Dosagem de Bilirrubina

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Dosagem de Bilirrubina
Introdução
	O heme da hemoglobina é a fonte predominante de bilirrubina originando 85 % da bilirrubina total produzida (normalmente 250 -300 mg de bilirrubina são formadas por dia). Os 15% restantes originam-se do catabolismo de outras proteínas hemínicas, como a mioglobina, citocromos e as peroxidases.
	A bilirrubina é produzida nas células reticuloendoteliais do fígado, baço e medula óssea. Essas células engolfam as hemáceas senescentes, fazendo com que elas sejam lisadas e liberem a hemoglobina para ser catabolizada. 
	A conversão de heme em bilirrubina consiste de duas etapas: 1) a heme oxigenase do retículo endoplasmático converte heme em biliverdina; 2) a biliverdina é convertida a bilirrubina por uma enzima citosólica dependente de NADPH, a biliverdina redutase. Após a sua produção nos tecidos, a bilirrubina é transportada ao fígado conjugada com a albumina. A bilirrubina é captada pelos hepatócitos por transporte ativo e é ligada à proteína Z e à ligandina. Dentro dos hepatócitos, a bilirrubina é conjugada com o ácido glicurônico formando a bilirrubina monoglicuronídeo ou diglicuronídeo, que são a seguir excretadas na bile. Uma vez secretados no intestino delgado proximal, os glicuronídeos de bilirrubina têm uma reabsorção mínima. A seguir, ainda no intestino proximal, os glicuronídeos de bilirrubina são hidrolisados ao pigmento não-conjugado pela β-glucuronidase proveniente do fígado, das células epiteliais intestinais e das bactérias intestinais. A bilirrubina não conjugada é reduzida pela flora bacteriana intestinal para formar estercobilinogênio, mesobilinogênio e urobilinogênio, que são pigmentos sem cor conhecidos coletivamente como urobilinogênios. Cerca de 20% dos urobilinogênios são reabsorvidos pelo fígado através da circulação entero-hepática, sendo que a maior parte é reexcretada na bile e somente 2 a 5% entram na circulação geral e aparecem na urina. No intestino distal, os três urobilinogênios oxidam-se espontaneamente, produzindo os pigmentos estercobilina, mesobilina e urobilina, que são castanho-alaranjados e constituem os pigmentos das fezes. 
	A bilirrubina é um pigmento amarelo, solúvel em lipídeos e em solventes orgânicos, e, por isso pode difundir-se através das membranas celulares. Dentro das células a bilirrubina interfere com muitas reações metabólicas cruciais e a maioria dessas interações não é compreendida até o momento.
	A bilirrubina não conjugada (livre) é também conhecida como bilirrubina de reação indireta. A bilirrubina conjugada (glicuronídeo de bilirrubina) é solúvel em água e é conhecida como bilirrubina direta.
Método
Princípio: A bilirrubina total no soro ou plasma é dosada pela adição inicial do reagente de cafeína (benzoato de cafeína), um acelerador da reação, à amostra. A seguir, adiciona-se ácido sulfanílico diazotado. A bilirrubina conjugada reage diretamente com o ácido sulfanílico diazotado, sem a necessidade de qualquer acelerador, sendo, portanto, chamada de bilirrubina direta. A bilirrubina livre requer um acelerador para reagir, sendo chamada de bilirrubina indireta. Durante o período de incubação, ambas as bilirrubinas, conjugada e não conjugada, reagem com o diazo-reagente para produzir azobilirrubina. Após a adição do ácido sulfanílico diazotado, solução de ácido (ácido ascórbico ou ácido clorídrico) é adicionada à mistura reacional. A azobilirrubina tem absorção a 530 nm. 
	Para dosar a bilirrubina direta (bilirrubina conjugada) não se adiciona o acelerador. 
Amostra: Soro ou plasma não hemolisado, porque com o método diazo a hemoglobina produz valores falsamente baixos de bilirrubina direta e valores erroneamente elevados de bilirrubina total. As amostras devem ser protegidas da exposição direta à luz artificial ou solar, pois ambas as bilirrubinas (conjugada e não conjugada) são fotooxidadas na presença de luz branca ou ultravioleta. A ação da luz pode destruir 50% da bilirrubina da amostra. 
Reativos:
	Revelador: benzoato de cafeína
	Reativo sulfanílico: ácido sulfanílico e ácido clorídrico
	Reativo diazo: reativo sulfanílico com nitrito de sódio
Procedimento:
	Colocar a amostra e os reativos de acordo com o quadro abaixo e nessa sequência:
	
	Branco (B)
	Bilirrubina Direta (D)
	Bilirrubina Total (T)
	1) Amostra (soro)
	200 (L
	200 (L
	200 (L
	2) Água Deionizada
	2,4 mL
	2,4 mL
	-
	3) Reativo Revelador
	-
	-
	2,4 mL
	4) Reativo Sulfanílico
	0,2 mL
	-
	-
	5) Reativo Diazo
	-
	0,2 mL
	0,2 mL
Misturar cada tubo imediatamente após a colocação do Reativo Sulfanílico ou Diazo.
Após 5 minutos exatos ler a absorbância da bilirrubina direta a 530 nm, zerando com água deionizada. As demais leituras podem ser feitas até 15 minutos após a adição do último reativo. 
Cálculo:
1) Subtrair a absorbância do branco das absorbâncias da Bilirrubina Direta (D) e Total (T):
D corrigido = D – B
T corrigido = T – B 
2) 
Bilirrubina Total corrigida = Tcorrigido x f onde f = Concentração do padrão 										Abs. Padrão corrigido
Bilirrubina Direta corrigida = D corrigido x f 
Bilirrubina Indireta = Bilirrubina Total corrigida – Bilirrubina Direta corrigida
Valores de referência (adultos):
Bilirrubina Direta: até 0,2 mg/ dL
Bilirrubina Total: até 1,0 mg/ dL
Resultados e Discussão
	 Algumas doenças hereditárias e adquiridas afetam uma ou mais etapas envolvidas na produção, captação, armazenamento, metabolismo e excreção da bilirrubina. Dependendo do distúrbio, a bilirrubina conjugada (direta) ou não conjugada (indireta), ou ambas, são as principais contribuintes da hiperbilirrubinemia.
	 A hiperbilirrubinemia leva à icterícia, que geralmente fica evidente quando a concentração de bilirrubina ultrapassa 2,0 mg/dL.
	Um resumo dos distúrbios que levam à hiperbilirrubinemia e suas características encontra-se no quadro que se segue:
	Distúrbio
	Causas da hiperbilirrubinemia
	Forma da Bilirrubina no sangue
	Urobilinogênio na urina
	Bile na urina
	Anemias hemolíticas 
Hemorragia interna 
	velocidade aumentada da produção de bilirrubina
	quase toda BR-I*
	aumentado
	ausente
	Síndrome de Gilbert
	defeito na captação de bilirrubina pelo hepatócito
	quase toda BR-I
	diminuído
	ausente
	Síndrome Crigler-Najjar
	deficiência na conjugação da bilirrubina
	quase toda BR-I
	diminuído
	ausente
	Imaturidade hepática do recém-nascido
	deficiência na conjugação da bilirrubina
	quase toda BR-I
	
	ausente
	Hepatite
Cirrose
Cálculo biliar
	deficiência na excreção de bilirrubina (colestase)
	20 – 40% BR-I
60 – 80 % BR-D**
	
diminuído 
	
presente
*BR-I = bilirrubina indireta, ** BR-D = bilirrubina direta
	A hiperbilirrubinemia não conjugada mais comum é aquela vista em recém-nascidos e referida como icterícia fisiológica do recém-nascido. Todos os recém-nascidos têm concentrações séricas de bilirrubina não conjugada maiores do que os valores obtidos na população adulta saudável, e cerca de 50% da população recém-nascida é clinicamente ictérica durante os 5 primeiros dias de vida. No neonato normal a termo, a bilirrubina não conjugada eleva-se durante as primeiras 48 horas, com decréscimo para os valores normais dentro de 7 a 10 dias. Esse aumento temporário é causado por uma produção aumentada de bilirrubina como resultado da hemólise de hemácias e da imaturidade no metabolismo e excreção de bilirrubina. 
	Na anemia hemolítica (destruição prematura de hemácias) leva à hiperbilirrubinemia na ausência de qualquer anormalidade hepática. Outras hiperbilirrubinemias por hemólise excessiva compreendem policitemia, malária, transfusão de sangue incompatível, eritroblastose fetal, envenenamento por cogumelos e por picada de cobra. Nestas situações, a bilirrubina direta pode estar moderadamente aumentada, a menos que haja lesão hepática concomitante.Na síndrome de Crigler-Najjar ocorre uma menor atividade ou ausência da uridina difosfato:bilirrubina glicuroniltransferase. A síndrome de Gilbert é também atribuída à deficiência da mesma enzima, porém pode também ser causada por defeito no transporte da membrana. Como a bilirrubina não pode ser conjugada na velocidade normal nesses distúrbios, a velocidade de excreção é reduzida, e aumenta a concentração de bilirrubina no soro. 
	Na colestase a excreção de bilirrubina está bloqueada. Ambas as bilirrubinas, conjugada e não conjugada, são retidas nesse distúrbio. Quando qualquer trecho da árvore biliar é bloqueado ou a permeabilidade é alterada, a passagem dos componentes da bile para a bile é retardada ou a bile é retida. Com isso, as concentrações plasmáticas de bilirrubina conjugada, colesterol, (-glutamil transpeptidase ((-GT ou GGT), fosfatase alcalina (ALP) e ácidos biliares aumentam para valores anormais. A colestase induzida por medicamentos e hormônios esteróides, hepatite alcoólica, hepatite aguda por vírus são exemplos de doenças que podem causar colestase intra-hepática. Os canalículos e dúctulos biliares são lesados por estes processos patológicos, mas os canais biliares maiores permanecem normais. A obstrução mecânica da árvore biliar pode ocorrer no carcinoma da cabeça do pâncreas, onde há obstrução do canal biliar comum ou da ampla de Vater. 
	A síndrome de Dubbin-Johnson é um distúrbio genético benigno e raro da excreção de bilirrubina. Neste distúrbio, a captação e o armazenamento hepático são normais, porém a excreção de bilirrubina para a bile é muito prejudicada e a forma predominante no plasma é a bilirrubina conjugada. 
Bibliografia
BURTIS, C.A. & ASHWOOD, E.R. Tietz Fundamentos de Química Clínica. 4ª. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998.
LABORLAB. Informações técnicas para dosagem de bilirrubinas pelo método colorimétrico. CAT no. 00700.
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