Controle Microbiológico de Produtos não estéreis

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Controle Microbiológico de Produtos não estéreis
Controle Microbiológico de Produtos não estéreis 
 “Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização".
 Cosméticos, produtos farmacêuticos tópicos e orais 
Contato com áreas portadoras de flora microbiana natural!!!
Atenção no CQ destes produtos deve assegurar que a carga microbiana presente (qualitativo e quantitativo) não comprometa a sua qualidade final ou mesmo a segurança do paciente.
Altas cargas microbianas presentes no produto farmacêutico não estéril podem comprometer:
A segurança do paciente e/ou usuário que não esteja saudável, dependendo ainda das características de utilização de cada produto.
A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua qualidade intrínseca.
A qualidade microbiológica de um produto não estéril é proporcionada pela adoção e respeito às Boas Práticas de Fabricação, sendo necessário e complementar às BPF a adição de conservantes.
Produtos não estéreis BPF CONSERVANTES componente fundamental
Segundo RDC 162/01, é apresentada a definição de conservantes :
“São substâncias adicionadas aos Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes com a finalidade primária de preservá-los de danos e/ou deteriorações causados por microrganismos durante sua fabricação e estocagem, bem como proteger o consumidor de contaminação inadvertida durante o uso do produto”. 
“É permitida a associação de substâncias conservantes obedecidos seus limites individuais”. 
“Em casos especiais, quando houver necessidade de utilizar-se uma concentração que ultrapasse os valores individuais estipulados na lista, a empresa deverá apresentar documentação técnico-científica justificando o seu uso”.
RDC 162 de 2001, estabelece a lista de substâncias de ação conservantes para produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes. 
Sistemas conservantes devem apresentar algumas características para suas substâncias:
Possuir amplo espectro de ação microbiana;
Não mudar as características organolépticas do produto;
Não interagir com componentes da formulação;
Ser estável em ampla faixa de pH;
Devem incluídas nas formulações sob concentração mínima de eficácia e máxima descrita em legislação.
CMI = concentração inibitória mínima (concentração que qualifica, como concentração de eficácia)
Eficácia;
Concentração máxima = Segurança
CQ tem como objetivo imediato – comprovar a ausência de microrganismos patogênicos e determinar o número de microrganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto.
Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido;
Cosméticos em pele sensível – bebê.
Cuidados quanto ao limite microbiano!!!
Risco ao consumidor:
Saprófitas – agentes infectantes oportunistas (deterioração de produtos) – TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!!
Patogênicos - (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) – risco de quadro clínico infeccioso – PROIBITIVO A PRESENÇA!!!
Estabilidade do produto:
Perda da eficácia terapêutica – por degradação do PA:
ou por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade – ex. pH.
ou alteração de propriedades físico-químicas – entre elas: produção de gases – odor desagradável, ação enzimática levando a degradação de tensoativos – quebra da emulsão ou alteração na viscosidade.
PREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃO:
DIRETAS: Fluidos gasosos, água e demais matérias-primas (principalmente origem natural).
INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalações inadequadas, pessoal não paramentado, processos não validados...
 Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada durante o processo de fabricação ou mesmo durante o tempo de prateleira do produto, por diversos fatores:
Fórmula: presença de proteínas e carboidratos (cosméticos) se a concentração não for hiperosmótica – favorece a elevação de CM.
em contrapartida, presença de etanol, sorbitol, sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas, nas concentrações normalmente utilizadas em líquidos.
Conservantes: usados com critério – podem interagir com componentes da fórmula e ter sua atividade reduzida.
pH: microrganismos crescem em pH neutro, com efeitos inibitórios em faixas extremas (ácidas ou alcalinas).
Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microrganismos
Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microrganismos. Portanto os produtos em água dependem de incorporação de conservantes. Recorrer quando possível às fórmulas extemporâneas!!! (uso imediato)
Processo: altas temperaturas reduzem CM, já temperaturas próximas a 40ºC tem efeito oposto. Água de condensação nas paredes de reatores, ou mesmo vapor de água na tampa de frascos durante o resfriamento podem ocasionar a proliferação de microrganismos.
 PADRÕES PRIMÁRIOS
Apesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente. Este fato pode ser observado nas farmacopeias em que os padrões estão sendo incluídos gradativamente.
As monografias farmacopeias nas quais consta especificações para qualidade microbiológica, de forma geral, referem-se à ausência de uma ou mais espécies específicas. Apesar de a carga microbiana total também ser parâmetro de avaliação da qualidade sanitária do produto, o limite para o número de microrganismos viáveis é exigência apenas em algumas especificações.
A Portaria n° 600, de 28 de novembro de 1997, da Secretaria da Vigilância Sanitária, divide os cosméticos em dois grupos, tipo I e II, dependendo do local de aplicação.
O tipo I refere-se a produtos para uso infantil, para área dos olhos e para aqueles que entra em contato com a mucosa. 
O tipo II, para demais produtos susceptíveis à contaminação.
 Tipo I: < que 10² /g de microrganismos totais aeróbicos.
 Ausência de Pseudomonas aeruginoas;
 Staphylococcus aureus;
coliformes totais e fecais em 1g;
 no caso do talco, ausência de Clostrídeos sulfito redutores, também em 1g.
 Tipo II difere em relação ao primeiro apenas no limite de aeróbios totais que é de, < que 103 /g.
Métodos de análises:
Amostragem (coleta, transporte e preparação da amostra).
Determinação numérica ou contagem de formas viáveis.
Isolamento e identificação dos microrganismos indesejáveis para serem pesquisados.
Medicamentos não estéreis e cosméticos!!!
Amostragem
A amostragem a ser efetuada para investigação quanto aos atendimentos aos padrões microbianos deve ser representativa.
Barricas ou sacos de matéria-prima (pó) não estéril: coletar amostras na região inferior, mediana e superior na quantidade de √n Efetuar assepsia na área próxima à coleta de amostras, vedar em recipiente hermético a amostra.
Em processos contínuos, a segmentação do processo deve estar contemplada na amostragem.
Produto acabado – duplicata de amostra representando início, meio e fim do processo de enchimento e que após fechado a embalagem não existirá a introdução de contaminantes.
Coleta e Transporte das amostras
Fazer as amostragens em local limpo;
Operador treinado;
Recipientes, dispositivos auxiliares (espátulas, pipetas) estéreis;
Temperatura adequada para transporte.
Quantidade a ser analisada
- Quantidade depende das análises e re-teste.
Recomendação das principais farmacopeias:
Para enriquecimento na pesquisa de patogênicos: 10 g(mL) do produto em 90 mL da solução tampão pH 7 com inativante do conservante ou em solução salina com inativante do conservante.
Obs. No caso de amostra total ser 10 g (mL) ou inferior, este total deve ser analisado.
A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) em amostras com alto valor agregado.
10 mL do produto +90 mL diluente (tampão) = 100mL
Preparação da amostra
Verificar a presença de conservantes na fórmula.
Os conservantes devem ser inativados – substâncias adequadas de acordo com natureza química.Ex. Sais de amônio quaternário 3% de polissorbato + 0,3% de lecitina.
Ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade.
Homogeneização.
Tratamento da amostra para permitir contato íntimo da amostra com o meio diluente.
 Produtos oleosos – adição de agente tensoativo.
Durante o preparo de amostras de produtos não estéreis para a contagem de microrganismos viáveis não patogênicos, é necessário o contato dessas amostras com diluentes biocompatíveis com as células microbianas.
Alguns possíveis diluentes:
solução de NaCl à 0,9% estéril.
 solução de NaCl à 0,9% e peptonada a 0,1% estéril.
 solução tampão pH 7,0 estéril.
- caldo lactosado estéril.
Exemplo de preparo de amostra para análise microbiológico de um cosmético em diluição decimal seriada:
A diluição 1:10 de uma amostra de cosmético pode ser obtida homogeneizando:
1 g de cosmético + 9 mL de diluente ou 
10 g de cosmético + 90 mL de diluente ou
20 g de cosmético mL de diluente ou
25 g de cosmético mL de diluente, e assim por diante.
Em todos os exemplos acima, a amostra resultante é diluída a 1:10 (10⁻¹), e consequentemente, em cada mL da diluição teremos uma quantidade de amostra correspondente a um décimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.
Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)
Métodos de Contagem de Microrganismos
Análise quantitativa.
Alíquota de 1 a 2 mL da diluição da amostra para réplicas (triplicata) de placas de Petri estéreis.
Meio de cultura não seletivo líquido, estéril, fundido e resfriado a temperatura (45-48°C), cerca de 20 mL é vertido sobre a placa contendo a amostra e homogeneização com movimento em 8 ou S.
 Incubação na posição invertida após solidificação.
Semeadura da amostra em superfície
- Análise quantitativa.
Meio de cultura não seletivo ou seletivo sólido, líquido ou semi-sólido preparado e distribuído previamente em placas de Petri ou tubos.
As diluições são distribuídas por pipetas estéreis, com volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfície do gel já solidificado, e espalha com movimentos cuidadosos com bastão de vidro em L ou alça de Drigalski.
Incubar as placas invertidas.
- Esta metodologia não se aplica a amostras com carga microbiana inferior a 2 UFC/g (mL).
Membrana Filtrante
Análise quantitativa
Alíquotas do produto ou suas diluições – filtradas em membranas apropriadas.
Membranas de 0,45μm ou 0,20 μm de poro e 47 mm de diâmetro.
 Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de cultura solidificado.
Permite amostragem de volumes elevados.
Sterifil aseptic Suporte de filtração a vácuo Sterifil em polissulfona, composto de funil, base e copo coletor.Stericup Unidade filtrante STERICUP com membrana express 0,22mm e PVDF 0,45 um, funil e frasco coletor.Trasnferir a membrana para placa de Petri e incubar
INCUBAÇÃO DAS AMOSTRAS
- Colocar placas em estufa a 30-35° C por 2 a 5 dias na posição invertida, ou estante com tubos, para verificar a presença de bactérias.
Colocar placas em estufa a 20-25° C por 5 a 7 dias na posição invertida, ou estante com tubos, para verificar a presença de fungos e leveduras.
Contagem: à vista desarmada ou com auxílio de contadores. Transcorrido o tempo de incubação, considerar a contagem, somente das placas da mesma diluição que apresentarem de colônias. Multiplica-se a média das mesmas pelo respectivo fator de diluição e se expressa o resultado em UFC/g de amostra.
EXERCÍCIO
Uma amostra de fitoterápico (cavalinha em pó) foi submetido à contagem microbiana pela técnica de semeadura em superfície, onde uma alíquota de 10 g foi pesada e homogeneizada com 90 ml qsp de diluente biocompatível contendo polissorbato. A seguir, foram feitas diluições seriadas na razão de 1:10 até a diluição 10-3 (alíquotas de 1mL em 9mL de diluente). A seguir, cada diluição foi plaqueada em meio de cultura TSA fundido (em triplicata), seguindo-se a incubação das placas inoculadas. Baseado no exposto acima, pergunta-se: Qual foi a quantidade de amostra dispensada na triplicata de placas correspondente à diluição 10-2 ?