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MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Extração 
de DNA e RNA
Importância
Uso de DNA para estudos de natureza variada:
• diagnóstico (sensível e específico);
• medicina (estudo do câncer; identificação doenças);
• processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);
• genoma
• investigações de perícia, paternidade...
Uso de RNA para estudos de natureza variada:
• Transcrição Reversa do RNA (cDNA);
• Análises de expressão gênica 
• Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA 
Organismos
bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
A extração e a purificação de ácidos nucléicos é uma etapa fundamental para 
se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em 
cadeia da polimerase (PCR).
Organismos
bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Procariontes (sem núcleo)
• DNA circular;
• DNA plasmidial;
Fator adicional: parede celular
Extração de DNA/RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
• degradação proteínas;
• purificação do DNA/RNA.
Para cada tipo de amostra, 
vários protocolos
podem ser testados, 
adaptados e otimizados, de 
maneira a se conseguir 
DNA de boa qualidade.
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações 
hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações 
hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
micelas
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
A Proteinase K foi 
descoberta em 1974, no 
fungo Tritirachium album;
É capaz de digerir a 
queratina (Keratin), daí o 
nome “Proteinase K”. 
Rapidamente inativa as 
nucleases, que degradam 
o DNA e RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentesDigestão em 
banho-maria com 
temperatura 
próxima a 50°C Proteinase k
O tempo de incubação pode variar. Importante é que a amostra se apresente 
totalmente digerida
Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove 
as partes orgânicas 
Aviso: O fenol é um produto altamente tóxico, irritante para a pele e 
mucosas
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1): eficiente para 
desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade 
hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes 
orgânicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa. 
Clorofórmio: retira resíduos de fenol
Extração de DNA/RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• purificação do DNA/RNA (eliminação de resíduos orgânicos) 
A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a 
formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico. 
Uso de álcool para a precipitação
formação do Pellet
• A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua 
degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente 
resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, 
autoclavagem etc.); 
• DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das 
soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes;
• Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas...
Notas - Extração de RNA
• Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no 
isolamento de RNA total de células e tecidos; 
• DNAse;
• O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas. 
Quantificação DNA/RNA
Espectrofotômetro 
• Qualidade da extração
• Determinação da quantidade de
DNA/RNA extraído
260 e 280 nm 
razão 260/280 = 
nucleotídeos podem ser detectados por espectrofotometria 
a um comprimento de onda de 260 nm 
280 nm para estimar a contaminação com 
proteínas
1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada
Um valor inferior indica contaminação com proteínas e um valor superior indica 
contaminação com RNA.
Conservação da amostra
• Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em álcool 
absoluto imediatamente após a coleta, e trocado após 24h.
• Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com sílica.
• Para todas amostras congeladas em estoque, é preferível o 
fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofra
descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação 
do tecido e para a degradação do DNA.
• O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o 
uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam 
degradados
Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório
tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos
procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte:
a) Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos 
b) Capelas de exaustão.
c) Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura.
d) Microtubos de polipropileno.
e) Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras).
Material Necessário
MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Eletroforese 
Agarose (AGE) e 
Poliacrilamida (PAGE)
• É um método simples e muito eficiente para separar, para identificar e 
para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas. 
• Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua 
carga elétrica e seu peso molecular. 
• Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e 
moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo).
Eletroforese
A migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de 
potencial é chamada de eletroforese.
Existem dois modelos básicos de eletroforese: 
Gel de agarose 
Eletroforese
AGE
+-
Existem dois modelos básicos de eletroforese: 
Gel de agarose 
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-
AGE
+-
Existem dois modelos básicos de eletroforese: 
Gel de agarose 
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-
AGE
+-
Fonte
Eletroforese
Pólo +
Pólo -
Equipamento - Agarose
• Ágar-ágar (ágar ou agarose) 
• É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de 
diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta;
• insolúvel em água fria 
• dissolve em água quente (absorve uma quantidade de água de 
cerca de vinte vezes o seu próprio peso) formando um gel não-
absorvível, não-fermentável e com importante característica de ser 
atóxico. 
• Concentrações de 0,5 – 2,5% 
Diluídos no tampão TBE ou TAE.
(Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)
Fatores que afetam a migração de 
fragmentos de DNA em géis de agarose
•Tamanho do DNA
Diferentes tamanhos de moléculas, diferentes taxas
de migração no gel de agarose
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
Fatores que afetam a migração de 
fragmentos de DNA em géis de agarose
•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
em ≠ formas ou conformação do DNA,
a migração ≠ velocidades
DNA superenrolado mais lento
DNA linear mais rápida
Fatores que afetam a migração de 
fragmentos de DNA em géis de agarose
Equipamento - Agarose
Agarose tampão aquece
Despeja na forma
com o pente
Cuba com Tampão 
TBE ouTAE 
Equipamento 
DNA + marcador migração
(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol) 
marcador de tamanho molecular
(Low mass, High e Ultra 
High...)
(+)
DNA com fragmentos 
de tamanho conhecido
aumentar a densidade da amostra (faz afundar 
no poço)
adicionar cor às amostras
Permite acompanhar a corrida
Equipamento 
DNA + marcador migração
(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol) 
Coloração com brometo de Etídio (EtBr) (0,0001%). 
marcador de tamanho molecular
(Low mass, High e Ultra High...)
(+)
Depois de migrar o suficiente.....
Transiluminador (caixa de luz UV)
aumentar a densidade da amostra (faz afundar 
no poço)
adicionar cor às amostras
Permite acompanhar a corrida
Brometo de Etídio
AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório. 
Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos
Fluorescente na luz ultravioleta
Equipamento - Poliacrilamida
Utilizado tanto para Proteínas quanto para DNA/RNA
Composto por Acrilamida e Bis-Acrilamida
AVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou 
absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.
Concentrações diferentes – quanto mais acrilamida, menores os poros
Proteínas: a carga e a forma devem ser excluídas, com adição de SDS 
(dodecilssulfato de sódio) que possui carga negativa 
– converte proteínas em estrutura linear
Equipamento - Poliacrilamida
Coloração com:
Brometo de Etídio (EtBr), 
prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e 
análise de amostra diluída) 
SYBR Green (menos mutagênico)
Coomassie Blue 
se liga inespecificamente a praticamente 
todas as proteínas. 
É menos sensível que corar com a prata
mas efetivo também, além de ser fácil de 
corar
Fotodocumentação
Transluminador 
Caixa acoplada máquina fotográfica
Computador
AGE X PAGE
É mais difícil de ser preparado e muito 
tóxico quando em pó ou em solução.
menor capacidade de resolução, 
porém apresenta maior extensão 
de separação. Longos 
fragmentos de DNA (50-20.000 
bp)
Fácil preparo, não-tóxico.
tem maior capacidade de resolução e 
é mais efetivo para separar pequenos 
fragmentos de DNA (5-500 bp – pares 
de base). 
podem ser separados fragmentos 
com tamanho de apenas uma base 
de diferença.
também usados para separação de 
proteínas