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ESTUDO DIRIGIDO – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS 01. Nomenclatura de nucleotídeos São assim nomeados aqueles nucleosídeos que têm, em sua estrutura, um grupo fosfato adicionado ao carbono C5’; nucleosídeo é a estrutura composta de uma pentose e uma base nitrogenada. Como exemplos, temos os ribonucleotídeos – AMP - (tendo uma ribose em sua estrutura) e os desoxirribonucleotídeos – dAMP - (com uma desoxirribose). 02. Dados experimentais que deram suporte ao Modelo de Watson e Crick Com base nos experimentos de Chargaff que comprova a complementariedade de bases (cada purina se liga à uma pirimidina), sendo a quantidade de A = T, e a quantidade de G = C, sendo também que a soma de (A+T)+(G+C) = 100%; tal afirmativa indica que as 2 fitas da molécula de DNA tem o mesmo tamanho. Também, os experimentos de Franklin e Rosalind, sobre a difração dos Raios-X (Cristalografia) sobre a localização espacial dos eixos tridimensionais dos átomos de uma molécula, Watson e Crkick levaram a constatar que a estrutura do DNA assumia uma forma helicoidal e dupla fita, com um diâmentro de 20Ǻ, formadas por uma sequência de nucleotídeos com uma distância de 3,4Ǻ entre as bases nitrogenadas que são complementares entre si e voltadas para o interior, quase perpendiculares ao eixo central. 03. Características do DNA: formas A, B e Z A estrutura de forma B é a clássica, encontrada in vivo; a rotação segue para a direita; tendo 2,37nm de diâmetro e mais ou menos 10,4p por volta. A molécula de DNA assume a forma A quando exposto à meios desidratados ou com baixas concentrações de sal, mudando a conformação; na forma A, encontrada in vitro, a rotação se mantém para a direita, com 11pb por volta e há uma mudança nos aneis, ao invés do C2’, é C3’ -endo. E por fim, a conformação Z (também existe in vitro) é uma molécula mais longa e de menor diâmetro, com rotação para a esquerda e 12pb por volta; as purinas são conformação syn- e C3’ –endo, e pirimidinas são anti- e C2’ –endo. Lembrando que as diferenças se limitam apenas à estrutura, a sequência é a mesma; tais modificações permitem melhor interação com certas proteínas. 04. Estrutura tridimencional do RNA O RNA em sua estrutura 3D está completamente ativo, é maleável e totalmente instável; apresentam-se desta forma as ribozimas (moléculas de RNA com função auto-catalítica). 05. Forças que mantém a estrutura do DNA e RNA A estrutura de DNA é formada por ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos, e pontes de hidrogêneio entre as bases complementares, porém, as fitas tendem à repulsão devido a carga negativa dos grupos P; efeitos hidrofóbicos estabilizam o pareamento de bases, junto com as forças de Van der Walls que atuam entre o empilhamento das bases; nas cadeias negativas cátios (+) interagem neutralizando a repulsão. A estrutura do RNA é estabilizada pelas mesmas forças que atuam no DNA; a molécula se apresenta na sua forma secundária por dobramento de cadeia e pontes de hidrogênio intracadeia. 06. Propriedades básicas dos ácidos nucléicos A complementariedade de bases e antiparalelismo são uma das propriedades da molécula de DNA, assim como a desnaturação (processo que altera a estrutura da dupla-fita, separando-as) e a renaturação (processo que retoma a conformação natural da molécula); outra propriedade é a absorção de luz UV, tanto DNA quanto RNA têm A = 260nm; a absorbância serve para analisar se as amostras moleculares estão contaminadas, e também para quantificar a concentração molecular. 07. Temperatura média de fusão É a temperatura necessária para que metade do DNAa seja desnaturado; a temperatura de desnaturação varia de acordo com a % de bases (A=T e GΞC) e também com a presença de sal ou formamida, sendo possível determinar, através de cálculos, tanto a Tm quanto a porcentagem de bases na amostra analisada. 08. Hibridização É a capacidade de união de fitas simples de DNA se ligarem por complementariedade de bases, exemplo: 2 amostras com fita simples de DNA; é possível que fitas da amostra 1 se liguem por complementariedade de bases, assim como entre as fitas da amostra 2, mas também é possível que uma fita da amostra 1 se ligue por complementariedade com uma fita simples da amostra 2. 09. Superenovelamento É a capacidade da molécula de DNA em sua estrutra secundária, enovelar- se e transformar em estrutura terciária (conformação predominante). A regulação desse processo se dá por enzimas – topoisomerases; o superenovelamento facilita a compactação da cromatina, além de ser uma forma de conservação de energia; ocorre uma supertorção, seguida pela compactação. Há dois tipos de superenovelamento, o positivo em que o DNA é torcido na mesma direção da rotação (para a direita – formas B e A -, e para esquerda – forma Z), já o superenovelamento negativo o DNA é torcido ao longo do eixo em direção oposta à rotação (para a esquerda – B e A – ou para a direita – forma Z). O superenovelamento pode afetar a expressão gênica daqueles genes que são eficientemente transcrito quando o DNA assume esta conformação. O oposto é o relaxamento que permite a ocorrência de processos de replicação e transcrição. REPLICAÇÃO 01. Replicação em E. coli: principais características do processo Em procariotos o genoma é pequeno e circular e tem uma única OriC e a replicação é bidirecional; primeiro ocorre a desnaturação do DNA e a síntese de um primer, então, a forquilha de replicação é formada, uma fita líder a replicação é contínua e na outra é descontínua, mas a replicação ocorre simultaneamente nas duas fitas; o término da replicação ocorre nas diversas sequencias terminadoras. 02. Experimento de Meselson-Stahl Os experimentos de Meselson e Stahl sobre a replicação semiconservativa acabaram com duas outras teorias sobre a replicação: a da Replicação Conservativa que sugeria que ambas as fitas parentais permaneciam juntas, e uma nova molécula de DNA dupla fita seria formada, e o Modelo Dispersivo que sugeria que as fitas de DNA eram quebradas a cada 10pb e utilizadas para síntese de regiões curtas do DNA, os pequenos fragmentos seriam religados formando fitas completas com partes parentais e novas. Meselson e Stahl concluíram que o processo de replicação é semiconservativo, as fitas simples do DNA molde permanecem intactas; eles realizaram experimentos com hibridização de moléculas de DNA. 03. Origem de replicação São sequências específicas demarcadas no genoma, onde a síntese do DNA é iniciada; Brenner e Cuzin propuseram que todo DNA replicado a partir de uma origem compõe um replicon. A origem de replicação é uma região com um sítio de ligação para a proteína iniciadora e também é uma região rica em A-T (bases de ligação H+ dupla, mais fáceis de quebrar); em E. coli o replicador se chama oriC. As proteínas iniciadoras se ligam no sítio ativo da oriC e desempenham 3 funções: ligam-se a fita de DNA, separam as fitas e recrutam uma proteína de replicação (ex: helicase). Em eucariotos o iniciador se chama ORC (complexo de reconhecimento de origem), é necessário para recrutar as proteínas de replicação para o replicador. 04. Forquilha de replicação: elementos e enzimas envolvidas no processo e suas respectivas funções Durante a replicação, ambas as fitas do DNA funcionam como molde, a forquilha de replicação percorre a dupla fita abrindo, permitindo o pareamento de bases, caminhando em sentindo à região não pareada; como as fitas são antiparalelas, a replicação da fita líder (leading strand) ocorre continuamente (extremidade 3’ livre, a síntese inicia na 5’), já a fita tardia que tem a extremidade 5’ livre deve parear na extremidade 3’, mas a síntese começa na extremidade 5’,tendo um caráter descontínuo, é necessário que a forquilha exponha uma região considerável da fita tardia para que possa iniciar a replicação, já a fita líder começa a ser sintetizada assim que é exposta; na fita descontínua são formados intermediários, os fragmentos de Okasaki, depois da síntese os fragmentos são unidos por ligações covalentes formando a nova fita de DNA contínua. Para que ocorra a síntese são necessários iniciadores (primers) que contém extremidade 3’-OH livres e são sintetizados por primases (RNA polimerase); a fita líder necessita de apenas um primer, no início da forquilha, já a fita tardia precisa de um primer a cada fragmento de Okazaki; a primase diferente de outras RNA polimerases necessita apenas de associação com outra proteína para ser ativada (ex: DNA helicase); para finalizar a replicação as primases devem ser removidos e substituídos por DNA, através de uma RNAse H (híbrido de DNA:RNA) que reconhece e remove os primers deixando uma lacuna que logo é preenchida por DNA polimerase pareando os respectivos nucleotídeos; a quebra entre as extremidades 3’ e 5’é reparada por uma DNA ligase que promove a ligação fosfodiéster entre as extremidades. As DNA helicases promovem a separação da dupla fita através da hidrólise de ATP; assim que a helicase vai passando pelas fitas as SSBs (proteínas de ligação de DNA fita simples) se ligam às bases livres da fita simples impedindo a formação de grampos na fita e também os pareamentos, deixando a fita estável e pronta para ser utilizada como molde. A medida que a helicase separa a dupla fita há um acúmulo de supertorções positivas à frente da forquilha, então as topoisomerases entram em cena removendo as supertorções positivas. 05. Características da DNA polimerase I A DNA Polimerase I (DNA Pol I) catalisa a síntese das novas fitas; ela depende de um molde de DNA para determinar a sequência a ser sintetizada, a nova fita produzida era complementar a fita molde. Nos procariotos a DNA Pol I remove os iniciadores de RNA e atuam no reparo do DNA. 06. Características da DNA polimerase III Nos procariotos a DNA Pol III está envolvida na replicação dos cromossomos; a associação com proteínas grampo deslizante na forquilha permite que a processividade das polimerases aumente. 07. Terminação da replicação Em procariotos no final da replicação as duas novas moléculas de DNA circular ficam unidas como elos, é necessário uma topoisomerase II para separar as moléculas; na síntese do DNA ocorre um problema na replicação das extremidades (nas fitas tardias), em que o RNA iniciador é incapaz de sintetizar primers resultando na replicação incompleta de uma pequena região da fita nova, quando o DNA for replicado novamente uma das novas moléculas terá menor comprimento e não terá a região que não foi copiada no ciclo anterior. Para resolver o problema das extremidades da fita tardia, em eucariotos, a telomerase atua alongando a extremidade 3’ utilizando seu próprio RNA como molde (transcriptase reversa). A telomerase sintetiza DNA complementar a extremidade molde, o molde de RNA se desliga e religa novamente replicando os telômeros (extremidades dos cromossomos); ao produzir a extensão 3’ da fita tardia a maquinaria de replicação do DNA expande a extremidade 5’ (da cópia) formando outro fragmento de Okazaki, mesmo assim ainda resta uma extremidade 3’ (da fita tardia) livre, a intenção é que a parte do DNA molde que não seria copiada/que seria deletada é salva pela extensão dos telômeros evitando encurtamento da cópia de DNA. 08. Replicação em eucariotos Em eucariotos o genoma é grande e linear e tem várias ORCs, e a replicação é bidirecional; utiliza apenas uma ORC em cada ciclo celular; ocorre a desnaturação do DNA e a síntese de um primer, então, a forquilha de replicação é formada, uma fita líder a replicação é contínua e na outra é descontínua, mas a replicação ocorre simultaneamente nas duas fitas; o término da replicação é responsável pelas telomerases. TRANSCRIÇÃO 01. Principais características do processo A transcrição é um processo em que uma fita simples de DNA é utilizada como molde para transcrever uma fita simples de RNA a partir do pareamento de bases (A-U, G-C); enzimas (RNA polimerase, por exemplo) e fatores de transcrição fazem o processo possível. O DNA é o precursor para a produção de proteínas, a transcrição seria uma “segunda etapa” desse processo, pois a partir da fita de mRNA e das outras fitas de RNA produzidas (tRNA, rRNA por exemplo) são codificadas as proteínas, a partir de aminoácidos, num processo chamado tradução. O processo de transcrição é semelhante em partes com a replicação, mas há diferenças á serem ressaltadas, como por exemplo: a fita de RNA é constiuída de ribonucleotídeos, não são necessários primers no processo e a transcrição é menos precisa, pois não possui mecanismos de reparo como os da replicação do DNA. 02. Características gerais das RNA polimerases As RNA polimerases são as enzimas que atuam no processo de transcrição copiando a fita molde de DNA por complementariedade de base. 03. RNA polimerase de E. Coli Em procariotos apenas uma RNA polimerase realiza todo o processo (sua parte central é responsável pela função principal), é bem semelhante (tanto em função, estrutura e organização) a Pol II de eucariotos. Para o funcionamento da polimerase é necessário um fator de transcrição (σ) que promove que a enzima se converta em sua holoenzima e inicie o processo transcricional. 04. Características de promotores de procariotos O promotor é uma determinada sequência na fita de DNA que marca a região de início da transcrição, onde a RNA polimerase se liga formando o complexo promotor-polimerase é quando a fita dupla de DNA é desenrolada e despareada, formando a bolha de transcrição; o promotor é o principal modo da regulação na transcrição, é a sequência que determina qual parte do genoma será transcrita. Junto a polimerase é adicionado o fator σ que reconhece os promotores que tem as regiões -35 e -10, é a “sequência consenso” com cerca de 17pb entre as duas regiões, o que determina a ‘eficiência da transcrição e da ligação polimerase-promotor’ é a semelhança da sequência promotora nas fitas de DNA molde em relação à sequência consenso determinada. Os promotores ainda podem variar quanto à essas regiões, alguns podem apresentar, por exemplo, o elemento up que intensifica a ligação da polimerase, já outros não possuem a região -35 e compensam a falta com uma região chamada ‘-10 expandido’. 05. Função do fator sigma e sua diversidade O fator sigma (σ) é um fator de transcrição atuante na transcrição de procariotos, em E. coli o fator σ70é o predomintante. Ao se ligar na polimerase (após a enzima se ligar no promotor) promove a conversão em holoenzima. O fator σ é dividido em 4 subunidades, tem região específica para interagir com a hélice do DNA, a hélice-volta-hélice, a α-hélice da subunidade interage com a região -10 do promotor e a região -35 fornece a energia para a formação do complexo polimerase-promotor, ainda na α- hélice há aminoácidos que interagem com a fita não-molde estabilizando-a, semelhante a função das SSB. O fator sigma é capaz de reconhecer vários promotores diferentes, ou seja, há diversidade tanto nas sequências promotores quanto nos fatores de transcrição sigma. 06. Terminação da transcrição em procariotos Em algumas fitas molde existem sequências de terminação que sinalizam para a polimerase o fim da transcrição liberando a molécula de DNA, da enzima, e desta, a molécula recém-sintetizada de RNA. Os terminadores se apresentam de 2 formas, os Rho-dependentes e os independentes, a proteína em forma de anel, Rho, induz o fim da transcrição. Em procariotos, a traduçãoocorre ao mesmo tempo que a transcrição, portanto o fator Rho só se liga á cadeia de RNA deixar a polimerase, após a tradução; quando o fator Rho se liga a enzima, através de ATP a nova fita de RNA é separada da molde e da polimerase ocorrendo no fim da cadeia a formação de um grampo por pareamento de bases invertidas, a polimerase ainda continua a sintentizar novas bases para a fita de RNA, mas com a formação do grampo o rompimento dela é facilitado, separando-se totalmente do complexo polimerase-molde. 07. RNA polimerases de eucariotos Em eucariotos, são necessárias 3 RNA polimerases, a Pol II é a principal, realiza todo o processo de se ligar à fita molde e parear as bases complementares e sintentizar a fita de mRNA; já a Pol I e a Pol III são enzimas mais específicas da transcrição, responsáveis por transcrever os genes precursores do rRNA e do tRNA (além sRNA e rRNA 5S), respectivamente. 08. Promotores de eucariotos A transcrição em eucariotos pode ser divida em 2 condições: in vivo e in vitro. Basicamente, o promotor de eucariotos tem 2 a 3 elementos dos 4 essenciais; a região TATA box, o TFIIB (elemento de reconhecimento), Inr (iniciador) e o DPE (elemento promotor a jusante). Como in vivo o DNA de eucariotos está associado à nucleossomos são necessários (além dos 4 elementos essenciais e das GTFs) as sequências ativadores a montante (UASs), reforçadores, silenciadores, elementos de fronteira e isolantes, esses elementos vão se ligar a proteínas que facilitam ou dificultam a transcrição. 09. Fatores de transcrição e cis-elementos In vivo, além dos GTFs, como o DNA é associado a nucleossomos, são necessários fatores adicionais - Complexo Mediador - , proteínas reguladoras de ligação ao DNA e enzimas modificadoras da cromatina. GTFs são fatores de transcrição que realizam função semelhante ao fator σ, auxiliando a ligação Pol II-Promotor, desnaturação do DNA e auxiliam no ‘escape’ para a entrada na fase de alongamento. O complexo pré-iniciação é o conjunto de GTFs mais a polimerase ligados ao promotor; o complexo é formado da região TATA box, reconhecida pelo TFIID, a subunidade do TFIID, a TBP, se liga a região TATA distorcendo-a recrutando os GTFs (A, B, F, E e H, na ordem) e a polimerase (que vem junto com o TFIIF e o Complexo Mediador), dada a formação do complexo pré-iniciação o DNA é desnaturado, com quebra de ATP mediada pela TFIIH (uma quinase); a TFIIH é responsável, junto com outras quinases, de fosforilar a cauda CTD (domínio C-terminal) da polimerase, a adição de P na cauda auxilia a liberação dos GTFs da polimerase quando a enzima escapa do promotor. Suas funções específicas são divididas por suas subunidades: TAFs são subunidades da TFIID, se ligam ao Inr e ao DPE, e também parecem regular a ligação TBP-DNA através de um prolongamento inibidor; TFIIB é uma proteína de interação a Pol II no complexo pré-iniciação, serve como ponte entre TBP-TATA-Polimerase; a TFIIF se associa a Pol II no promotor e estabiliza o complexo DNA-TBP-TFIIB (se liga antes da E e H); a TFIIE atua na regulação da TFIIH, e esta por sua vez, controla a transição ATP- dependente do complexo pré-iniciação para complexo aberto e O Complexo Mediador auxilia a ligação DNA-Polimerase, a cauda CTD da polimerase se associa com o Mediador e os ativadores ligados ao DNA também se associam em outras superfícies do CM; além disso ele auxilia na iniciação, regulando a CTD-quinase da TFIIH. Ao iniciar o processo de transcrição a Pol II libera os GTFs e o CM (ligados na cauda CTD que é desfosforilada, liberando os fatores) e os fatores de alongamento são ligados, auxiliando no processo de alongamento e processamento do RNA; a TFIIS é um dos fatores que é associado, auxiliando na redução do tempo de parada, aumentando a velocidade do alongamento e contribui para o reparo da fita. 10. Processamento do pré-mRNA em eucariotos O processamento da fita de pré-mRNA é realizada em 3 eventos: adição de cap 5’, splicing e poliadenilação da extremidade 3’; os fatores de alongamento que recrutam as enzimas necessárias para os eventos de processamento do RNA; a CTD da polimerase está envolvida nesse recrutamento de enzimas. A adição do cap 5’ é o primeiro evento; o grupo P da extremidade 5’ é removido, adicionando um GTP e um grupo metila no lugar. O splicing é a remoção das sequências não codificantes do pré-mRNA, os íntrons, mantendo os éxons, que formarão a fita de mRNA maduro, pronta para ser traduzida em uma sequência de aminoácidos – proteínas. O evento final é a poliadenilação da extremidade 3’; quando a polimerase encontra sequências específicas que pós-transcritas em RNA a região CTD transportam o fator de especificidade de clivagem e poliadenilação e o fator de estimulação de clivagem que desencadeiam o recrutamento das enzimas de poliadenilação promovendo a clivagem do transcrito, a adição de diversas As na extremidade 3’ e a terminação da transcrição; a enzima poli- A-polimerase promove a adição dos nucleotídeos e usam ATP como precursor. O mRNA maduro é liberado da polimerase pós transcrição do gene, sabe-se que a cauda poli-A é um sinal de término da transcrição, permitindo a dissociação da polimerase com o molde de DNA. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 01. Principais características das enzimas de restrição do tipo II A enzima de restrição é específica a determinada sequência de nucleotídeos, ou seja, uma dada enzima, para uma dada sequência de um microorganismo, porém, um mesmo microorganismo pode, apatir deste, isolar várias enzimas de restrição baseadas em várias sequências nucleotídicas. As enzimas de restrição do tipo II são palindrômicas de 4- 6 pb, com os sítios de clivagem próximos, ou dentro da sequência de reconhecimento, por ter a endonuclease e a metilase separada a reação ocorre separadamente; não é necessário ATP. Qual a vantagem de se usar uma enzima com sítio de clivagem próximo ou dentro da sequência: noção do local de inserção da sequência de interesse. 02. Características gerais e exemplos de vetores de clonagem plasmidiais Os vetores plasmidiais possuem apenas um sítio de ligação à enzima de restrição; é necessário que no cromossomo plasmidial estejam presentes a OriC, o sítio de restrição, região policlonal onde será inserido o DNA e o gene de interesse, como por exemplo um gene de resistência a um dado antibiótico. Os plasmídios geralmente são utilizados para estudo e análise de genomas pequenos. 03. Características do fago lambda como vetor de clonagem O bacteriófago comumente chamado de fago lambda é um tradicional vetor de clonagem, é utilizado em transfecção por infectividade; o DNA do fago possuim uma região chamada de região ‘stuffer’ que não é necessária para a formação do capsídeo e desenvolvimento do fago, essa região então é clivada e por meio de endonucleases in vitro, o DNA exógeno (de interesse) é adicionado na região, onde antes era ocupada pela região stuffer; em seguida ocorre o empacotamento do genoma do fago agora contendo uma sequência de nucleotídeos exógena (o DNA de interesse). 04. Características gerais de BACs e YACs BACs e YACs são outros vetores de clonagem utilizados para construção da biblioteca genômica de eucariotos; o BACs é um cromossomo artificial bacteriano, em seu DNA possui sequências Cos N que são sítios de reconhecimento das terminases, formando extremidades coesivas; o YACs é um cromossomo artificial de levedura, e também é utilizado para clonagem de fragmentos maiores (1000kb), em sua estrutura, o YACs possui ARS que são estruturas de replicação autônoma e centrômeros e telômeros, porém há problemas com recombinação com o genoma hospedeiro e são instáveis, pois perdem parte de seu genoma durante a replicação.05. Características gerais de vetores de expressão Os vetores de expressão são os vetores de clonagem, em bactérias, para sua eficiência devem possuir os elementos genéticos (OriC, marcador, promotores, sequência polylinker, e região P e O) que permitam sua expressão em células bacterianas, sendo assim um vetor bacteriano; os vetores bacterianos são incapazes de processar mRNA de eucariotos, por isso a inserção deve vir de bibliotecas de cDNA, outro recurso é o uso de vetores de expressão eucariotos que possuem sinais de poliadenilação e um promotor eucarioto. 06. Transformação de bactérias e células competentes Células competentes são as células hospedeiras que irão receber o gene de interesse, elas são consideradas competentes quando possuem todos os requisitos necessários para o recebimento do DNA exógeno, elas devem ser ativas e ter função plena. A transformação bacteriana pode se dar por diversos métodos, um deles é com cloreto de cálcio, a cultura de bactérias é submetida à centrifugação e suspensão de células em solução de CaCl2, depois é adicionado o DNA plasmidial (vetor contendo gene de interesse) subtendo a amostra à um choque térmico e plaqueamento para obtenção de colônias híbridas (aquelas que incorporaram o DNA plasmidial contendo o gene de interesse). PORQUE NO GELO? Para garantir que a região fique carregada positivamente, permanência da neutralização. PORQUE O CHOQUE TÉRMICO FAVORECE A ENTRADA DO PLASMÍDEO? Formação de fluxo que “puxa” o plasmídio para dentro da célula competente. IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS CONTENDO O GENE DE INTERESSE POR MEIO DE ANÁLISE VISUAL: meio contendo x-gal. Outra técnica de transformação é a de eletroporação, a cultura de células bacterianas são submetidas a centrifugação e suspensão, e em seguida, após 20min em gelo, outra centrifugação e suspensão, em seguida, logo imediatamente, as células são utilizadas, incorporando o DNA plasmidial, e então a amostra é submetida a um eletrochoque, depois adicionada a um tampão salina e plaqueada para a obteção de colônias contendo o gene de interesse. 07. Transformação de células eucarióticas A transformação em eucariotos também é realizada em diferentes metodologias, uma delas é a eletroporação (também utilizada com procariotos), outra metodologia é a utilização da bacteria Agrobacterium tumefaciens, no DNA plasmidial da bactéria, a sequência ocogênica (que causa tumor – galhas – na planta) é removida e é substituída pela sequência de interesse e até mesmo um marcador de seletividade, por fim as bactérias são inseridadas na planta e se desenvolvem, expressando, no lugar do oncogene, o gene de interesse – possívelmente algo benéfico para a planta – tendo então, por fim, o cultivo de plantas transgênicas. 08. Construção de bancos de cDNA e bancos genômicos As bibliotecas genômicas são formadas a partir de vetores plasmidiais ou fagos; o banco em plasmídeo é feito a partir de clones do vetor contendo o gene de interesse, os fragmentos de interesse são recombinados com o DNA plasmidial, submetidos à transformação bacteriana, replicação, amplificação e divisão celular obtendo os clones;
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