Avaliação das Medidas de Ferro Sérico e Capacidade de Ligação do Ferro à Transferrina

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NewsLab - edição 65 - 200484
Avaliação das Medidas de Ferro Sérico e
Capacidade de Ligação do Ferro à Transferrina
(TIBC) Usando o Método Synermed
Gisélia Aparecida Freire Maia de Lima, Helena Zerlotti Wolf Grotto
Divisão de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas e Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP
Artigo
IntroduçãoIntrodução
O ferro é um elemento essen-cial para o metabolismo de
qualquer organismo vivo. Sendo
um dos elementos do grupo heme,
está envolvido na captação e
transporte do oxigênio aos teci-
dos, na composição de coenzimas
do ciclo de Krebs, na formação de
peroxidases que protegem as cé-
lulas do dano oxidativo, da sínte-
se de DNA e proliferação celular,
entre outras funções (Cook et al,
1992, Ponka et al,1998, Baynes,
1996, Fairbanks & Beutler).
Aproximadamente 60 a 70% do
ferro corpóreo total é encontrado
na forma de hemoglobina, 10%
como mioglobina e outros compos-
tos heme, catalases e citocromos,
0,1% ligado à transferrina e os
restantes 20 a 30% estocados na
forma de ferritina (Ponka et al,
1998). O conteúdo total de ferro
no organismo é dividido em três
compartimentos: funcional, de es-
toque e de transporte
• compartimento funcional: é
o ferro envolvido no metabolismo
celular; este ferro está contido na
hemoglobina e mioglobina.
• compartimento de estoque:
o ferro absorvido que excede o re-
querido pelo compartimento fun-
cional é estocado como ferritina e
hemossiderina. O compartimento
de estoque tem como função prin-
cipal repor o ferro consumido pelo
compartimento funcional.
• os compartimentos de esto-
que e funcional são ligados por um
pequeno compartimento de trans-
porte, que é composto em gran-
de parte pela molécula de trans-
ferrina. Quando o compartimento
de estoque de ferro é exaurido, o
nível do ferro complexado à trans-
ferrina torna-se criticamente com-
prometido (Baynes, 1996, Cook et
al, 1992, Worwood 1997).
O ferro é absorvido como Fe++
no duodeno e jejuno proximal. A
absorção de ferro pela mucosa
ocorre através de duas vias dife-
rentes. A principal delas é atra-
vés da absorção do heme origi-
nário da hemoglobina, da mioglo-
bina e de outras proteínas ani-
mais. O heme é liberado de suas
apoproteínas pela ação dos ácidos
gástricos, sendo então absorvido
diretamente pelas células da mu-
cosa. Uma vez no interior das cé-
lulas, o heme é enzimaticamente
degradado liberando o ferro.
O ferro inorgânico na forma
férrica é reduzido pela redutase
férrica e é, então, absorvido atra-
vés da ação do transportador de
metal divalente (DMT-1 ou Nramp
2). A absorção do ferro é regula-
da de acordo com a necessidade
de ferro pelas células (Conrad et
al, 1999, Fairbanks & Beautler,
1995, Wick et al, 1996). Após a
absorção, o ferro é transportado
no plasma combinado a uma gli-
coproteína denominada transfer-
rina, sintetizada principalmente no
fígado e em menor quantidade no
sistema retículo endotelial e em
glândulas endócrinas, como tes-
tículos e ovários. Essa proteína
tem peso molecular de aproxima-
damente 80 KDa e tem uma vida
média de cerca de 7 dias (Cook et
al, 1992, Cook et al, 1993, Ponka
et al, 1998, Conrad et al 1999).
A transferrina é uma glicopro-
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Material e Métodos
teína monomérica constituída de
dois domínios homólogos, cada
um com uma alta afinidade de li-
gação ao Fe +++ (Ponka et al,
1998). A ligação de ferro à trans-
ferrina é um processo pH depen-
dente, uma propriedade que está
envolvida no mecanismo fisiológi-
co de liberação do ferro para a sua
utilização dentro da célula
(Workwood, 1997a). A transferri-
na no plasma está saturada em
30% com o ferro. Através de es-
tudos cinéticos e por termodinâ-
mica, sabe-se que a transferrina
pode estar presente no plasma
sob quatro formas: apotransfer-
rina livre do ferro, transferrina di-
férrica totalmente saturada e
transferrina monomérica conten-
do ferro ligado ao terminal N ou
terminal C (Ponka et al, 1998).
A anemia ferropriva é o tipo de
anemia mais freqüente em todo o
mundo. Na maior parte das vezes
o diagnóstico laboratorial é feito
sem maiores dificuldades. No en-
tanto, em alguns casos é necessá-
rio se fazer o diagnóstico diferenci-
al entre outras anemias que cur-
sam com microcitose e hipocromia,
como a β talassemia heterozigóti-
ca e a anemia de doença crônica.
Da mesma forma é importante ava-
liar a sobrecarga de ferro, condi-
ção que pode acarretar diversas
alterações em vários órgãos e teci-
dos (Cook et al, 1992). Assim, o
estabelecimento de testes labora-
toriais precisos, de fácil execução,
boa resolução e de baixo custo es-
tão constantemente sendo investi-
gados. O objetivo deste estudo foi
avaliar a determinação do ferro e
da capacidade total de ligação do
ferro à transferrina (TIBC), usando
os kits Ferro 600 - Synermed® e
UIBC- Synermed® (Synermed do
Brasil), tendo como padrão os kits
de Ferro e UIBC da Roche Diagnos-
tics, em uso na rotina do Laborató-
rio de Patologia Clínica do Hospital
das Clínicas da UNICAMP.
Material e Métodos
Métodos
Ferro sérico: ambos os méto-
dos utilizam o mesmo princípio de
reação: o ferro associado à trans-
ferrina é dissociado através da
adição de um ácido; em seguida o
íon férrico é reduzido à ferroso, na
presença de um agente redutor
(ascorbato). O íon ferroso reage
com um cromógeno, que no caso
do kit da Roche é o FerroZine e
produz um complexo vermelho,
lido a 570 nm, e o cromógeno da
Synermed é o Ferene S e forma
um complexo azul, lido espectro-
fotometricamente a 600 nm. A
absorbância do complexo ferro-
corante é proporcional à concen-
tração do ferro sérico da amostra.
TIBC: ambos os métodos deter-
minam a capacidade de ligação do
ferro não saturado (UIBC). Uma
quantidade conhecida e excessiva
de ferro é adicionada ao soro. O
ferro em excesso não ligado à
transferrina é quantificado após li-
gar-se ao cromógeno (FerroZine da
Roche e Ferene® da Synermed). A
diferença entre a quantidade de
ferro originalmente adicionada à
amostra e a medida do ferro re-
manescente não fixado correspon-
de ao UIBC. Para transformá-lo em
TIBC soma-se o UIBC à medida do
ferro sérico determinada pelo tes-
te descrito acima.
No caso do TIBC, as determi-
nações feitas com os kits comerci-
ais foram comparadas aos resul-
tados obtidos por técnica manual.
Resumidamente: um excesso de
ferro foi adicionado ao soro. Algum
ferro que não se ligou à transferri-
na foi removido com um excesso
de carbonato de magnésio, após
agitação vigorosa e centrifugação.
O sobrenadante foi tratado como
o soro para determinação do ferro
sérico, usando o kit de ferro da
Roche. O valor dessa leitura cor-
responde ao TIBC da amostra
(Worwood M, cap 7 do Dacie novo).
Equipamento
Todas as reações foram reali-
zadas automaticamente, utilizan-
do o equipamento Hitachi 917 da
Roche, seguindo as programações
e calibração recomendadas pelos
fabricantes dos kits.
Amostras
As amostras de soro foram co-
lhidas em jejum e conservadas a
–20o C até o momento de uso.
• 70 amostras (40 mulheres e 30
homens) de adultos normais, seleci-
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Resultados
onadas a partir de resultado de he-
mograma absolutamente normal
• 50 amostras selecionadas de
nossa rotina laboratorial, onde os
valores eram superiores ou infe-
riores aos valores de normalida-
de para ferro sérico (30 a 160 µg/
dL para mulheres e de 40 a 160
µg/dLpara homens)
• 75 amostras lipêmicas sele-
cionadas a partir do triglicérides
que variou de 200 a 953 mg/dL.
Foram realizados os seguintes
testes:
• Linearidade: analisamos duas
amostras para ferro e TIBC, com
diluições de 75%, 50%, 25% e 10%.
• Estabilidade: foram anali-
sados 10 “pools” de soro, com
valores de ferro entre 41 e 217
µg/dL e de TIBC entre 240 e 456
µg/dL. Esses “pools” foram ana-
lisados (hora 0) e armazenados
a –20o C. As demais avaliações
foram feitas após 24, 48, 72 e
96 h. Foi calculado o coeficien-
te de variação (CV) obtido a
partir das cinco leituras de cada
amostra.
• Reprodutibilidade: foram ana-
lisadas três amostras, com diferen-
tes valores de ferro. Cada uma
delas foi processada 10 vezes con-
secutivamente (intrabanho) e 10
vezes entre as amostras da rotina
laboratorial (interbanho).
• Correlação: as amostras fo-
ram analisadas pelos três méto-
dos e foi calculado o valor de r para
as duas reações.
Os resultados foram analisados
através de testes de correlação e
determinação do coeficiente de
variação (CV).
Resultados
Valores de referência
Inicialmente foram calcula-
dos os valores de referência
num grupo de indivíduos nor-
mais. As mesmas amostras fo-
ram analisadas pelos dois kits
comerciais para as dosagens de
ferro sérico e, para a determi-
nação dos valores de referên-
cia de TIBC, além dos dois kits,
foram obtidos também os resul-
tados referentes à metodologia
manual. Os resultados encon-
tram-se na Tabela 1.
Linearidade
As figuras 1 a 4 mostram os
resultados obtidos quando duas
amostras foram diluídas a 75%,
50%, 255 e 10%. As figuras 1 e
2 referem-se às dosagens de fer-
ro sérico e as figuras 3 e 4 às
dosagens de TIBC. Em todos os
ensaios os valores de r referen-
tes aos valores observados x es-
perados foram = 0,99.
Estabilidade
Os valores das amostras
correspondem às leituras de
ferro e TIBC de um pool de so-
ros que foram aliquotados e
armazenados a –20O C. A pri-
meira análise foi feita antes
do congelamento e para cada
medição feita em 24, 48, 72
e 96 h, uma alíquota foi des-
congelada. Como pode ser ob-
servado na tabela 2, o CV das
cinco leituras feitas no perío-
do de 96 h foi bastante satis-
fatór io para ambos os k i ts
(média < 3% para o reagente
Roche e 4,8 e 5,43% para o
reagente Synermed).
Grupos Ferro sérico (µg/dL) TIBC (µg/dL)
Synermed Roche Synermed Roche manual
Homens (n=30) Média 87,72 91,14 291,72 279,51 279,28
Mediana 82 94 279 264 263
Range 58-122 61-122 240-439 236-381 234-374
Valores de bula Range 50-160 59-158 250-400 228-428
Mulheres (n=40) Média 85,29 89,93 298,61 281 284,02
Mediana 81 86 290 279 274
Range 39-155 40-159 242-410 236-347 234-380
Valores de bula Range 40-150 37-145 250-400 228-428
Tabela 1. Valores de normalidade das determinações de ferro sérico
e TIBC (grupo controle, n = 70)
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Figura 2. Teste de linearidade para determinação de ferro
sérico usando o reagente Synermed. Amostra (1) = 142 µg/
dL, fS1= valores observados, DE1= valores esperados
Amostra (2) = 53µg/dL, fS2= valores observados, DE2=
valores esperados
Figura 6. Teste de estabilidade para determinação de ferro
usando o reagente Synermed. Cada linha representa uma
amostra (pool de soro) analisada.
Figura 4. Teste de linearidade para determinação de TIBC
usando reagente Synermed. Amostra (1)= 395µg/dL, tibcS1=
valores observados, DE1= valores esperados
Amostra (2)= 265µg/dL, tibcS2= valores observados, DE2=
valores esperados
Figura 1. Teste de linearidade para determinação de ferro
sérico usando o reagente Roche. Amostra (1) = 173 µg/dL,
fR1= valores observados, DE1= valores esperados
Amostra (2) = 57µg/dL, fR2= valores observados, DE2=
valores esperados.
Figura 3. Teste de linearidade para determinação de TIBC
usando o reagente Roche. Amostra (1)= 376 µg/d, tibcR1=
valores observados, DE1= valores esperados
Amostra (2)= 270µg/dL, tibcR2= valores observados, DE2=
valores esperados
Figura 5. Teste de estabilidade para determinação de ferro
usando o reagente Roche. Cada linha representa uma amostra
(pool de soro) analisada.
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Figura 7. Teste de estabilidade para determinação de TIBC
usando o reagente Roche. Cada linha representa uma amostra
(pool de soro) analisada.
Figura 8. Teste de estabilidade para determinação de TIBC
usando o reagente Synermed. Cada linha representa uma
amostra (pool de soro) analisada.
Figura 11. Correlação entre Ferro sérico Roche e Synermed
em amostras alteradas (n= 50).
Figura 12. Correlação TIBC Roche e Synermed em amostras
com valores de ferro sérico inferiores ou superiores aos limites
normais (n= 50)
Figura 9. Correlação entre ferro sérico Roche e Synermed
em amostras normais (n=70).
Figura 10. Correlação entre TIBC Roche e Synermed em
amostras normais (n=70).
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Discussão
As figuras 5 a 8 representam a
evolução dos valores de ferro sé-
rico (figuras 5 e 6) e TIBC (figu-
ras 7 e 8) no período de 0 a 96 h.
Reprodutibilidade
Mostrou-se satisfatória tanto
nos ensaios intra como interbanho
para as três amostras avaliadas,
com valores de CV inferiores a 5%
(Tabela 3).
Teste de correlação
As mesmas amostras foram
analisadas pelos três métodos e
os valores obtidos foram subme-
tidos ao teste de correlação. A
tabela 4 e as figuras de 9 a 14
mostram esses resultados.
Discussão
Os métodos de avaliação do
estado de ferro freqüentemente
solicitados aos laboratórios de
análises constituem, na verdade,
de maneiras indiretas de se me-
dir o ferro corpóreo. Como medi-
das mais diretas e precisas como
flebotomia quantitativa, aspiração
e biópsia de medula óssea ou bi-
ópsia de fígado são métodos in-
vasivos, dispendiosos e desconfor-
táveis para o paciente, as deter-
minações de ferro sérico, TIBC,
dosagem de transferrina e de fer-
ritina sérica são amplamente uti-
lizadas. Entretanto, seus resulta-
dos devem ser interpretados com
cautela, já que essas medidas
estão sujeitas a diversos interfe-
rentes, como contaminação do
material de laboratório com resí-
“Pool” Valores Roche Synermed Valores de Roche Synermed
de ferro (CV%) (CV%) TIBC (CV%) (CV%)
(µµµµµg/dL) (µµµµµg/dL)
1 82,0 1,10 6,3 379,0 3,5 13,1
2 90,0 3,36 5,19 318,0 2,15 5,28
3 77,0 1,73 3,61 336,0 2,4 4,82
4 92,0 4,15 4,07 338,0 2,34 3,84
5 96,0 4,34 5,28 297,0 1,67 3,85
6 106,0 2,07 3,54 295,0 4,23 6,13
7 52,0 2,17 7,51 449,0 1,69 3,14
8 97,0 1,14 2,34 298,0 2,18 8,4
9 80,0 1,52 5,6 293,0 2,05 2,18
10 217,0 1,10 4,56 243,0 1,22 3,59
Média
2,69 4,8
Média
2,34 5,43
CV(%) CV(%)
Tabela 2. Coeficiente de variação (CV%) de cinco leituras
(0 hora e após 24, 48, 72 e 96 h) de 10 "pools" de soro
Figura 13. Correlação de Ferro sérico Roche e Synermed
em amostras lipêmicas (n=75).
Figura 14. Correlação TIBC Roche e Synermed em amostras
lipêmicas (n= 75)
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duos de ferro, especificidade do
cromógeno utilizado e presença
de hemólise, que podem acarre-
tar um prejuízo na sensibilidade
e precisão do método. Além dis-
so, diversos estados fisiológicos
e patológicos influenciam as
concentrações do ferro, TIBC e
ferritina. Por exemplo: a concen-
tração de ferro sérico está dimi-
nuída durante os processos infec-
ciosos, inflamatórios e neoplási-
cos e está elevada na eritropoie-
se ineficaz e na doença hepática
Tabela 3. Valores de CV (%) nos testes de reprodutibilidade
Intrabanho Interbanho
Roche Synermed Roche Synermed
Ferro TIBC Ferro TIBC FerroTIBC Ferro TIBC
Amostra 1 0,66 1,56 1,37 4,0 1.0 1,08 4,11 4,37
Amostra 2 2,32 0,77 2,54 0,96 2,79 0,7 3,57 0,97
Amostra 3 0,77 1,15 1,22 0,83 1,96 1,16 0,93 0,83
Grupos Correlações Ferro TIBC
Normal
MXS - r=0,77*
(n=70)
MXR - r=0,79*
SXR r=0,95 r=0,79*
Alterado
MXS - R=0,95
(n=50)
MXR - R=0,95
SXR R=0,99 R=0,98
Lipêmico
MXS - R=0,91
(n=75)
MXR - R=0,89
SXR R=0,97 R=0,97
Total
MXS - R=0,85
(n=195)
MXR - R=0,94
SXR 0,98 R=0,92
Tabela 4. Correlação entre métodos (valor de r)
* p < 0,05 / M = método manual para TIBC / S = reagente Synermed
 R = reagente Roche
(capítulo 10 do Henry, 12 ed,
Worwood 1997).
A determinação do ferro está
sujeita também a uma variação cir-
cadiana, resultante da variação na
liberação do ferro do sistema reti-
culoendotelial para o plasma, em-
bora os resultados na literatura a
esse respeito não sejam conclusi-
vos (Cook et al 1992, Worwood
1997). Estudo recente determinou
as medidas de ferro sérico, TIBC e
ferritina em um grupo de indivídu-
os normais em diferentes períodos
do dia (8 h da manhã, ao meio dia
e 4 h da tarde), conservando um
jejum de pelo menos 2 horas antes
da coleta do sangue. Os autores não
observaram um padrão consisten-
te de variação diária do ferro e TIBC
no grupo estudado e concluem não
haver necessidade de se restringir
a coleta do material a um horário
específico do dia (Dale et al, 2002).
Outra observação importante é o
caráter complementar dessas me-
didas do estado do ferro, ou seja, é
interessante que os resultados se-
jam interpretados em conjunto, ali-
ados sempre aos dados clínicos do
paciente (Cook et al, 1992).
Avaliamos os kits da Synermed
e comparamos os resultados com
os obtidos com os kits da Roche,
já padronizados e em uso na roti-
na do nosso laboratório. Os dois
kits utilizam basicamente o mes-
mo princípio de reação para a de-
terminação do ferro e do TIBC, di-
ferindo no tipo de cromógeno que
se complexa ao ferro ferroso e que
vai produzir reações de diferentes
cores, lidas em diferentes compri-
mentos de onda. Os resultados
mostraram-se plenamente satisfa-
tórios para ambos os métodos em
todos os testes por nós realizados.
Os testes de linearidade e estabi-
lidade no tempo mostraram resul-
tados adequados para as concen-
trações de ferro sérico e TIBC tes-
tadas. Ambos os métodos foram
bastante reprodutivos, revelando
valores de CV < 5%, tanto nos en-
saios intra como interbanho.
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Nos testes de correlação entre
os métodos, as determinações de
TIBC mostraram uma correlação
moderada (r= 0, 79), no grupo de
indivíduos normais, enquanto para
as determinações de ferro sérico
os métodos se correlacionaram
plenamente. Essa pequena discre-
pância nos valores de TIBC obti-
dos com os reagentes Synermed
e Roche provavelmente deve-se
ao a um intervalo de normalidade
mais alargado com o método Sy-
nermed (de 240 a 440 µg/dL),
quando comparado ao método
Roche (de 236 a 380 µg/dL). A
correlação entre os métodos nas
amostras patológicas foi excelen-
te, assegurando a precisão de
ambos os métodos em diagnosti-
car tanto a deficiência como a so-
brecarga de ferro. Como um dos
possíveis interferentes nas deter-
minações do ferro e da TIBC é a
existência de lipemia, analisamos
75 amostras de pacientes com
valores elevados de triglicérides.
A correlação entre os dois mé-
todos foi de 0,97 para as dosagens
de Ferro sérico e TIBC. É descrito
pelos fabricantes dos reagentes a
presença de um detergente (Roche)
e de um surfactante (Synermed) na
solução tampão, responsáveis pela
clarificação das amostras lipêmicas.
Esses dados sugerem que a lipe-
mia parece não interferir nas leitu-
ras das duas reações. Outros pos-
síveis interferentes como presença
de hemólise ou hiperbilirrubinemia
não foram por nós avaliados.
Podemos concluir que os mé-
todos para determinação do ferro
sérico e TIBC da Synermed for-
necem resultados confiáveis, são
de fácil utilização, uma vez que
podem ser automatizados e po-
dem ser usados na rotina dos la-
boratórios de análises.
Agradecimentos
Agradecemos às assessorias
científicas da Synermed do Bra-
sil e da Roche Diagnóstica pelo
interesse no desenvolvimento
dessa avaliação; aos funcionári-
os da Seção de Bioquímica da
Divisão de Patologia Clínica do
HC/UNICAMP pelo auxílio técni-
co e ao José Fernando de Almei-
da Noronha pelo auxílio na análi-
se dos resultados e elaboração
dos gráficos.
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