Extracao_De_Dna_E_Eletroforese (2)

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EXTRAÇÃO DE DNA E TÉCNICA DE ELETROFORESE 
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Requerimento essencial: 
 quantidade
 pureza
 integridade
Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:
Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas
Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares
Precipitação 
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
1. Rompendo membranas celulares 
 Lise das células  liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares
 - bactérias (parede glicoproteica)  tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede  enfraquecimento  rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação 
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Células de plantas ou animais presentes em tecidos:
Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual  célula individual  lise: digestão enzimática / homogeneização
Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Células sem cobertura externa ou em solução:
Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio  substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas 
 solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3 
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2. Desnaturando proteínas celulares:
Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas:
- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.
Fragmentos de membrana lipídica
Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos
Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: 
Extração em baixas temperaturas
Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas
Agentes que retardam atividade das nucleases: 
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Agentes que retardam atividade das nucleases: 
 tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético)
Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração
RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
3. Separando DNA / RNA / Proteínas
Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação
Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas 
 (emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol)
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos)
 interface: proteínas
 camada do fenol
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Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 
Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico)
3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA)
 interface: proteínas
 camada do fenol
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
pH
pH neutro
ou básico
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Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 
Extração de RNA (fenol com pH ácido)
3 fases: aquosa (RNA)
 interface: proteínas
 camada do fenol (DNA)
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
pH
pH ácido
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
4. Precipitação e lavagem com álcool
 DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC  -20º C 
 DNA precipitado 
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
4. Precipitação e lavagem com álcool
 RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) –
 incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC
RNA precipitado
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GEL DE AGAROSE 1% COM 3 ML DE DNA GENÔMICO
 M 1 2 3
M - Marcador
1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico
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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Soluções utilizadas
tampão de extração
solução de lise
solução desnaturante de proteínas
fenol
clorofórmio
Etanol
Proteinase K
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FUNÇÃO DOS REAGENTES 
Tampão: proporciona um pH para manutenção da integridade das mols de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético).
Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate. 
Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.
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FUNÇÃO DOS REAGENTES 
Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos.
Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC – dietil pirocarbonato).
Etanol: induz alterações estruturais nas mols de ácidos nucléicos = agregação das mols, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). 
Proteinase K – remove por digestão a contaminação com proteínas
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ELETROFORESE
	
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INTRODUÇÃO
Em 1937, por Tiselius, foi inicialmente realizada em meio líquido 
Posteriormente aperfeiçoada com emprego de um meio-suporte
Na década de 1950, a partir dos experimentos de Smithies (1955) e de Hunter & Market (1957)
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 Os ácidos nucléicos apresentam cargas negativas dos grupos fosfato.
 O número de cargas negativas e o número de átomos que compõem o ácido nucléico é constante
 Independentemente do tamanho ou da sequência de nucleotídeos da molécula 
INTRODUÇÃO
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CARGAS ELÉTRICAS
Migração de cargas elétricas quando submetidas a uma diferença de potencial
Essa migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é chamada de eletroforese.
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VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO
Três fatores:
 intensidade da diferença de potencial aplicada,
carga total da macromolécula
tamanho da macromolécula.
Quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao polo de sinal oposto.
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VANTAGENS
Técnica bioquímica versátil 
Relativamente simples e rápida 
Grande poder informativo (qualidade e quantidade de peso molecular)
Teste qualitativo e semi quantitativo
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SUPORTES
Suportes – São matrizes rígidas com as quais a solução interage e que diminuem as perturbações mecânicas e os movimentos de convecção no líquido. 
Existem dois tipos básicos de suportes: os suportes de papel e os suportes de gel.
	Nos suportes de papel, a natureza hidrofílica da celulose faz com que se forme uma película de líquido sobre o papel. 
Agarose e Poliacrilamida
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SUPORTES
1 Kb = 1000 pares de bases
> 50Kb usar gel em campo pulsátil
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FATORES QUE ALTERAM A MIGRAÇÃO
concentração de agarose
conformação do DNA 
intensidade da corrente.
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ELETROFORESES
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COLORAÇÃO
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Brometo de etídeo
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Transiluminador de UV
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RESULTADOS
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APLICAÇÕES
análise de enzimas, de proteínas e de ácidos nucléicos;
 usada em estudos de taxonomia, bioquímica, fisiologia e genética humana, de plantas, de animais e de microrganismos;
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APLICAÇÕES
caracterização e identificação de fungos, bactérias, vírus, nematóides,
 cultivos e linhagens de plantas resistentes a estresses bióticos e abióticos;
estudos de interação patógeno-hospedeiro, além das inúmeras áreas da genética médica e forense.
determinação e caracterização de moléculas de ácidos nucléicos, tanto DNA como RNA. 
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APLICAÇÕES
Progressos na tecnologia do DNA recombinante;
 Mapeamento de fragmentos e no sequenciamento de nucleotídeos, oriundos de fragmentos de ácidos nucléicos.
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GEL DESNATURANTE PARA RNA
géis de agarose e poliacrilamida, desnaturantes ou não
Interações intramoleculares nas moléculas de RNA podem dobrar-se, alterando a estrutura secundária e afetando a migração das moléculas no gel. 
Sob condições
desnaturantes as pontes de hidrogênio são rompidas e o RNA migra como molécula de fita simples
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TIPOS DE DESNATURANTES
hidróxido de metil mercúrio – mais poderoso mas mais caro e altamente toxico
Formaldeído – corar com brometo de etídeo
tiocianato de guanidina
formamida 
DMSO
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GEL DE AGAROSE - DESNATURANTE
MOPS (3- N-morfolino ácido propanosulfônico)
 é um excelente tampão para manutenção de sistemas biológicos em pH neutro
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