RELATÓRIO TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ 
CÂMPUS DOIS VIZINHOS 
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Felipe Moura Dias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO: 
 COMPETÊNCIA E TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dois Vizinhos, Paraná 
Maio 2018 
INTRODUÇÃO 
 
 A competência bacteriana é o processo temporário, no qual a célula passa 
para se tornar mais suscetível à entrada de DNA’s exógenos. Existem uma gama 
de variações da técnica com o enfoque em aumentar a eficiência da 
transformação bacteriana em diferentes células e com diferentes vetores (ZAHA; 
FERREIRA; PASSAGLIA, 2014) 
As teorias que justificam a ação de competência das células são três: a 
absorção de DNA como nutriente, como modelo para reparo de danos nos 
cromossomos ou para favorecer a troca genética (CHARPENTIER; POLARD; 
CLAVERYS, 2012). Já no laboratório, temos que a competência é realizada por 
intermédio de produtos químicos ou de correntes elétricas (YUTIN, 2013). 
A transformação é o processo no qual, o DNA exógeno é integrado à 
célula. Existem diferentes formas de induzir a transformação em uma célula, 
sejam eles biológicos, físicos e químicos. Os métodos biológicos por exemplo, 
são fortemente empregados em terapias genicas, pois o mesmo é um método 
integrador, ou seja, o gene introduzido é capaz de integrar-se ao genoma da 
célula hospedeira. Já os métodos físicos, existem muitos, exemplos deles são, 
o método: bombalístico, choque térmico, eletroporação, transfecção por laser, 
microinjeção, etc. Os métodos químicos, temos um dos mais utilizados para a 
transformação, que é a utilização do método de solução de fosfato de cálcio, por 
ser barato e de alta eficiência, pode-se citar também outros métodos, como o de 
lipofecção e de polímeros catiônico. 
 
OBJETIVOS 
Realizar o processo de competência das células de Escherichia coli, 
seguido da transformação por choque térmico da mesma, utilizando como vetor 
um plasmídeo. 
 
 
 
PARTE EXPERIMENTAL 
As células da E.coli utilizadas, foram cultivas a 37 ºC em 50 ml de meio 
LB líquido em constante agitação por 3 horas em Erlenmeyer. 
Então, transferiu-se 2 ml do meio contendo as células para microtubos e 
centrifugou-os por 10 min a 13.000 x g. 
Adicionou-se 700 ul da solução A, e imediatamente o transferiu para um 
cooler contendo gelo, com temperatura próxima de 4ºC. 
Após, centrifuga-se o microtubo, descartando o sobrenadante, e então, 
adiciona-se 500 ul da solução B (a mais concentrada). Novamente, mantem-se 
as células sobre a temperatura de 4ºC por um período de 5 minutos, para reduzir 
o metabolismo das mesmas. Passados os 5 minutos, centrifugou-se o microtubo 
por 10 minutos, e descartou-se o sobrenadante, ficando só as células no pellet, 
e adicionou-se então, a solução B novamente. 
Solubilizou-se por completo o pellet de células do microtubo com a 
solução B, retirou-se 200 ul das células competentes e colocou-se em um 
microtubo estéril, e então adicionou-se 4 ul do plasmídeo de interesse. Após 
incuba-se por 5 minutos, o microtubo no cooler contendo gelo com temperatura 
próxima de 4ºC. 
O processo do choque térmico foi realizado uma vez apenas, ou seja, 
passou-se a célula que estava incubada a frio, para a incubação a quente na 
temperatura de 42ºC no banho-maria por 2 minutos, após o término desse 
intervalo, transferiu-se o microtubo para a incubação a frio, novamente no cooler 
com gelo; agora por um intervalo de apenas 30 segundos. 
Passados os 30 segundos, adicionou-se 1 ml do meio LB e manteve-se o 
microtubo sob agitação na temperatura de 37ºC por 30 minutos. 
Terminados o intervalo de descanso da célula, centrifugou-se a o 
microtubo contendo as células por 5 minutos. Em seguida, descartou-se o 
sobrenadante e adicionou-se uma pequena quantidade meio LB ao microtubo, e 
semeou-se uma quantidade no meio sólido contendo ampicilina e uma outra 
quantidade no meio sem ampicilina, com a concentração de ampicilina de 100 
ug/ml, semeou-se com o auxílio da alça de Drigalski. Por fim, enrolou-se as 
placas semeadas com papel filme e incubou-as em estuda a 37ºC por até 24h. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Meio de cultura LB (Luria Bertani) 
Foi utilizado o meio de cultura LB (Luria Bertani) devido o mesmo ser um 
meio específico para manutenção e cultivo de cepas recombinantes de 
Escherichia coli, pois muitas linhagens de E. coli são deficientes na síntese de 
Vitamina B, e a peptona contida no meio fornece a vitamina B, e funciona como 
fonte de carbono e nitrogênio, importantes para o bom crescimento da E. coli, 
além da peptona, o meio contêm extrato de levedura que fornece suplemento 
adequado de nutrientes, segundo sites de compra como a LOJALAB e a 
LABDEL. 
 
Parte I – Preparação de competência da E. coli 
 Tornar a E. coli competente, significa que iremos fazer com que a mesma 
fique em um estado de maior acessibilidade para a entrada do vetor de interesse, 
por conta disto é necessário que as células de E. coli estejam em condições 
ótimas, ou seja, com o metabolismo em perfeito funcionamento, e sem nenhuma 
condição de estresse. Portanto, utilizamos as células de E. coli quando as 
mesmas se encontravam na metade de sua fase exponencial de crescimento. 
A adição de soluções divalentes como o CaCl2, em conjunto com um 
tampão de pH 7,5. teve fundamental importância para neutralizar as cargas 
negativas da membrana fosfolipídica da célula, e o processo foi feito em duas 
vezes com uma solução de concentração maior, no entanto, alguns protocolos 
utilizam soluções de mesma concentração, o objetivo é o mesmo: saturar por 
completo a membrana, garantindo assim que todas as cargas sejam 
neutralizadas. 
 A condição inicial no qual foi deixada as células de E.coli é importante 
para manter as mesmas em condições ótimas, com o perfeito funcionamento do 
metabolismo, e sem condições de estresse, além de que o tempo de 3 horas, 
situa-se no que seria parte da metade da sua fase exponencial. 
A centrifugação das bactérias serve para concentra-las no fundo do 
microtubo, facilitando o descarte do meio de cultura, que a partir desse momento 
não existe a necessidade do mesmo para as etapas futuras. 
A adição da solução A, teve como objetivo neutralizar as cargas da 
membrana, e a transferência imediata para o cooler com temperatura próxima 
de 4ºC teve como finalidade diminuir o metabolismo das células, para não 
ocorrer mortes celulares devido ao estresse e falta de substrato. 
A adição da solução B, como explicado acima, teve como objetivo saturar 
por completo a membrana da célula, neutralizando todas as cargas negativas. A 
partir do momento em que é centrifugado e descartado o sobrenadante, e é 
novamente adicionado à solução B, possuímos em nosso microtubo células 
competentes, e desta forma, pode-se iniciar o processo de transformação. 
 
Parte ll – Transformação de E.coli 
A proporção de volume do plasmídeo e de células competentes utilizada, 
foi devido a mesma gerar bons resultados de transformação. Após a adição dos 
plasmídeos no microtubo contendo as células competentes, manteve-se o 
microtubo no cooler para garantir o espalhamento homogêneo das bactérias. 
O processo de choque térmico é método físico para modificar a célula, o 
mesmo cria um desbalanço térmico na membrana, auxiliando o bombeamento 
do DNA exógeno para dentro da célula por meio das zonas de adesão. 
A adição de 1 ml do meio LB, teve a serventia de proporcionar nutrientes 
e energia para a incorporação do plasmídeo. O intervalo de 30 minutos é 
conhecido como descanso, e é um tempo interessantepara que a célula possa 
incorporar o plasmídeo, antes de colocarmos nossas células transformadas a 
prova de um antibiótico. Ressalta-se que alguns protocolos não utilizam esse 
tempo de descanso, e isso depende muito da célula que estamos trabalhando, 
algumas conseguem incorporar de imediato o plasmídeo ao seu DNA, outras 
necessitam de um intervalo de tempo para que isso ocorra. 
A incubação das placas a temperatura de 37ºC e no intervalo de 24h, foi 
por conta da E.coli ser uma bactéria que possui rápido tempo de geração, 
portanto as 24h esperadas foi um intervalo suficiente para o crescimento da E. 
coli. 
Após esse tempo é possível verificar se houve sucesso na incorporação 
do plasmídeo na nossa célula, por meio da verificação do meio com antibiótico, 
caso o mesmo possua alguma colônia de bactéria. Ressalta-se que o antibiótico 
não possui serventia para descobrir se o plasmídeo realmente ligou-se com o 
DNA bacteriano, pois a célula pode incorporar o plasmídeo e expressar as 
informações necessárias para resistir o antibiótico por um curto tempo, sem a 
necessidade de ligar seu DNA com o plasmídeo. 
 Na presente prática, obtivemos resultados não esperados, pois não houve 
o crescimento de colônias nas placas contendo ampicilina, portando a 
transformação não ocorreu, ocorrendo o mesmo com as placas sem ampicilina. 
Os possíveis motivos para a não ocorrência da transformação são: erros no 
momento da pipetagem do plasmídeo; a solução divalente possivelmente não 
despolarizou a célula, fazendo com que a mesma não se tornanasse 
competente, ou também devido não termos seguido o protocolo 100%. Quanto 
ao resultado obtido pelas placas não contendo ampicilina, sugere-se que 
provavelmente a quantidade de células de E.coli utilizadas, era baixa. As 
imagens a seguir mostram a placa sem o uso de ampicilina e com o uso de 
ampicilina 
 
 
 
 
 
 
 Figura 1: Placas após 24h em imcubação a 37ºC 
 
Sem ampicilina Com ampicilina 
Fonte: (Acervo pessoal, 2018) 
 
Questões 
1)O que significa dizer que as bactérias estão competentes? 
Significa que as mesmas se encontram em condições ótimas, ou seja, com o 
metabolismo em perfeito funcionamento, e sem nenhuma condição de estresse, 
além de que, significa também, que sua membrana está totalmente 
despolarizada, estando em um estado de maior acessibilidade para a entrada do 
vetor de interesse. 
2) Por que as bactérias foram deixadas por 3 horas crescendo a 37°C antes 
do início da aula prática? Qual a importância desta etapa? 
A condição inicial no qual foi deixada as células de E.coli é importante para 
manter as mesmas em condições ótimas, com o perfeito funcionamento do 
metabolismo, e sem condições de estresse, além de que o tempo de 3 horas, 
situa-se no que seria parte da metade da sua fase exponencial. 
3) Qual a função do Cloreto de Cálcio durante o processo de competência? 
E por que usamos soluções de CaCl2 em duas concentrações diferentes? 
A solução de cloreto de cálcio serviu para despolarizar a membrana celular, 
proporcionando cargas positivas para neutralizar as cargas negativas da 
membrana. Utilizamos concentrações diferentes, uma de menor concentração e 
outra de maior concentração, e o motivo foi para despolarizar a membrana 
celular, e também para que houvesse o mínimo de estresse para a célula ao 
utilizar a concentração menor, e ao utilizar a solução de maior concentração, 
proporcionaríamos a saturação da membrana, neutralizando-a por completo. 
4) Se eu não tivesse cálcio em meu laboratório, poderia usar outro reagente 
para o mesmo processo? 
Sim, qual quer solução que gerem íons divalentes. 
5) O resultado obtido foi o esperado? Explique: 
Não, pois não houve crescimento de colônias nas placas contendo ampicilina, 
portando a transformação não ocorreu, o mesmo ocorreu com as placas sem 
ampicilina. Os possíveis motivos que ocasionaram tal resultado, são: 
• Erros de pipetagem do plasmídeo; 
• Os plasmídeos poderiam não estar viáveis para a prática; 
• A solução não despolarizou a célula e a célula não se tornou competente; 
• Não termos seguido o protocolo 100%; 
• Problemas no meio de cultura, onde o mesmo não ficou completamente 
sólido; 
• A concentração de ampicilina poderia estar muito forte. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERENCIAS 
 
 
CHARPENTIER, Xavier; POLARD, Patrice; CLAVERYS, Jean Pierre. Induction 
of competence for genetic transformation by antibiotics: Convergent evolution of 
stress responses in distant bacterial species lacking SOS? Current Opinion in 
Microbiology v. 15, n. 5, p. 570–576 , 2012. 
 
 
Informações do Meio de cultura LB (Luria Bertani) - Labdel. Disponível em: 
<http://www.labdel.com.br/shop/12d9f6-caldo-lb-miller-luria-bertani/>. Acesso 
em: 01 mai. 2018 
 
 
Informações do Meio de cultura LB (Luria Bertani) - Lojalab. Disponível 
<https://www.lojalab.com.br/produto_meio-lb-luria-bertani---frasco-500g_1168>. 
Acesso em: 01 mai. 2018 
 
 
 
YUTIN, N. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. 2. ed. New York: 
ACADEMIC PRESS, 2013. 530-532 p. 
 
 
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia molecular 
básica. 5. ed. Porto Alegre: ArtMed, 2014.