02 Replicação do DNA

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Replicação do DNA 
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular
Curso: Farmácia
Disciplina: Genética 
Eleonidas Moura Lima
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Transferência da informação genética
DNA
RNA
PROTEÍNA
transcrição
tradução
duplicação
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REPLICAÇÃO DO DNA
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Watson e Crick (1953)
 Modelo da Dupla Hélice
 Sugeria duplicação semi-conservativa
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Hipótese 1
Semi-conservativa
Hipótese 2
Hipótese 3
Conservativa
Dispersiva
Modelos de duplicação do DNA
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Meselson e Stahl (1958)
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Duplicação em procariotos
Para as fitas velhas funcionarem como molde, a dupla hélice precisa ser aberta.
Várias origens ou uma única ?
Cairns, 1963
Em procariotos, existe uma única origem de duplicação
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Sentido da duplicação
Cairns, 1963
Pulsos de timidina H3 antes do término da duplicação : marcação radioativa visualizada nas duas forquilhas de duplicação
A duplicação é bidirecional
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Seqüências de 13 pb
Sítios de ligação da proteína DnaA
Seqüências de 9 pb
Ricas em AT
Origem da replicação : Seqüência específica para ligação de proteínas iniciadoras (promovem abertura da dupla hélice)
Menor gasto de energia para separar as fitas
A sequência da origem é casual ou existe uma sequência consenso ?
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Uma vez que a dupla hélice está aberta, como é feita a síntese da nova fita ?
DNA polimerases
Kornberg (1957) : DNA polimerase I
Requerimentos da DNA pol I para sintetizar nova fita de DNA :
 Desoxinucleotídeos trifosfatados
 Íons Mg2+
 DNA pré-existente, para servir como molde
 Uma extremidade OH-3’ de uma cadeia de DNA pré-existente para realizar a ligação fosfodiéster
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Ligação fosfodiéster
A síntese ocorre sempre no sentido 5’ 3’
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O problema da iniciação
DNA pol I não consegue iniciar a síntese da nova fita – ausência de extremidade OH-3’ livre.
Primase : sintetiza oligonucleotídeo (primer) de RNA, fornecendo a extremidade OH-3’ livre para a DNA pol I
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A DNA pol I possui outras atividades enzimáticas :
 Atividade exonucleásica 5’-3’
 Atividade exonucleásica 3’-5’
Nuclease : degrada ác. nucleico
Exonuclease : cliva extremidades
Endonuclease : cliva ligações internas
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Outras DNA polimerases foram descobertas :
DNA pol II :
 Reparo do DNA
 Atividade polimerase 5’-3’
 Atividade exonuclease 3’ – 5’
DNA pol III :
 Possui várias subunidades
 Atividade polimerase 5’- 3’
 Atividade exonuclease 3’ – 5’
DNA polimerase IV e V – envolvidas em diferentes processos de reparo.
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Processividade : habilidade da enzima de repetir a sua função catalítica sem dissociar-se do seu substrato
Definida pelo no médio de nt incorporados sem que a DNA pol se dissocie do DNA molde
Para a DNA pol :
As DNA pol diferem em processividade
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DNA pol III : a enzima responsável pela replicação em procariotos
Núcleo catalítico mínimo
Liga dois núcleos catalíticos
Mantém a enzima ligada ao DNA
 : polimerase
 : proofreading 
Complexo “clamp-loading”
Subunidade  : aumenta a processividade da DNA pol III
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Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
E. coli – 1 erro a ~ cada 109 bases adicionadas ou a após mil ou 10 mil eventos de replicação
 DNA polimerase tem um sítio ativo que só se fixa quando as bases estão pareadas corretamente 
 DNA polimerase tem capacidade de verificar a fidelidade da replicação na cadeia nascente (proofreading) e corrigir os erros (atividades exonucleásicas)
 Depois da replicação, existe um sistema de reparo que corrige qualquer erro de pareamento de bases
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Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
Pareamento incorreto :
 Geometria diferente
 Não acomoda-se no sítio ativo da DNA pol
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DNA pol I
Sítio ativo da atividade exonucleásica 3’5’ (proofreading)
Sítio ativo da atividade polimerase 
Forma rara da C
Pareia-se com A
C na forma rara volta para a forma normal – pareamento inadequado 
Bloqueio da duplicação
Pareamento errôneo localizado no sítio da atividade exonucleásica
O nucleotídeo mal pareado é removido
DNA pol reassume a atividade polimerase
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A síntese é contínua numa fita e descontínua na outra...
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Síntese dos primers na fita descontínua
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Abertura e desenrolamento do DNA
Topoisomerase
Helicase
SSBs (single strand binding proteins)
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Início da duplicação
Ori C
13 pb
9 pb
Dna A une-se às repetições de 9 pb
Formação de um complexo de Dna A
Fitas se separam na região das repetições de 13 pb
Dna C
Dna B (helicase)
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Início e elongamento
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Duplicação em eucariotos
O ciclo celular
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Genoma humano – ~ 10 mil locais de origem (maior velocidade de replicação)
Várias origens de duplicação
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Tipos de DNA polimerases (Eucariotos)
 POLIMERASE α
 POLIMERASE δ
 POLIMERASE ε
 RPA
 POLIMERASE γ 
 Núcleo 
 Atividade de polimerização e primase
 Sem atividade exonuclease 3’-5’
 Fita descontínua
 Núcleo 
 Atividade de polimerização e exo 3’-5’
 Sem atividade primase
 Núcleo 
 Atividade de exonuclease 3’-5’ (~ DNA Poli I)
 Reparo de lesões provocadas por UV
 Núcleo 
 Atividade semelhante à das SSB de procariotos
 Mitocôndria
 Replicação do genoma mitocondrial
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O aparato de replicação eucarioto
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O problema da duplicação no final da fita do DNA
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A telomerase
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Replicação do DNA
Bons Estudos
 
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular
Curso: Farmácia
Disciplina: Genética 
Eleonidas Moura Lima
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