxilia a absorção de ferro com a produção de ácido clorídrico, que transforma a forma férrica em ferrosa. � LINFONODOS: - produzem linfócitos T e B. � MUCOSA INTESTINAL: - absorve ferro, vitamina B¹² e demais nutrientes necessários para a hematopoiese. � RINS: - produzem eritropoietina e eritrogenina. � SISTEMA MONOCÍTICO FAGOCITÁRIO: - macrófagos. 3.1 CICLO ERITROCITÁRIO: A eritropoiese normal envolve um mínimo de quatro mitoses: uma na fase de rubroblasto, outra no estágio de pró-rubrócito e duas na fase de rubrócito basofílico. O rubrócito basofílico matura-se em rubrócito policromático, que se transformará em metarrubrócito. Ocasionalmente, o rubrócito policromático pode se dividir. A denucleação do metarrubrócito leva a formação do reticulócito, que finalmente matura , originando o eritrócito. O processo de eritrogênese dá origem aos eritrócitos , é conhecido como eritropoiese, e leva cerca de 7 a 8 dias para se completar. O núcleo expulso é fagocitado por macrófagos locais na medula. A fase de proliferação, compreendida desde a célula pluripotencial até metarrubrócito, leva de 2 a 3 dias, e a fase maturativa leva ao redor de 5 dias. Mediante estímulos, principalmente da eritropoietina, a eritropoiese pode ser reduzida para 5 dias, já havendo resposta ativa no terceiro dia de estímulo. 3.2 REGULAÇÃO: A célula pluripotencial na medula óssea se diferencia e origina as células unipotenciais, cada uma restrita às séries eritróide, mielóide e megacariocítica (Fig. 2). Esta diferenciação ocorre sob influência do microambiente vascular local e por citocinas produzidas por macrófagos e linfócitos T ativados. A eritropoiese inicia-se com a diferenciação da célula pluripotencial em progenitor eritróide jovem, que se transforma na unidade formadora de colônia eritróide (chamada de UFC-E). A UFC-E divide-se, formando os precurssores eritróides, rubroblastos no espaço extravascular da medula óssea. Os rubroblastos após divisões e maturação, transformam-se em eritrócitos adultos(Fig. 3). A formação de progenitores eritróides é regulada pela interleucina-3 e pelo fator estimulador de colônia granulocítica-monocítica(FEC-GM). As UFC-E e sua progênie são sensíveis e responsivas à eritropoietina. 3.ERITROCINÉTICA Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 10 3.3 CONTROLE DA ERITROPOIESE A eritropoietina é um hormônio glicoproteico responsável por promover a viabilidade, proliferação e diferenciação das células progenitoras eritróides , que expressam receptores de superfície específicos para eritropoietina.A produção de eitropoietina é estimulada pela hipóxia tecidual, mas apesar desse sensor para oxigênio não estar bem definido, existem evidências de que a proteína heme possa estar envolvida . O rim é o principal órgão produtor de eritropoietina nas diversas espécies animais, sendo o responsável exclusivo por esta função nos caninos. O fígado é o outro produtor de eritropoietina em adultos ,e o maior local de produção em fetos de mamíferos. A produção de eritropoietina é também atribuída a macrófagos da medula óssea, podendo serpossível que exerçam uma pequena e limitada regulação da eritropoiese . Existem evidências de que a proteína heme possa estar envolvida como sensor para o oxigênio. A tensão de oxigênio é regulada pelo consumo de oxigênio pelos tecidos e a capacidade de distribuição do oxigênio pelo sangue. Essa capacidade de distribuição do oxigênio depende da integridade do sistema cardiovascular, do conteúdo de oxigênio do sangue arterial e da afinidade hemoglobina - oxigênio. Baixo conteúdo de oxigênio no sangue pode resultar de parcial baixa tensão, como a que ocorre em altas altitudes ou com defeitos cardíacos congênitos onde parte do sangue flui para a circulação pulmonar. Baixo conteúdo de oxigênio no sangue também pode ocorrer com pressão de oxigênio normal, tal como ocorre em anemia e metahemoglobinemia. A eritropoietina é gerada pela ativação do eritropoietinogênio , uma α 2- globulina produzida pelo fígado, pelo fator eritropoiético renal(FER) ou eritrogenina, ou ainda pela ativação da pró-eritropoietina, produzida nos rins, por um fator plasmático, segundo alguns autores. A eritropoietina é encontrada no plasma, urina, leite e outros fluidos, incluindo líquido amniótico. A eritropoietina estimula a eritropoiese em vários estágios, por indução da diferenciação de células progenitoras eritróides a rubroblastos, estimulando a mitose de células eritróides e reduzindo o tempo de maturação, bem como aumentando a liberação de reticulócitos e hemácias jovens no sangue periférico. Vários órgãos endócrinos influenciam a eritropoiese, principalmente através de efeitos na síntese de eritropoietina. A hipófise media esse efeito com a produção de prolactina, TSH, ACTH e hormônio de crescimento; a adrenal através da produção de corticosteróides; a tireóide pela tiroxina e as gônadas pelos andrógenos e estrógenos. Somente os estrógenos, em doses altas, possuem influência negativa na síntese de eritropoietina. Para que ocorra a adequada multiplicação eritrocitária, há necessidade também de substrato para possibilitar a divisão celular, principalmente material nucleico. Os de maior importância são vitamina B12, ácido fólico, cobalto e ácido nicotínico. Na fase de maturação eritrocitária, o RNA mensageiro ribossômico encarrega-se da hemoglobinização citoplasmática. Neste estágio são importantes ferro na forma ferrosa(Fe++), cobre e piridoxina (vitamina B6). 3.4 TEMPO DE VIDA E DESTRUIÇÃO ERITROCITÁRIA Os eritrócitos de cada espécie animal possuem uma vida média intravascular característica, espécies em que os eritrócitos duram menos de 100 dias normalmente possuem mais reticulócitos na circulação. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 11 A perda de eritrócitos é continuamente balanceada por uma liberação de reticulócitos ou células jovens da medula óssea para o sangue periférico. A destruição eritrocitária pode ocorrer em sítios intravasculares, por mudança da permeabilidade de membrana e por fragilidade celular, ou em sítios extravasculares, pela ação do sistema fagocítico mononuclear (SFM). A deformabilidade é importante no tempo de vida das hemácias e depende da manutenção de sua forma, fluidez normal interna da hemoglobina e propriedades visco-elásticas intrínsecas da membrana. Qualquer mudança nestas características pode ativar a destruição fagocitária por macrófagos, que ocorre primariamente no baço e fígado, mas também pode ocorrer na medula óssea. Os macrófagos iniciam a fagocitose após reconhecerem anticorpos IgG aderidos a antígenos de membrana em eritrócitos danificados ou envelhecidos. Tabela 3. TEMPO MÉDIO DE VIDA DOS ERITRÓCITOS NOS ANIMAIS DOMÉSTICOS ESPÉCIE VIDA MÉDIA/DIAS Caninos 110 - 120 Suínos 65 Felinos 65 - 77 Bovinos 155 - 162 Eqüinos 140 - 150 Ovinos 70 - 130 Caprinos 125 Figura 2. Hematopoese Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 12 Figura 3. Representação esquemática da ERITROGÊNESE O hemograma é o exame realizado com uma amostra de sangue total com anticoagulante, colhida de um paciente, com o objetivo de auxiliar o clínico na confirmação ou não de uma suspeita diagnóstica, bem como avaliar o estado geral de um animal , avaliar a eficácia terapêutica e a evolução de uma doença. O hemograma é um "espelho" do estado geral do animal no momento da colheita do sangue. Podemos comparar a análise laboratorial de uma amostra de sangue, a uma imagem parada por um momento em um filme, onde ninguém se move nem fala, ao colhermos a amostra teremos nela o reflexo sistêmico do que está ocorrendo naquele momento, naquele animal. O hemograma completo divide-se em: eritrograma, leucograma e dosagem de proteínas plasmáticas totais. Podem também ser realizados quando solicitados contagem de plaquetas, contagem de reticulócitos e dosagem de fibrinogênio. 4.1 ERITROGRAMA É a avaliação dos eritrócitos, ou série vermelha , e compreende: � Contagem de eritrócitos/µl � Dosagem de hemoglobina (g/dl) � Medição do volume globular ou microhematócrito (%) HEMOGRAMA Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 13 � Cálculo dos índices hematimétricos: VCM (volume corpuscular ou celular médio), CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média) � Análise da morfologia dos eritrócitos 4.2 LEUCOGRAMA É a avaliação leucocitária , ou da série branca e engloba os seguintes parâmetros: � Contagem total de leucócitos/mm³ � Contagem diferencial de leucócitos : valores relativos % ; valores absolutos/mm³ � Avaliação da morfologia dos leucócitos 4.3 OUTRAS DETERMINAÇÕES � Dosagem de Proteínas Plasmáticas Totais (PPT) -g/dl � Dosagem de fibrinogênio plasmático -mg/dl � Contagem de reticulócitos 5. ERITRÓCITOS: Os eritrócitos são também chamados de hemácias ou glóbulos vermelhos. O termo eritrócito vem do grego erytros, que significa vermelho. As hemácias possuem tamanhos e vida média variável de acordo com a espécie animal. Em condições normais, correspondem a cerca de 40% de todo o volume sangüíneo, índice mais ou menos constante para todas as espécies, independente do tamanho do eritrócito. Denomina-se ERITRON o conjunto de todos os eritrócitos circulantes e seus precursores nucleados nos tecidos hematopoiéticos. Nas doenças eritrocitárias, devemos sempre considerar o eritron e não apenas as hemácias circulantes porque estas doenças atingem o tecido como um todo. Portanto, em muitas situações o veterinário deve além do hemograma para avaliar o sangue circulante, fazer também uma biópsia aspirativa de medula óssea,onde será avaliado o tecido hematopoético. 5.1 FUNÇÃO: A função das hemácias é desempenhada pelo seu componente principal, a HEMOGLOBINA, e consiste no transporte de oxigênio dos pulmões para os tecidos e de gás carbônico no sentido inverso. 5.2 COMPOSIÇÃO: A membrana dos eritrócitos é formada por duas camadas protéicas envolvendo uma camada lipídica (onde se destaca o colesterol). A membrana possui carga elétrica negativa, que diminui com o envelhecimento da célula, e com a sua exposição a antibióticos. Ela é bastante flexível, permitindo a passagem do eritrócito pelos sinusóides estreitos do fígado e baço. A deformabilidade é importante na vida média do eritrócito e depende da manutenção da sua forma, da fluidez da hemoglobina e das propriedades viscoelásticas da membrana. Com o envelhecimento da célula, a membrana perde a flexibilidade. As mudanças nas características do eritrócito ativam a fagocitose que é feita principalmente pelos macrófagos do fígado e baço.Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 14 5.3 MORFOLOGIA DOS ERITRÓCITOS A observação microscópica de um esfregaço de sangue corado com Giemsa, Wright, My Grunwald-Giemsa, Leishmann ou Panóptico rápido (qualquer corante do tipo Romanowsky usado em hematologia), permite a avaliação de características morfológicas dos eritrócitos dentre elas a forma, tamanho e cor. 5.3.1 Tamanho dos eritrócitos: O tamanho dos eritrócitos é variável nas diferentes espécies de animais (Tabela e Figura 4). A espécie canina é a única que tem seus eritrócitos com tamanho similar aos dos humanos (7,5µ). Tabela 4. Tamanho dos eritrócitos ESPÉCIE TAMANHO (µ) Caninos 7,0 Suínos 6,0 Felinos 5,8 Bovinos 5,5 Eqüinos 5,7 Ovinos 4,5 Caprinos 3,2 A observação microscópica de um esfregaço sangüíneo, deve mostrar ao observador uma monocamada delgada de eritrócitos, como um tapete de células, com um padrão de tamanho constante, uniforme, sem variação. Figura 4.Tamanho dos eritrócitos em esfregaço canino felino bovino equino caprino ovino Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 15 -ALTERAÇÕES NO TAMANHO DOS ERITRÓCITOS- O termo anisocitose caracteriza a presença de eritrócitos de diferentes tamanhos num mesmo esfregaço de sangue. Ela pode ser melhor definida de acordo com o tipo de alteração encontrada: � MACROCITOSE é a presença de eritrócitos de tamanho acima do normal para a espécie (macrócitos).Acontece geralmente pela presença de reticulócitos e metarrubrócitos, ou por deficiência dos fatores de multiplicação (vitamina B 12, ácido fólico, niacina e cobalto). Pode acontecer fisiologicamente em cães jovens (até dois ou três meses de idade), e em cães da raça Poodle. � MICROCITOSE é a presença de eritrócitos com tamanho abaixo do normal (micrócitos). Aparecem geralmente em anemias crônicas, anemias ferropriva (por deficiência de ferro), ou por deficiência de fatores de maturação (vitamina B 6, cobre, riboflavina e aminoácidos). Pode aparecer fisiologicamente em cães da raça Akita. 5.3.2 COR DOS ERITRÓCITOS (propriedades tintoriais) Os eritrócitos coram-se de róseo, vermelho claro ou alaranjado, como resultado da afinidade da hemoglobina pela eosina (corante ácido) das colorações usadas em hematologia. Apresentando uma área central mais clara. -ALTERAÇÕES NA COR DOS ERITRÓCITOS- O termo usado para descrever variações na coloração característica dos eritrócitos é policromasia ou policromatofilia (Figura 5). É caracterizada pelo aparecimento de grandes hemácias azuladas, que possuem afinidade por corantes basofílicos. Estas células representam os reticulócitos corados com os corantes usados em hematologia, que só são evidenciados em seu aspecto característico, reticular, com o uso de um corante especial (novo azul de metileno), que precipita os restos de RNA presentes no interior dos reticulócitos. Estas células estão presentes em resposta as anemias regenerativas. Figura 5. Alterações na cor dos eritrócitos cor normal policromatofilia hipocromia hipercromia-esferócitos Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 16 Alterações na coloração dos eritrócitos podem ser também: � HIPOCROMIA é a diminuição da intensidade da cor (palidez) dos eritrócitos, devido à diminuição do conteúdo de hemoglobina que aparece em casos de deficiência de ferro ou de piridoxina (vitamina B6). � HIPERCROMIA é o aumento da intensidade da cor dos eritrócito, devido a uma maior concentração de hemoglobina. Como a quantidade de hemoglobina de cada eritrócito não ultrapassa o limite fisiológico, esta alteração é apenas relativa, devido a diminuição da área da membrana do eritrócito, que é o que acontece em casos de esferocitose. 5.3.3 FORMA DOS ERITRÓCITOS (fig. 6): Os eritrócitos dos mamíferos são células anucleadas, redondas, em forma de disco bicôncavo (discócito), com exceção das hemácias dos camelídeos que são ovais (ovalócitos). As hemácias de aves e répteis são ovais e nucleadas. Figura 6. Forma dos eritrócitos disco biconcave-ME disco biconcave-MO lhama aves -ALTERAÇÕES NA FORMA DOS ERITRÓCITOS (Figura 7)- POIQUILOCITOSE é uma designação genérica usada para caracterizar a presença de eritrócitos de diferentes formas num mesmo esfregaço sangüíneo. Geralmente está relacionada com processos anêmicos. Pode-se definir melhor qual a alteração que está ocorrendo com alguns desses outros termos: � ESFERÓCITOS: são eritrócitos esféricos, com diâmetro reduzido , sem a área pálida central característica. Estas células são formadas em casos de anemias auto-imunes, quando uma porção da membrana do eritrócito, marcada por anticorpos, é fagocitada por células do sistema mononuclear fagocítico (SMF), porém sem perda do conteúdo hemoglobínico. Como resultado temos redução do volume globular do eritrócito(microcitose), com teor de hemoglobina normal , o que nessa menor área determina hipercromia. O achado destas células é diagnóstico para anemia imuno- mediada. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 17 � ESQUISÓCITOS: este termo vem do grego schistos, que significa rachar, dividir em pedaços. São células deformadas ou fragmentos de eritrócitos, que se formam na passagem de eritrócitos em vasos sangüíneos irregulares (como aqueles formados em hemangiossarcomas) ou em pequenos vasos ocluídos por fibrina (caso de coagulação intra-vascular disseminada - CID). Também ocorrem como resultado de um defeito de produção, da destruição acelerada de eritrócitos, em doenças renais crônicas, doenças esplênicas e anemia ferropriva. � EQUINÓCITOS (eritrócitos crenados): é o nome dado a presença de eritrócitos estrelados. Seu aparecimento não tem significado clínico, pois são artefatos que surgem conseqüência de problemas na confecção do esfregaço, tais como atraso na secagem ou desidratação rápida do eritrócito (ele murcha e adquire esta forma), ou excesso de EDTA. � CODÓCITO (célula alvo): célula vermelha que possui uma área central densa de hemoglobina separada parcial ou completamente por uma área circular clara de uma região periférica hemoglobinisada. Resulta do aumento dos níveis de colesterol. � ACANTÓCITOS: célula vermelha com forma irregular, com projeções de dimensão variável na superfície, surge em conseqüência do aumento das taxas de colesterol e/ou fosfolipídeos . Outra alteração com relação à forma dos eritrócitos diz respeito ao aparecimento de formas imaturas. As formas imaturas que podem aparecer ao exame do esfregaço são: � RETICULÓCITOS: são eritrócitos jovens, que ainda não completaram a fase de maturação. Eles recebem este nome porque quando são corados com corantes supra- vitais (novo azul de metileno ou azul de cresil brilhante), que possuem afinidade por material nuclear ,os restos de RNA ainda presentes no seu citoplasma precipitam, adquirindo um aspecto reticulado. Ribossomos, mitocôndrias e outras organelas citoplasmáticas contribuem para a formação desses precipitados apresentando-se em forma de cordão nos reticulócitos agregados , ou em forma de pequenos grânulos nos reticulócitos pontilhados. Em animais normais, geralmente 1 a 2 % dos eritrócitos circulantes são reticulócitos. Quando existe uma resposta à anemia(anemia regenerativa), Há aumento desse percentual. A única exceção é a espécie eqüina , que não lança reticulócitos na circulação em nenhuma circunstância,ou seja, apenas as hemácias maduras são liberadas da medula. Os herbívoros não possuem normalmente reticulócitos circulantes, e só raramente são encontrados, mesmo em marcadas anemias. Já os cães e gatos respondem acentuada reticulocitose durante resposta a anemias. Esses reticulócitos maturam em 24 a 48 horas na circulação ou no baço, onde podem ser temporariamente seqüestrados. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 18 Figura 7. Alterações na forma dos eritrócitos esquisócitos equinócitos codócitos acantócitos policromatófilo reticulócito agregado metarrubrócito � METARRUBRÓCITOS: são o último estágio nucleado das hemácias, ou seja, a fase anterior a de reticulócitos. Podem aparecer ocasionalmente em baixos números (1 metarrubrócito para 100 leucócitos). Também podem aparecer em maior número, em caso de resposta intensa a anemias graves, ou na presença de problemas esplênicos. A figura 8 mostra esquematicamente a evolução de eritroblastos até reticulócito. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 19 Figura 8. Formação de reticulócito CORPÚSCULOS DE INCLUSÃO (Figura 9): � CORPÚSCULOS DE HOWELL-JOLLY: são pontos basofílicos,quase negros, geralmente periféricos, formados por restos nucleares que permaneceram no citoplasma dos eritrócitos, e podem aparecer eventualmente em animais normais. Em casos de anemias regenerativas podem aparecer em número aumentado, sendo retirados da circulação pelo baço. Desta forma, em presença de doença esplênica, também aparecerão em maior número. � CORPÚSCULOS DE HEINZ: são formações de hemoglobina desnaturada e precipitada, com formato arredondado, pequeno e refringente. Em gatos é normal o aparecimento de corpúsculos de Heinz em até 1% das hemácias. Surgem em quantidades aumentadas, em todas as espécies, pelo uso de drogas oxidantes, tais como fenotiazina (eqüinos são sensíveis) e acetaminofen (felinos são muito sensíveis). Alguns alimentos, como couve e cebola, podem provocar este tipo de inclusão em algumas espécies, principalmente cães e gatos. Também existem citações da ocorrência de corpúsculos de Heinz em cães esplenectomizados e após o tratamento com glicocorticóides. � CORPÚSCULOS DE LENTZ: são inclusões de tamanho variável, algumas bastante grandes, com coloração variando do cinza pálido até rosa forte. Representam a inclusão do vírus causador da cinomose canina, aparecendo em aproximadamente 20% dos casos. Seu achado é patognomônico para essa doença. Também pode ocorrer em neutrófilos e monócitos. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 20 � PONTEADO BASOFÍLICO (Figura 10): são pequenos pontos basofílicos que aparecem no interior de hemácias, geralmente em intensa eritropoiese ou em casos de intoxicação por chumbo. Figura 10. Ponteado basofílico OUTRAS ALTERAÇÕES DOS ERITRÓCITOS: Figura 9. Corpúsculos de inclusão nos eritrócitos corpúsculos de Howell-Jolly Corpúsculos de Lentz Corpúsculos de Heinz Figura 11. Alterações na distribuição dos eritrócitos Rouleaux Aglutinação Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 21 Dentre as alterações na distribuição dos eritrócitos (Figura 11) podemos encontrar: � ROULEAUX: é o nome dado para a disposição dos eritrócitos em forma de pilha de moedas. A intensidade destas formações tende a acompanhar a velocidade de hemossedimentação e está associada ao aumento da concentração de fibrinogênio e a alterações quantitativas das globulinas séricas. Desta forma, costumam aparecer em casos de inflamação e desidratação. Em eqüinos, que possuem uma alta velocidade de hemossedimentação, o achado de rouleaux é comum e sem significado clínico. � AGLUTINAÇÃO: é o fenômeno no qual as hemácias ficam agrupadas, formando grumos, que podem ser visíveis, às vezes, nas paredes do frasco que contém a amostra de sangue (macroaglutinação), outras vezes é visível somente ao observar o esfregaço de sangue corado no microscópio (microaglutinação). Por estar relacionada com a presença de anticorpos anti-eritrócitos, o achado de aglutinação é um forte indício de anemia imuno-mediada. � HEMOPARASITAS: podem ser observados, no exame do esfregaço de sangue corado, vários tipos de hemoparasitas, tais como: � RIQUÉTSIAS(Figura 12): parasitas de hemácias do gênero Haemobartonella canis, em forma de cocos, ou Haemobartonella felis , em forma de bacilos, ambas sendo formações muito pequenas e geralmente periféricas; e, em bovinos, do gênero Anaplasma ,que são pequenos pontos escuros (Anaplasma centrale -localização central nas hemácias, Anaplasma marginale - localização periférica no interior das hemácias). � PROTOZOÁRIOS(Figura 13): gênero Babesia,, que se apresenta no interior dos eritrócitos, em forma de gotas únicas ou em dupla unidas pelos vértices, em bovinos (Babesia bovis, Figura 12. Riquétsias nos eritrócitos Anaplasma centrale Anaplasma marginale Haemobartonella cannis Haemobartonella felis Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 22 Babesia bigemina), eqüinos (Babesia cabali, Nutalia equi ), e caninos (Babesia canis); do gênero Plasmodium ,causador da malária em répteis, aves, cães, gatos, macacos e humanos; do gênero Tripanosoma, que ser visto livre no plasma. � LARVAS DE HELMINTOS(Figura 14): tais como microfilárias dos gêneros Dirofilaria immitis e Dipetalonema reconditum, encontradas no sangue de cães em regiões litorâneas. Figura 13. Protozoários nos eritrócitos Babesia bovis Babesia bigemina Babesia equi Babesia canis Tripanossoma Figura 14. Larvas de Helmintos Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 23 5.3.4 NÚMERO DE ERITRÓCITOS: O número de eritrócitos no sangue dos animais domésticos varia conforme a espécie, e está estreitamente relacionado com o tamanho. Assim, animais como caprinos e ovinos que possuem eritrócitos menores que a maioria das espécies (3,2 a 4, 5 µ), chegam a possuir mais que o dobro de eritrócitos circulantes que a espécie canina (7µ), pois o tamanho também equivale ao dobro (Tabela 5). Alguns fatores fisiológicos influenciam o número de eritrócitos circulantes, entre eles podemos destacar: a) Idade: animais recém nascidos possuem maior número que adultos. b) Sexo: machos possuem 5 a 10 % mais eritrócitos que fêmeas c) Capacidade de trabalho: atividade física intensa aumenta o número de eritrócitos circulantes, devido a ação da epinefrina . d) Raça: em eqüinos, os Puro Sangue Inglês (PSI) , possuem maior número de eritrócitos que as demais raças . e) Altitude: animais que vivem em regiões de altas altitudes, onde a pressão de oxigênio é mais baixa , possuem maior número de eritrócitos circulantes .f) Alimentação: animais com deficiente alimentação, principalmente com carências vitamínicas ocorrem alterações na produção de eritrócitos refletindo – se na diminuição do número de eritrócitos. MÉTODOS DE CONTAGEM DE ERITRÓCITOS (HEMATIMETRIA) a) Manuais:A amostra de sangue contendo anticoagulante após homogeneizada é aspirada com a pipeta de Thoma até a marca 0,5 , e suas paredes externas são limpas com algodão ou papel , sendo então preenchida com diluente ( solução fisiológica tamponada , Gower , ... ). As extremidades da pipeta são tapadas com a ponta dos dedos do operador, e a pipeta é agitada por inversão, sendo imediatamente desprezadas as primeiras gotas para então preencher por capilaridade a câmara de Neubauer . São contadas as hemácias de cinco retículos da divisão central que são escolhidos em diagonal, ou os dos vértices e um central, e o resultado é multiplicado por 10.000 / µl ou mm³. Tabela 5. NÚMERO DE ERITRÓCITOS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS ESPÉCIE Nº DE ERITRÓCITOS X 10.000.000 /µl CÃO 5,5 – 8,5 GATO 5,0 - 10 BOVINO 5,0 - 10 OVINO 8,0 - 16 CAPRINO 8,0 - 18 Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 24 Erros de contagem manual: diluição (preenchimento de pipeta), homogeneização, distribuição na câmara ( o calor da lâmpada do microscópio desidrata e concentra as hemácias ). b) Eletrônicos: (Counter ou contador eletrônico) é um método mais preciso e mais rápido. A maioria dos contadores eletrônicos deve ser calibrado para a espécie animal, devido a diferença de tamanho dos eritrócitos .Geralmente o laboratório calibra o aparelho para a espécie animal que os veterinários enviam amostras com maior freqüência, e usa o método manual para as amostras das outras espécies animais. Se for um laboratório de análises clínicas humano \, as amostras de caninos poderão ser processadas no contador automático, e as demais a hematimetria será manual, salvo naqueles laboratórios com equipamentos mais sofisticados ( O aparelho apresenta erro constante de 10%). 5.4 HEMOGLOBINA A hemoglobina é uma proteína conjugada composta por uma proteína simples, a globina,e por um núcleo prostético tipo porfirina , chamado heme , cujo principal componente químico é o ferro na forma ferrosa (Figura 15) . Cada molécula consiste de quatro unidades heme, cada uma dessas associada a uma cadeia simples de globina.A fração heme é sintetizada na mitocôndria eritrocitária , e somente é produzida até o estágio de reticulócito , pois eritrócitos maduros não possuem organelas . A síntese da fração globina ocorre em ribossomas, no citoplasma de eritrócitos nucleados, sendo as diferenças nas seqüências de aminoácidos quem define a variação morfológica intra e inter espécies . Figura 15. Estrutura da hemoglobina A sua principal função é respiratória, transporte de oxigênio e gás carbônico. A hemoglobina é encontrada livre no plasma só quando houver hemólise , quando o eritrócito rompe e libera a hemoglobina que no plasma possui vida média de quatro horas , é decomposta por oxidação, liga – se a haptoglobina sendo excretada pelos rins (hemoglobinúria), ou é destruída no sistema mononuclear fagocítico . O excesso livre é oxidado em metahemoglobina , que se dissocia liberando hematina removida pelos hepatócitos após ter formado complexos ao ligar-se a albumina . Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 25 Nos macrófagos o ferro da fração heme e os aminoácidos da fração globina são reciclados para reutilização. A protoporfirina é degradada em biliverdina que é convertida a bilirrubina, que liga-se a albumina plasmática para ir ao fígado onde é conjugada ao ácido glicurônico . Uma vez liberada na bile é excretada na luz intestinal , onde é degradada a urobilinogênio (excreção via fezes) com reabsorção parcial para a circulação geral e re-excreção biliar (ciclo entero- hepático). Parte que escapa a excreção hepática é eliminada na urina. 5.4.1 Método de determinação da hemoglobina O método padrão mundial é o da cianometahemoglobina, que consiste na diluição do sangue (20 µl medidos em pipeta de Sahali) em solução contendo cianeto e ferrocianeto de potássio (reativo de Drabkin, 4 ml) , que converte a hemoglobina em cianometahemoglobina e a leitura é feita em espectofotômetro .A hemoglobina é expressa em g % ou g / dl , variando de 8 a 16 nas diferentes espécies domésticas . Alguns fatores como altas concentrações de lipídeos e leucometria global acima de 50.000 / mm³ podem alterar os valores de hemoglobina por aumento da densidade ótica. 5.5 HEMATÓCRITO Do grego krit (julgar), também chamado volume globular (VG), mede a percentagem ocupada pelos eritrócitos, ou a relação entre glóbulos vermelhos e plasma. Os métodos de centrifugação dão um volume de células sedimentadas, mensuração esta muito precisa, pois praticamente não fica retido plasma na massa de células compactadas . Métodos para a determinação do hematócrito: Macro - hematócrito – O tubo de Wintrobe que possui duas escalas gravadas, é preenchido com sangue contendo anticoagulante, devidamente homogeneizado. Em seguida é centrifugado a 5000 rpm , durante 30 minutos . A leitura é feita diretamente na escala à direita do tubo. Micro – hematócrito – O princípio é mesmo para as duas técnicas. Através da sedimentação dos elementos figurados do sangue obtém–se a proporção desses elementos em relação ao plasma. Nessa técnica são usados tubos capilares de 75 mm x 1 mm, preenchidos (2 / 3) com sangue total, por capilaridade. Após fechada a extremidade seca, em chama de bico de Bunsen , é então centrifugado a 1200 rpm /5 minutos(centrífuga de micro-hematócrito, Figura 16). A leitura é feita colocando o capilar sobre uma tabela de leitura específica (Figura 17), onde a extremidade final do tubo e o menisco da superfície do plasma devem coincidir com as linhas inferior e superior da tabela, respectivamente. Figura 16. Centrífuga e rotor para micro-hematócrito. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 26 Figura 17. Informações fornecidas pelo hematócrito Usado para:dosagem de fibrinogênio e de proteínas plasmáticas totais (PPT) Observar a coloração do plama: cor normal -incolor (cão e gato) -amarelo (herbívoros) PLASMA Coloração do plasma alterada: amarelo- icterícia em cães e gatos, Branco ou leitoso- lipemia pós-prandial, diabete, hipotireoidismo,... Avermelhado-hemólise (artefato), anemia hemolítica (infecciosa ou auto- Imune) CAMADA ACINZENTADA: contém leucócitos e dá noção de quantidade conforme sua espessura ( leucocitose , leucopenia , normoleucometria ). CAMADA VERMELHA: contémeritrócitos e dá noção de quantidade. Volume Globular – VG (%) ou hematócrito Serve para visualização de microfilárias ( abaixo da capa de leucócitos ). Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 27 5.6 OUTRAS DETERMINAÇÕES: 5.6.1 Dosagem de proteínas plasmáticas totais – PPT : A determinação das proteínas plasmáticas totais fornece informações sobre o grau de hidratação do animal. Existem valores considerados normais para as diferentes espécies domésticas (Tabela 6), valores abaixo do fisiológico indicam hipoproteinemia por causa diversas, enquanto valores elevados indicam desidratação . Técnica: Após ser feita a leitura do micro- hematócrito, quebra - se o tubo acima do limite superior da camada sedimentada, despreza se a parte do tubo contendo células e pela extremidade que não foi quebrada (parte superior do tubo) verte-se o plasma no refratômetro (Figura 18) . A leitura é feita em escala gravada no aparelho, onde incidir o limite entre parte clara e escura. Figura 18. Refratômetro Tabela 6. VALORES FISIOLÓGICOS DE PPT EM ANIMAIS DOMÉSTICOS ANIMAL PPT ( g/dl ) Canino / felino 6,0 – 8,0 bovino 7,0 – 8,5 ovino 6,0 – 7,5 eqüino 5,2 – 7,9 Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 28 RELAÇÃO ENTRE HEMATÓCRITO E PROTEÍNAS PLASMÁTICAS HEMATÓCRITO PPT INTERPRETAÇÃO aumentado Aumentado Normal Diminuído Desidratação Contração esplênica(principalmente eqüinos) Policitemia primária ou secundária Desidratação mascarada por hipoproteinemia Hipoproteinemia com contração esplênica normal Aumentado Normal Diminuído Anemia mascarada por desidratação Aumento de globulinas Normal Elevada perda proteíca (gastrointestinal ou renal ) Produção diminuída (problema hepático) diminuído Aumentado Normal Diminuído Anemia associada com desidratação Elevada destruição de eritrócitos Diminuição da eritropoiese Perda crônica de sangue(deficiência de ferro) Fluidoterapia Perda de sangue externa 5.6.2 Dosagem de fibrinogênio : O fibrinogênio é uma das proteínas de reação de fase aguda, produzidas pelo fígado. O estímulo inicial que aumenta a produção dessas proteínas está ligado a produção de citosinas pelas células envolvidas no processo inflamatório (monócitos / macrófagos ). A produção de fibrinogênio reflete a existência de um processo inflamatório, e por ser de fácil determinação é utilizada junto com o leucograma como reflexo de inflamação. A hiperfibrinogemia é indicador sensível de inflamação em herbívoros até mais consistente que o leucograma, enquanto em carnívoros esta relação é inversa. Os valores fisilógicos são apresentados na Tabela 7. Técnica: Usa - se o método de precipitação por aquecimento do fibrinogênio. São preenchidos 2 tubos de micro – hematócrito, após centrifugação é realizada a leitura do primeiro, em refratômetro. O segundo é submetido ao calor (banho – maria, 56º, 5 minutos ), e após centrifugação é determinada a concentração de PPT , também por refratometria . A diferença entre as duas leituras expressa a taxa de fibrinogênio plasmático. Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 29 6.0 INTERPRETAÇÃO DO ERITROGRAMA: Para a interpretação do eritrograma devemos analisar o número de eritrócitos, taxa de hemoglobina, e hematócrito. Podemos ter três situações diferentes: - Valores dentro dos fisiológicos para a espécie animal – animal normal, saudável. - Valores de hematócrito, hemoglobina e / ou número de eritrócitos abaixo do(s) fisiológico(s) – Anemia. - Valores de hematócrito, hemoglobina e / ou número de eritrócitos acima do(s) fisiológico(s) - Policitemia ou poliglobulia . Anemia é a redução dos valores, abaixo dos mínimos fisiológicos para a espécie animal , do número de eritrócitos , taxa de hemoglobina e / ou hematócrito . Alguns autores definem anemia como sendo simplesmente a redução da taxa de hemoglobina, isto porque os sinais clínicos resultam da deficiente capacidade de conduzir o oxigênio. A anemia é raramente uma doença primária, mas comumente é resultado de um processo patológico generalizado, por si só a anemia não constitui diagnóstico. Pode – se suspeitar de uma anemia pelos sinais clínicos característicos e história apresentada pelo paciente. Ao ser diagnosticada a anemia pela avaliação clínica e resultados do hemograma, sua patogenia deve ser investigada para determinar a conduta terapêutica específica. O tratamento não deve ser direcionado para a anemia, exceto quando necessário medidas de emergência , a causa deve ser encontrada tratada e corrigida se possível. A anemia pode resultar de : - perda de eritrócitos - destruição excessiva - produção diminuída Sinais clínicos: resultam da reduzida capacidade do sangue em conduzir oxigênio e certos ajustes fisiológicos destinados a aumentar a eficiência e reduzir o trabalho forçado do coração. Sinais comuns a anemias independente da etiologia incluem dispnéia de esforço, reduzida tolerância a exercícios, palidez de mucosas, aumento da freqüência cardíaca, às vezes sopro Tabela 7. VALORES FISIOLÓGICOS DE FIBRINOGÊNIO ESPÉCIE FIBRINOGÊNIO mg/dl Canino 100 - 500 felino 50 - 300 bovino 300 - 700 eqüino 100 - 400 6.1 ANEMIA Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 30 sistólico , taquipnéia ,depressão....Em perdas agudas de sangue quando 1/3 do volume foi perdido em um curto período, pode ocorrer choque seguido de morte , se não for realizada transfusão de sangue ou fluidoterapia para corrigir a hipovolemia .Sinais clínicos resultantes de anemia por hemólise aguda incluem icterícia , hemoglobinemia , hemoglobinúria e febre .Em perdas crônicas de sangue , anemias hemolíticas ou anemias por depressão o nível de hemoglobina pode chegar a 50% do normal do paciente sem sinais evidentes de hipoxemia (sem sinais clínicos ). Existem várias formas de classificação das anemia, apesar de nenhuma ser totalmente satisfatória ,são complementares e juntas auxiliam a analisar e determinar os possíveis mecanismos fisiopatológicos e causas prováveis, que auxiliarão o clínico no diagnóstico, prognóstico e conduta terapêutica . 6.1.1 CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA DAS ANEMIAS: A classificação morfológica baseia – se nos índices hematimétricos ou eritrocitários , o Volume Corpuscular Médio (VCM) e Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM). O exame microscópico dos eritrócitos em esfregaço sangüíneo corado confirma essas características morfológicas. A classificação morfológica é inespecífica para a causa , mas fornece subsídios sobre mecanismo fisiopatológico e base para seleção do tratamento. Os índices hematimétricos são calculados pelas seguintes fórmulas: Hematócrito X 10 VCM= Nº de eritrócitos (milhões/mm³) O VCM refere-se ao tamanho do eritrócito, ou o volume ocupado por cada eritrócito , expresso em µ³ . Valores de VCM que se enquadram dentro dos valoresde referência para a espécie animal, classificam a anemia como Normocítica , valores superiores Macrocítica e valores inferiores Microcítica . Hemoglobina X 100 CHCM = hematócrito O CHCM é a saturação média de hemoglobina do eritrócito , expressa em %. Existe um grau de saturação máxima de hemoglobina considerado normal para os eritrócitos de cada espécie animal , assim não são formados eritrócitos com maior quantidade de hemoglobina que o fisiológico , quando o valor do CHCM estiver acima dos parâmetros fisiológicos é sinal de que havia hemoglobina livre à nível plasmático , quer por existência Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 31 de um agente hemolítico intra – vascular , ou por erro de coleta ,conservação ou manuseio da amostra(hemólise in vitro). Assim a anemia será classificada como Normocrômica quando os valores se enquadrarem dentro dos fisiológicos para a espécie, Hipocrômica quando inferiores , e quando superiores Hipercrômicas (situação esta não verdadeira conforme explicação acima ). 6.1.2 ANEMIAS QUANTO A MASSA GLOBAL DE ERITRÓCITOS : Anemia relativa: é aquela que resulta da expansão plasmática. Ocorrem em gestação, neonatos e fluidoterapia. Anemia absoluta: resulta da redução da massa eritrocitária. É a de importância clínica Devem ser investigadas a morfologia eritrocitária, mecanismo patogênico e resposta eritróide da medula. Embora nenhum desses exames seja conclusivo isoladamente, se complementam , e juntos proporcionam um meio lógico de análise da anemia . 6.1.3 CLASSIFICAÇÃO FISIOPATOLÓGICA DAS ANEMIAS : Anemia por perda de sangue : -hemólise aguda procedimentos cirúrgicos ou traumas distúrbios hemostáticos CID – coagulação intravascular disseminada -hemorragia crônica parasitismo (Haemonchus , Ancylostomum ,coccídeos,...) úlceras gastrointestinais deficiência de vitamina K neoplasias com sangramento cavitário -anemia hemolítica (intravascular ou extravascular) imunomediada parasitárias (anaplasmose , babesiose , erliquiose ,...) bacterianas (leptospirose , hemoglobinúria bacilar ,...) tóxica (cobre , zinco , chumbo , plantas tóxicas , ...) Anemia hipoproliferativa : -deficiência nutricional proteínas minerais (ferro , cobre , cobalto , selênio ,) vitaminas (A, E, B12, ác. fólico, niacina, piridoxina, tiamina) -desordens orgânicas -insuficiência renal com uremia -doenças endócrinas -anemia por doenças inflamatórias -neoplasias -infecções -anemias aplásicas ou hipoplásicas -desordens mieloproliferativas Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 32 6.1.4 CLASSIFICAÇÃO QUANTO A RESPOSTA MEDULAR : A eritropoiese é regulada pela eritropoietina, produzida em resposta a hipóxia tecidual. A síntese de eritropoietina é inversamente proporcional a massa de eritrócitos circulantes e a concentração de hemoglobina. A eritropoiese é estimulada por um acréscimo nos progenitores eritróides, aceleração na mitose e maturação dos eritrócitos, e rápida liberação de reticulócitos e eritrócitos jovens para a circulação. Anemia regenerativa : são aquelas em que há resposta medular , e conseqüente liberação de eritrócitos e seus precursores na corrente circulatória. Os principais sinais de boa resposta medular são : -policromasia ou policromatofilia -presença de corpúsculas de Howell-Jolly -presença de metarrubrócitos -reticulocitose (quando feita a contagem de reticulócitos) -Anemia regenerativa por perda sangüínea -traumas ou cirurgias -intoxicação por dicumarol -Coagulação intravascular disseminada -Anemia regenerativa por hemólise -hemoparasitas -anemia imunomediada -reação transfusional Anemia não regenerativa (arregenerativa ou não responsiva): caracteriza-se por diminuição da produção de eritropoietina, inadequada resposta do tecido eritróide a estímulo apropriado ou eritropoiese ineficaz , em processos como : -insuficiência renal crônica -neoplasias , leucemias , linfoma , -erliquiose, -panleucopenia felina , -hipoandrogenismo , hipoadrenocorticismo , -hiperestrogenismo 6.2 POLICITEMIAS Policitemia ou poliglobulia é o aumento do número de eritrócitos, da taxa de hemoglobina e/ou do hematócrito. Com relação à massa eritrocitária podemos ter: Policitemia relativa: é encontrada em animais como resultado da redução do volume plasmático devido à desidratação, quer pela inadequada ingestão de líquidos ou pela perda excessiva, ou quando há contração esplênica com aumento temporário da massa eritrocitária circulante .Com a redução do volume plasmático ocorre hemoconcentração ,com aumento relativo dos parâmetros eritrocitários . Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 33 Policitemia absoluta: é aquela em que há aumento real dos parâmetros eritrocitários (número de eritrócitos / mm³ de sangue, taxa de hemoglobina e/ou hematócrito ) . A policitemia absoluta pode ser classificada em primária ou secundária . -Policitemia absoluta primária:também chamada policitemia Vera , é uma doença miloproliferativa , ou seja , uma desordem clonal da célula pluripotencial que resulta numa expansão das células progenitoras , primariamente da linhagem eritróide . -Policitemia absoluta secundária: não é acompanhada por aumento na contagem leucocitária ou plaquetária, e geralmente ocorre por elevada produção de eritropoietina . Os níveis de eritropoietina aumentam em resposta fisiológica compensatória pelos rins a hipóxia tecidual ou como resultado de neoplasias, independente da oxigenação dos tecidos. A policitemia absoluta secundária pode ocorrer devido a: Hipóxia - -baixa tensão de oxigênio atmosférico -hipóxia pulmonar -doenças cardiovasculares -meta-hemoglobinemia congênita Eritropoietinogênese acelerada- -neoplasias renais -fibrossarcoma extra-renal -cistos renais, hidronefrose Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 34 1. MIELOPOIESE Ao nascimento, a medula óssea produz granulócitos(neutrófilos, eosinófilos,basófilos), monócitos,eritrócitos, megacariócitos(que originam as plaquetas) e uma pequena porção de linfócitos. A maior produção de linfócitos, entretanto, ocorre em tecidos linfóides extra- medulares (baço, linfonodos, tonsilas, tecido linfóide associado ao intestino, etc). O termo mielopoiese refere-se à produção das linhagens celulares não linfóides, ou seja, das linhagens eritróide, granulocítica, monocítica e megacariocítica . (Figura 19). Uma célula tronco pluripotencial origina as linhagens celulares linfóide e mielóide. As células tronco são caracterizadas por sua capacidade de auto-renovação por longo tempo e por sua habilidade de se diferenciar em múltiplas linhagens celulares. Estas linhagens celulares individuais se desenvolverão independentemente, com exceção de neutrófilos e monócitos, que compartilham uma célula tronco em comum (Unidade Formadora de Colônia Granulocítica-Macrofágica UFC-GM ) . FIGURA 19: Modelo atual da produção e diferenciação hemolinfática a partir de uma célula tronco comum. As células progenitoras comprometidas com a mielopoese incluem os precursores UFC (unidade formadora de colônia). As células tronco são necessárias para a produção de células sangüíneas, pois dessas apenas os linfócitos sãocapazes de se multiplicar. As células tronco são capazes de repovoar a medula óssea após severa lesão, capacidade esta que decresce com a idade do animal, ou seja, animais velhos irão se recuperar mais lentamente de uma grave agressão a medula do que animais mais jovens. LEUCOGRAMA Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 35 1.1 GRANULOPOIESE 1.1.1 PRODUÇÃO E CINÉTICA DOS NEUTRÓFILOS: A granulopoiese ou granulocitopoiese ocorre na medula óssea, influenciada por estímulos como o da interleucina 3 (IL-3),considerada um fator multiespecífico, e pelo fator estimulador de colônia granulocítico-macrofágico ou granulocítico-monocítico (FEC-GM). A célula pluripotencial origina células progenitoras comprometidas em produzir neutrófilos e monócitos (UFC-GM), eosinófilos (UFC-Eos) e basófilos (UFC-Bas). A UFC-GM possui duplo comprometimento e sob influência do fator estimulador de colônia granulocítico (FEC-G) e do fator estimulador de colônia macrofágico (FEC-M), além da IL-3, regulará a diferenciação e maturação de neutrófilos ou monócitos. A granulopoiese obedece a uma linha seqüencial de multiplicação que inicia no mieloblasto, avança para pró-granulócitos até mielócitos, sob influencia de granulopoietinas (provavelmente oriundas de macrófagos), e continua na maturação em metamielócitos, bastonetes e neutrófilos segmentados. O último estágio capaz de sofrer mitose é o de pró-mielócito (ou pró-granulócito), de mielócito em diante, só ocorre maturação. Metamielócitos, bastonetes e segmentados são armazenados na medula óssea, por um período variável de tempo, enquanto as células sofrem maturação. Após, os neutrófilos mais maduros são liberados para a circulação sangüínea. O processo todo, desde mieloblasto até segmentado, dura entre 3,5 a 6 dias. Para facilitar a compreensão deste sistema ordenado, podemos teoricamente, dividir a medula em dois compartimentos: I. Compartimento de multiplicação: Mieloblasto → pró-mielócito (pró-granulócito) → mielócito II. Compartimento de maturação e estoque: Metamielócito → bastonete → neutrófilo segmentado Os neutrófilos ôo distribuídos em um dos dois compartimentos dinâmicos na circulação, chamados compartimento circulante e compartimento marginal. O compartimento circulante compreende aquelas células que estão na corrente circulatória e que são retiradas do vaso no momento da colheita de sangue para a realização de exames. O compartimento marginal consiste naquelas células que estão aderidas ao endotélio de pequenos capilares e vênulas, ou que circulam lentamente ao longo da superfície endotelial desses pequenos vasos. Estas células não são contadas no hemograma, porque elas não estão circulando, portanto não fazem parte da amostra colhida por punção venosa. A distribuição dos neutrófilos entre os dois compartimentos, em caninos, é de aproximadamente 1:1, ou seja, para cada neutrófilo circulante, estma-se 1 no compartimento marginal. Em felinos, a proporção é de 1:3. Mudanças nos números de células entre os dois compartimentos podem rapidamente, sob ação de determinados estímulos, e podem modificar muito a contagem leucocitária, especialmente em felinos. Os neutrófilos tem uma meia-vida circulante entre 5,5 e 10 horas. Após este período,eles marginam e migram para os tecidos. Uma vez que tenham penetrado nostecidos, os neutrófilos não retornam à circulação(não recirculam), permanecem viáveis e ativos nos tecidos até 2 dias, após, eles são fagocitados por macrófagos ou atravessam as mucosas e são eliminados do organismo junto com as secreções(especialmente no lúmen intestinal). Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 36 1.1.2 PRODUÇÃO E CINÉTICA DOS MONÓCITOS: Apesar da formação dos monócitos na medula, ser a partir da mesma célula-mãe dos neutrófilos, não existe na medula compartimento de maturação ou reserva de monócitos, ou seja, estas células são liberadas da medula logo após a sua formação. Ainda que não haja nenhuma reserva medular de monócitos, eles podem ser formados rapidamente em condição de doença. Em humanos, os monócitos estão distribuídos na corrente circulatória, entre os compartimentos circulante e marginal (1:3,5), tem uma vida circulante curta (8,5 horas), após a qual deixam a circulação e alcançam os tecidos, não retornando a circulação. Dados comparáveis não existem na literatura veterinária, mas se supõe que sejam similares, principalmente em caninos e felinos. A maturação dos monócitos em macrófagos é acompanhada por mudanças na sua morfologia, ultra estrutura, receptores de membrana e metabolismo. Após a diferenciação os macrófagos podem sobreviver, nos tecidos, por dias ou meses. 1.1.3 PRODUÇÃO E CINÉTICA DE EOSINÓFILOS: Os eosinófilos e basófilos podem compartilhar um progenitor comum. Algumas evidências indicam produção simultânea das duas linhagens sob influência de IL-5 e alterações similares nos números circulantes das duas linhagens em condições como reações alérgicas. A produção de eosinófilos na medula óssea é controlada por linfócitos-T. Os eosinófilos recém formados são armazenados na medula óssea de maneira semelhante àquela dos neutrófilos. À medida que os eosinófilos são liberados da medula, eles se distribuem desigualmente entre os compartimentos marginal e circulante de eosinófilos, têm uma meia-vida circulante entre 2 e 12 horas e depois saem da corrente circulatória. Quando migram para os tecidos localizam-se primariamente nos sítios sub-epiteliais na pele e nos tratos respiratório, gastrointestinal e genito-urinário. Devido a essa localização, doenças envolvendo esses tecidos podem ser acompanhadas de intensa eosinofilia tecidual, sem eosinofilia sangüínea. Após vários dias nos tecidos, os eosinófilos são eliminados da mesma forma que acontece com os neutrófilos. 1.1.4 PRODUÇÃO E CINÉTICA DOS BASÓFILOS/MASTÓCITOS: Se os basófilos e mastócitos surgem de um mesmo progenitor no seu desenvolvimento não está ainda comprovado, mas a diferenciação final de cada linhagem é regulada por um diferente conjunto de substâncias. A célula tronco que dá origem imediata aos basófilos ainda não foi identificada e os dados cinéticos de produção e circulação também não foram bem esclarecidos nas espécies de animais domésticos. 1.1.5 PRODUÇÃO E CINÉTICA DOS LINFÓCITOS: O sistema linfóide se desenvolve durante a gestação e os filhotes são imunológicamente competentes ao nascimento. Os tecidos que compõe o sistema linfóide incluem a medula óssea, timo,linfonodos, baço,tecido linfóide associado ao intestino, brônquios e sangue.O sangue contém menos de 5% do total da população corporal de linfócitos, e serve como uma via de distribuição de linfócitos. A linfopoiese continuada é independente das células tronco pluripotenciais da medula óssea e sangue, mas a maioria dos linfócitos no indivíduo adulto origina-se dos tecidos linfóides periféricos ( aqueles outros além do timo e medula). A diferenciação inicial, em linfócitos T ou B, Patologia Clínica Veterinária – UFPel - 37 ocorre em associação com o timo e medula óssea (que é bursa equivalente nos mamíferos), respectivamente. Os linfócitos B estão envolvidos com a imunidade humoral, pela produção de anticorpos, enquanto os linfócitos t estão envolvidos com a imunidade mediada por células, modulando a atividade de outras células ou matando células tumorais ou células infectadas. A linfopoiese é estimulada por exposição antigênica e é deprimida por corticóides, hormônios sexuais e má nutrição. A população total de linfócitos é dividida em aproximadamente 70% de linfócitos T, 20% de linfócitos B e os 10% restantes
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