HF-LPME Apresentação

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HF-LPME
Preparo de Amostras
30/07/2013
introdução
INTRODUÇÃO
Técnicas de separação
HPLC
CG
CE
Analise de amostras com inúmeros componentes
Matrizes complexas???
Soro, plasma, sangue total, tecidos saliva e urina
INTRODUÇÃO
O que justifica o procedimento de Preparação de amostras?
 Necessidade de eliminação prévia de parte dos componentes;
 Necessidade de concentração das substâncias a serem analisadas
INTRODUÇÃO
Técnicas mais utilizadas para a preparação e pré-concentração em fluidos biológicos
 Extração líquido-líquido (LLE);
 Extração em fase sólida (SPE).
INTRODUÇÃO
 Obtenção de maior seletividade e sensibilidade
 Aumento no potencial para automação ou métodos “online”.
 Métodos menos agressivos ao ambiente
Tendências atuais
 Menores quantidades de amostra
INTRODUÇÃO
TÉCNICAS DE MICROEXTRAÇÃO
 Microextração em fase sólida (SPME);
Microextração em gota suspensa (SDME);
Extração em membranas:	
- Supported Liquid Membrane (SLM).
	
	- Microporous Membrane Liquid-Liquid Extraction	 (MMLLE).	
	- Liquid-Phase Microextraction (LPME).	
INTRODUÇÃO
 Tendência de miniaturização do método tradicional de LLE
 Diminuir a razão de volume entre a fase aquosa e orgânica
 Favorecer a transferência de elétrons
Objetivo
Objetivo
INTRODUÇÃO
TÉCNICAS DE MICROEXTRAÇÃO
Microextração em gota suspensa (SDME)
 Introduzida por Jeannot e Cantwell em 1996;
Dispositivo de politetrafluoretileno (PTFE);		
Técnica modificada: microsseringa				
	
INTRODUÇÃO
Limitações da SDME:
Não é muito robusta: 
baixa estabilidade da gota;
Pré-tratamento de amostras
 viscosas;
INTRODUÇÃO
EXTRAÇÃO EM MEMBRANAS
 Mais robusta;
Alto grau de seletividade;
Capacidade de concentrar os analitos;
Membrana Plana
Membrana de Fibra oca
INTRODUÇÃO
TÉCNICAS DE MICROEXTRAÇÃO
Supported Liquid Membrane (SLM)
 Extração líquido-liquído em 3 fases:
Fase orgânica (imobilizada na membrana hidrofóbica) 
 entre 2 fases aquosas			
Solventes:
 - Hidrocarbonetos de cadeia longa;
 - Mais polares
INTRODUÇÃO
TÉCNICAS DE MICROEXTRAÇÃO
Extração líquido-líquido em membrana microporosa (MMLLE)
 Mesmo princípio da LLE, porém realizada sob fluxo constante;
Fase aceptora: solvente orgânico (2 fases)			
Eficiência: limitada pelo coeficiente de partição (K)
Adequada para compostos altamente hidrofóbicos
Desvantagem da MMLLE e da SLM:
Problemas de estabilidade e possibilidade de “carry-over”
HF-LPME
HF-LPME
Devido a limitações em termos de estabilidade e confiabilidade
Pedersen- Bjergaard e Rasmussen introduziram em 1999 a
microextração em fase líquida com fibra oca, 
(HF-LPME- hollow fiber liquid-phase microextraction)
Conceitos de extrações com membranas
(SLM e MMLLE)
Uso reduzido da razão solvente orgânico/fase aquosa
(SDME)
HF-LPME
Uso de uma simples, descartável, de baixo custo e porosa membrana cilíndrica feita de polipropileno
A fibra tem porosidade de 70 %, o tamanho do poro de 0,2 μm, espessura da parede da fibra de 200 μm e diâmetro interno de 600 μm
(PEDERSEN-BJERGAARD; RASMUSSEN, 2008)
HF-LPME
Volume de amostra: 0,1 a 4,0 mL
Comprimento da fibra oca: 1,5 a 10 cm	
Volume do solvente imobilizado: 5 a 30 μL
Volume de solvente presente no lúmen: 2 a 30 μL
Antes da extração:
Membrana imersa em solvente orgânico
Excesso de solvente é removido com água ultrapura
Lúmen da fibra preenchido com microlitros (μL) da fase aceptora
O solvente orgânico deve ser imiscível em água!!!
HF-LPME
Não há contato entre a fase aceptora e a matriz aquosa (fase doadora) permitindo agitação durante a extração.
HF-LPME
Nenhum aparato específico é necessário para a HF-LPME.
Existem duas configurações principais em que a HF-LPME é empregada:
Configuração em “U”.
Configuração tipo “haste”.
HF-LPME
HF-LPME
A HF-LPME pode ser utilizada em dois modos:
Duas fases;
Três fases.
DEPENDE DO ANALITO!!!
Duas fases:
Fase orgânica compatível com CG.
Analitos: moderadamente ou altamente hidrofóbicos
Três fases:
Conciliável com HPLC, CE e Espectroscopia atômica
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Analitos altamente hidrofílicos:
Dificuldade em ser extraídos apenas por difusão;
POSSIBILIDADE: Adição de reagente iônico relativamente hidrofóbico à fase doadora ou orgânica.
Recentemente relataram o emprego de tensoativos não-iônicos (Triton X-100®) para determinar drogas de abuso hidrofílicas em cabelo.
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RECUPERAÇÃO E FATOR DE ENRIQUECIMENTO
Em sistemas de duas fases a transferências dos analitos fase aquosa para a orgânica é:
Analito de interesse
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Coeficiente de partição entre a fase orgânica e fase doadora:
Concentração de A na fase doadora
Concentração de A na fase aceptora
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Recuperação: quantidade total de analito (%), que transferida para a fase aceptora no final da extração.
Coeficiente de partição e razão entre volume da fase doadora e da fase aceptora
Soma do solvente orgânico presente nos poros da membrana e no lúmen. 
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A extração em duas faces:
Favorecida para analitos hidrofóbicos (elevados coeficientes de partição).	
Recuperação pode ser favorecida aumentando a razão entre as fases doadora e aceptora (utilizar fibras mais longas ou de maior diâmetro).	
Recuperação real é menor que a calculada: a análise é somente com a fração do lúmen.
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Fator de enriquecimento: informa o grau de concentração do analito que ocorreu durante a extração.
Sistema de 3 fases:
O coeficiente de partição: fase orgânica e fase doadora / fase aceptora e fase orgânica
HF-LPME
O coeficiente de partição entre a fase aceptora e doadora:
Recuperação:
HF-LPME
A extração em três fases:	
O volume da fase aceptora está disponível a recuperação é diretamente pela equação.
O solvente orgânico selecionado deve apresentar altos valores de coeficientes de partição (Kd e Ka)
PARÂMETROS QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM LPME
	Além das características inerentes do analito e da razão das fases aceptora e doadora, alguns outros parâmetros devem ser considerados durante o desenvolvimento do método.
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MEMBRANA HIDROFÓBICA
As membranas capilares empregadas em LPME devem ser hidrofóbicas e compatíveis com os solventes orgânicos utilizados.
Membranas baseadas em polipropileno.
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Destas, a mais empregada apresenta :
diâmetro interno de 600 μm;
parede com espessura de 200 μm;
poros com tamanho de 0,2 μm.
 
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SOLVENTE ORGÂNICO
Etapa fundamental na otimização de métodos na LPME;
Vários solventes orgânicos têm sido utilizados, como éter diexílico, n-octanol, acetato de hexila, acetato de butila, acetato de dodecila, éter dibutílico e isooctanol, ou misturas desses solventes.
HF-LPME
Algumas propriedades são necessárias para um solvente orgânico ser empregado em LPME:
baixa solubilidade ou insolubilidade em água;
baixa volatilidade;
compatibilidade com a membrana capilar utilizada;
fácil impregnação nos poros da mesma e solubilidade adequada para o analito de interesse.
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TEMPO DE EXTRAÇÃO
A eficiência da extração na LPME depende da transferência de massa do analito da fase aquosa para a orgânica e desta para a fase aceptora;
é um processo de equilíbrio;
o tempo necessário para atingir esse equilíbrio pode ser reduzido aumentando a área superficial de contato da fibra com a amostra.
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TEMPERATURA
Com o aumento da temperatura, os coeficientes de difusão aumentam em resposta à diminuição da viscosidade;
 o tempo requerido para alcançar o equilíbrio é diminuído.
HF-LPME
Por outro lado, os coeficientes de partição para a fase aceptora diminuem, reduzindo a quantidade de fármaco extraído no estado de equilíbrio;
portanto, a velocidade das extrações pode ser melhorada a custa da perda da detectabilidade do método.
HF-LPME
AGITAÇÃO
Normalmente é aplicada para acelerar a cinética de extração,
facilitando a difusão dos analitos através da interface fase doadora – solvente orgânico;
diminuição do tempo necessário para o sistema atingir o equilíbrio.
HF-LPME
Na SDME, o uso de velocidades de agitação elevadas provoca a perda da fase aceptora presente na ponta da agulha, prejudicando a quantificação dos analitos. 
Por outro lado,na LPME, a fase aceptora está contida no interior da fibra cilíndrica, possibilitando o emprego de velocidades mais elevadas de agitação.
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PH DA FASE DOADORA
É crucial para a eficiente extração de compostos ácidos e básicos;
o ajuste do pH resulta em uma maior razão de distribuição e garante elevados fatores de enriquecimentos e valores de recuperação do analito de interesse;
ajustes no pH podem aumentar a eficiência da extração.
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ADITIVOS NA FASE DOADORA
Sais
Modificadores orgânicos
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SAIS
Pode aumentar a eficiência da extração, particularmente para analitos mais polares, devido ao efeito denominado “salting-out”;
por outro lado, a interação das moléculas do analito com os íons adicionados, pode reduzir a difusão do analito para a fase extratora;
além disso, o aumento da viscosidade da matriz pode reduzir a mobilidade dos analitos e prejudicar também a extração.
HF-LPME
MODIFICADORES ORGÂNICOS
Muitos fármacos estão ligados às proteínas das matrizes biológicas de forma bastante intensa e essas interações podem ser responsáveis por baixos valores de recuperação;
As ligações fármaco-proteínas ocorrem devido a interações iônicas, hidrofóbicas ou mesmo polares;
As interações hidrofóbicas podem ser suprimidas pela adição de alguns solventes orgânicos à matriz contendo o fármaco de interesse.
HF-LPME
REAGENTES PARA FORMAÇÃO DE PARES IÔNICOS
Há duas formas de emprego desta técnica na extração por LPME: 
adição de um reagente aniônico (Q-);
adição de um reagente catiônico (Q+) à amostra.
HF-LPME
Dentre os reagentes catiônicos, as aminas quaternárias contendo cadeias alquila são bastante utilizadas para extração de compostos carboxilados;
para análise de compostos de caráter básico, ácidos octanóico e decanóico ou sais destes vêm sendo utilizados com sucesso.
HF-LPME
FASE ACEPTORA NO SISTEMA DE TRÊS FASES
	Na LPME de três fases direcionada para extração de fármacos de caráter básico, o pH da fase aceptora deverá estar na faixa ácida, promovendo eficaz protonação dos analitos.
HF-LPME
Ácidos utilizados:
clorídrico;
acético;
fórmico;
nítrico;
sulfúrico;
trifluoracético.
Ácidos fortes se destacam resultando em melhores valores de recuperação
HF-LPME
Para extração de compostos ácidos, soluções de hidróxido de sódio 0,01-0,1 mol L-1 vêm sendo empregadas como fases aceptoras.
Pode-se utilizar fases aceptoras constituídas por soluções-tampão ajustadas no pH de interesse.
Alguns estudos empregando LPME em três fases, a adição de modificadores orgânicos promoveu o aumento na extração.
HF-LPME
Analitos altamente polares e hidrofílicos são difíceis de serem extraídos, sendo necessária a adição de par-iônico na amostra.
solventes com alto ponto de ebulição e insolúveis em água devem ser utilizados, deixando o método menos seletivo.
Limitações da LPME
perda de precisão ocasionada pela operação manual do procedimento e trabalho com baixo volume de fase aceptora. Logo, é fundamental o emprego da padronização interna na quantificação das amostras.
feita de forma manual.
Falta de automação do processo, porque é uma técnica relativamente nova.
LPME
Aplicação em 
Matrizes 
biológicas
Aplicação em 
Matrizes 
Ambientais
Aplicação em 
Matrizes 
Alimentícias
Aplicações da LPME na extração de analitos de diferentes matrizes
Plasma
Sangue total
 
Saliva 
Urina
Cabelo
Leite materno
 
Aplicação em 
Matrizes 
biológicas
Amostras de água de esgoto
Água de rio / lago /mar
Água de torneira
 Água para uso doméstico
Amostras de chorume de aterros sanitários
Água de irrigação 
Solo 
Poeira
Aplicação em 
Matrizes 
Ambientais
Água mineral para drinks
 
Amostras de água mineral engarrafada
Tecido de animal aquático
Sumos de fruta
Músculo suína
Leite bovino
Mel
Vegetais
Aplicação em 
Matrizes 
Alimentícias
Plasma
o plasma é a amostra biológica preferida para fins de monitorização terapêutica, pois a concentração do analito nesta matriz (ou no sangue total) informa a exposição direta dos tecidos ao fármaco em questão.
Composição: proteínas; albumina corresponde a 55% do total, além de α1 glicoproteína ácida, lipoproteínas e imunoglobulinas, entre outras; eletrólitos; Lipídeos; hormônios e metabólitos, cujas concentrações estão sujeitas a variações fisiológicas ou patológicas.
A análise de fármacos pode ser difícil devido aos interferentes endógenos ou exógenos, bem como devido à ligação de fármacos às proteínas plasmáticas.
Aplicações da LPME na extração de fármacos de matrizes biológicas
Sangue total
Além das proteínas, os fármacos também podem interagir com outros biopolímeros, como hemácias, as quais representam 45% do volume sanguíneo total
Normalmente, a análise de sangue total não requer nenhum tratamento prévio para extração
devido à maior viscosidade do sangue total em relação ao plasma, o tempo necessário para atingir o equilíbrio de extração é ligeiramente maior.
urina
Relativa facilidade de coleta 
 principal via de excreção de fármacos e metabólitos.
contém compostos inorgânicos e orgânicos, com quantidade relativamente grande de sais.
Variações no pH e variações na força iônica promovem efeitos significantes na extração.
Baixos valores de recuperação obtidos nas técnicas de microextração.
Leite materno
um meio de quantificar compostos que foram ingeridos previamente pela mãe e que podem, potencialmente, causar dano ao recém-nascido.
É constituído por água (88%), proteínas (3%), lipídeos (aproximadamente 3%) e carboidratos na forma de lactose (6,8%).
Matriz complexa.
Saliva
pouco explorada na análise de fármacos.
conteúdo de lipídeos e proteínas é pequeno quando comparado a outros fluidos.
É uma matriz não-invasiva e de relativa facilidade de coleta.
É constituído por água (88%), proteínas (3%), lipídeos (aproximadamente 3%) e carboidratos na forma de lactose (6,8%).
Uma consideração importante na análise de fármacos na saliva é a possível contaminação da cavidade bucal com outras substâncias
cabelo
coleta é relativamente não-invasiva e o conteúdo pode informar uma história de exposição por um longo período.
devido às características apolares da matriz, ocorre o acúmulo preferencial do fármaco na forma original em relação aos metabólitos (mais polares).
Aplicações
Método para análise de iodo em amostras de leite.
Emprego da HF-LPME para extração de iodo de amostras de leite.
 cromatografia gasosa de detecção por captura de elétrons foi utilizada para identificação e quantificação do analito.
 
HF-LPME
Simplicidade
 rapidez
 menor manipulação da amostra
 baixo consumo de orgânicos solventes tóxicos
Como nova possibilidade miniaturizada para preparo de amostra para análise de Iodo surge: 
Preparo do leite para análise
2,5 g de pó fórmula infantil foi dissolvido em 15 mL de água deionizada a 60 ° C
Adição de H2SO4 2 mol/L
Diluição a 50 mL de solução
Como era esperado, houve a precipitação das proteínas 
Uso do sobrenadante para a extração do analito
Extração do iodo 
Os segmentos de fibra oca foi sonicada durante 2 min em
acetona
Secagem a temperatura ambiente
1-octanol
1-octanol foi usado para impregnação dos poros da fibra
3 mL da amostra aquosa (contendo o analito)
Fibra na presença do solvente
Otimizações do método 
Parâmetros
Velocidade de rotação
Tempo de extração 
Adição de sal 
Solvente Orgânico
Solvente orgânico
A seleção de um solvente orgânico adequado para se HF-LPME de grande importância
O solvente orgânico
utilizado para esta propósito deve ter vários requisitos:
Baixa solubilidade em fase aquosa
Baixa volatilidade
Alta solubilidade do analito alvo
Compatibilidade com fibras ocas
Solvente orgânico
Solventes testados : 
 1-undecanol
 1-decanol
 1-octanol Boa estabilidade e capacidade de repetição
Hexano
 iso-octano 
3-pentanona
Velocidade de rotação
A agitação das amostras pode diminuir a espessura do filme por difusão e acelerar a cinética de extração
reduz o tempo necessário para atingir o equilíbrio termodinâmico
Tempo de extração
Microextração em fase líquida é um equilíbrio, mas não exaustiva.
Toda a extração em condições mantidas constantes durante a extração . São suficientes para dar sensibilidade satisfatória e precisão.
Adição de sal
 A adição de sal, geralmente causa uma melhoria na eficiência de extração. No entanto, existem vários casos em que a adição do sal exibiu um efeito reverso e causou uma diminuição eficiência de extração. Justificativa :
Crescentes interações entre o analito e os íons de sal.
Aumento da viscosidade da solução da amostra com aumento da concentração de sal.
Redução taxa de transferência de massa do analito. 
Amostra real 
Fator de impacto = 4,612
APLICAÇAO
Resumo
Um método rápido foi otimizado e validado a fim de quantificar anfetaminas, como:
anfetamina, (AMP)
 Metanfetamina, (MAMP);
 Fenproporex, (FPX); 
3,4-metilenodioximetanfetamina, (MDMA);
 3,4-dioximetilenoanfetamina, (MDA)
em amostras de cabelo humano, utilizando HF-LPME e GC-MS.
APLICAÇAO
Introdução
Histórico
 Lázaro Edeleano, em 1887, foi quem primeiro obteve essa substância em laboratório, que só foi utilizada em larga escala durante a Segunda Guerra Mundial. 
Mais tarde, quando a ação das anfetaminas como inibidoras do apetite foi comprovada, elas passaram a ser usadas para dietas alimentares
APLICAÇAO
INTRODUÇAO
APLICAÇAO
O que são anfetaminas? 
O que são anfetaminas? 
INTRODUÇAO
APLICAÇAO
Definição: “Anfetamina é uma droga sintética de efeito estimulante da atividade mental. A denominação “anfetaminas” é atribuída a todo um grupo de substâncias como: fenproporex, metanfetamina e dietilpropiona.”
Moderador de apetite.
Em pacientes diagnosticados com Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade. 
Como drogas de abuso, o ecstasy 
As anfetaminas também são conhecidas como “Rebite” pelos motoristas e entre os estudantes, por “bola”. 
APLICAÇAO
INTRODUÇAO
Qual a finalidade do composto ?
Fenproporex é consumido em larga escala no Brasil, tornando o país o maior produtor e consumidor do medicamento. O Brasil produziu em media 73% do Fenproporex comercializado em TODO O MUNDO no ano de 2009. 
APLICAÇAO
INTRODUÇAO
EXPERIMENTAL
Preparação das soluções padrão
Soluções de trabalho de AMP, MAMP, FPX, MDMA, e MDA e os padrões interno (IS) AMP-D5 e MDMA-d5 em concentrações de 10 ug/mL e 1 ug/mL foram preparadas com metanol em vidraria volumétrica. 
Soluções estoque foram estocadas e refrigeradas (2-8 °C) quando não utilizadas. 
APLICAÇAO
Instrumentação
Fibra-oca Q3/2 Accurel KM polypropileno (600 um i.d., 200 um de parede fina e 0,2 um de tamalho de poro) foi comprada da Membrana (Wuppertal, Germany). 
Análises de GC-MS usando um cromatógrafo à gás modelo Focus GC acoplado com um detector seletivo de massas por armadilha iônica. 
Separação cromatográfica foi realizada sobre uma coluna capilar de sílica fundida (HP-5MS) (30 m x 0,25 mm x 0,25 um filme fino) usando hélio como gás de arraste em 0,6 mL/min em taxa de fluxo constante. Injeções foram feitas no modo splitless. 
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
O MSD foi por impacto de elétrons (70 eV) no modo de escaneamento (70-300 m/z). 
O orifício do injetor e a temperatura da interface foi de 270 °C. 
A temperatura do forno foi mantida em 70 °C por 2 min, programado em 10°C/min com uma sustentação em 190 °C por 1 min; programado novamente em 20°C/ min com uma sustentação em 270°C por 1 min.
Instrumentação
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
Instrumentação
 A seguir os íons foram escolhidos para quantificação dos analitos: AMP (140); MAMP (154), FPX (193), MDMA (162), e MDA (162). 
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
Os critérios de aceitação de qualificação foram:
tempo de retenção dentro de 2% comparado com 	os padrões analisados em algumas bateladas,
espectro de massas devendo ter um bom correspondente visual que o dos padrões. 
Amostras de cabelo da cabeça
	Amostras de cabelo da cabeça foram obtidos de 6 voluntários que reportaram uso regular de anfetaminas. 
	Elas foram cortadas com tesouras tão perto quanto possível do couro cabeludo na posterior região do vértice. 
	O sujeito forneceu informação de consentimento prévio de sua participação no estudo. 
EXPERIMENTAL
 	O protocolo do estudo foi previamente aprovado pelo comitê de ética da faculdade de ciências farmacêuticas, USP, Brasil. 
	Antes das análises, os exemplares foram estocados sob condições secas em temperatura ambiente em envelopes de papel. 
Uma amostra de controle negativo foi obtido de um membro do laboratório. 
Amostras de cabelo da cabeça
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
Preparação da Amostra
Descontaminação. Lavagem das amostras com 2.0 mL de diclorometano. (2x)
Remoçao do solvente. As amostras foram secas e cortadas em pequenas peças, 1 mm 
Alíquota de 50 mg + 1 mL de NaOH 1 M e 10 ng dos PIs (AMP-d5 e MDMA-d5) 
digestão!
mantido em banho maria em 70 °C por 15 minutos 
Resfriado até a temperatura ambiente, colocado em um tubo ependorf (de 2 mL) com 10 mg de NaCl. 
Uma fibra oca de 9-cm foi cheia com dihexil éter nos poros
Extração!
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
Preparação da Amostra
Uma fibra oca de 9-cm foi cheia com dihexil éter nos poros
 
O lúmen da fibra foi preenchido com a fase aceptora 15 uL de HCl 0,1 M
introduzida na solução da amostra em configuração de u
Durante a extração, o sistema foi submetido à agitação de 1000 rpm por 45 minutos em um agitador eppendorf. 
Depois, a fase aceptora foi retirada da fibra e seca sob fluxo de nitrogênio. 
APLICAÇAO
O resíduo foi derivado com 100 uL de TFAA: acetato de etila (50:50) em 70°C por 30min. 
EXPERIMENTAL
Preparação da Amostra
APLICAÇAO
Resfriado, as amostras foram secas mais uma vez 40°C sob fluxo de N2
Re-suspensa com 50 uL de acetato de etila
Uma alíquota de 1.0 uL desta solução foi injetado no sistema GC-MS. 
EXPERIMENTAL
Otimização do método
APLICAÇAO
O estudo da otimização do método foi realizado tomando em consideração 
	escolha da fase orgânica, 
	influência da fase aceptora,
	tempo para extração
	intensidade de agitação/sonicação,
 	e adição de sal sobre o rendimento da extração 
EXPERIMENTAL
Depois de otimizado o método, decorreu a validação estabelecendo-se
Limites de detecção e quantificação (LoD e LoQ)
Linearidade
Precisão intra e inter dia
Exatidão
 e valores de recuperação
Validação do método
APLICAÇAO
EXPERIMENTAL
Preparação das amostras
APLICAÇAO
RESULTADOS
O procedimento da hidrólise alcalina das amostras de cabelo mostrou ser apropriado.
 A técnica de HF-LPME mostrou ser eficiente por : 
	Eliminar o efeito de carry-over
	Obter alto rendimento de amostra
	
 A desvantagem é a falta de automação da técnica. 
Otimização
APLICAÇAO
RESULTADOS
 Diferentes solventes orgânicos como (éter diexil, xileno, e n-octano) foram testados. 
Somente éter dihexil forneceu sinais mensuráveis dos analitos, 
 As anfetaminas analisadas neste estudo tiveram valores de pKa na faixa de 9.41 para 9.90, não necessitando ajuste de pH.
APLICAÇAO
RESULTADOS
Figura: Influência da fase aceptora [HCl] no rendimento de extração. Outras condições do experimento foram fixadas: tempo de extração (45 min) agitação. (1000 rpm). 
Otimização
Otimização
APLICAÇAO
RESULTADOS
Figura: Influência do tempo de extração na resposta dos analitos. Outras
condições do experimento foram fixadas: fase aceptora (HCl 0.1 M) e agitação (1000 rpm). 
Otimização
APLICAÇAO
RESULTADOS
Figura: Influência da agitação no rendimento de extração. Outras condições do experimentos foram fixadas: tempo de extração (45 min) e fase aceptora (HCl 0.1 M).
Otimização
APLICAÇAO
RESULTADOS
 Adição de sal (10 mg de NaCl) para a solução da amostra não causou uma notável melhoria na eficiência da extração.
 Entretanto, melhorou a precisão com o uso de sal e esta condição foi selecionada para a padronização do método.
Prova de Aplicabilidade
APLICAÇAO
RESULTADOS
Anfetamina foi detectada em todas as amostras dos voluntários uma vez que esta substancia é um metabólito do fenproporex.
Prova de Aplicabilidade
APLICAÇAO
RESULTADOS
Figura: Cromatograma obtido com as análises de anfetaminas em cabelo usando HF-LPME. (1) Cabelo enriquecido em 2.0 ng/mg de (A) anfetamina, (B) anfetamina-d5, (C) metanfetamina, (D) MD, (E) fenproporex, (F), (G) MDMA-d5; (2) branco; (3) amostra real de cabelo contendo 0,78 ng/mg de anfetaminas, e 0,21 ng/mg de fenproporex. 
1
2
3
Prova de Aplicabilidade
APLICAÇAO
RESULTADOS
 Somente o voluntário 3 permitiu a avaliação do histórico de consumação devido ao comprimento de seu cabelo. 
 Todos os voluntários admitiram uso de fenproporex, no entanto, esta substancia não foi detectada em todas as amostras mesmo quando anfetamina fora detectada. 
 Estes resultado sugere que fenproporex parece incorporar menos eficientemente que anfetamina na matriz. 
APLICAÇAO
CONCLUSÕES
 Os resultados demonstraram que o procedimento HF-LPME é bem adequado para a determinação de algumas anfetaminas do tipo estimulantes (anfetaminas, fenproporex, metanfetamina, MDMA, e MDA) em amostras de cabelo humano.
 O método desenvolvido provou ser simples e prático com pouco uso de solvente orgânico para as análises. 
 Este método pode ser prontamente utilizado para diferentes propostas desde que se tenha consumo regular de anfetaminas.
CONCLUSÕES
APLICAÇAO
A LPME desponta como sendo extremamente atrativa, pois as unidades de extração apresentam baixo custo.
consumo de solvente orgânico é praticamente eliminado.
técnica é compatível com uma grande variedade de amostras; biológica, ambiental e alimentícia.
A técnica pode ainda proporcionar de médias a elevadas recuperações, com elevado enriquecimento dos analitos, seletividade e excelente “clean-up” (limpeza) de amostras complexas.
Grato pela atenção !!