14 Técnicas de Biologia Molecular SAGE e iRNA

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Técnicas de Biologia Molecular:
CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular
Disciplina: Genética
Eleonidas Moura Lima
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Análise de Microarrays
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CGH (Hibridação Genômica Comparativa)
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CGH (Hibridação Genômica Comparativa)
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TAGS ou ETIQUETAS
Seqüências pequenas 
Exclusivas de um determinado gene
NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES
10 pares de bases
Banco de dados grande e validado
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Velculescu et al, 1995
• TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito
• TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de todos os transcritos da amostra
• Depois, os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento CATG
SAGE
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SAGE
INOVAÇÕES E VANTAGENS
• Análise em série
• Grande escala
• Identificação de um número maior de genes 
• Transcriptoma completo de uma célula
• Custo e tempo menores
• Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)
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Obtenção do mRNA e do cDNA
SAGE: método
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Digestão com a enzima-âncora, NlaIII
SAGE: método
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A amostra é dividida em 2 tubos:
B
SAGE: método
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SAGE: método
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Adaptador
Adaptador
Primer F
Primer R
SAGE: método
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SAGE: método
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SAGE: método
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SAGE: clonagem e seqüenciamento
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• SAGE 2000 : extrai os tags
Separa cada etiqueta
Conta as repetições
Relaciona ao gene correspondente
SAGE: análise
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SAGE: análise
• Tabela com todos os tags encontrados na amostra
• Os tags são associados aos genes correspondentes
• O número de tags para cada gene quantifica a expressão
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SAGE: análise
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SAGE
• Fornece de forma geral todos os genes expressos 
• Permite comparação entre bibliotecas
• vários exemplos
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Técnicas de Biologia Molecular:
CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular
Disciplina: Genética
Eleonidas Moura Lima
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 (1998) – Andrew Fire e Craig Mello (Caernohabditis elegans) – Silenciamento de específicos genes através da intodução de um RNA dupla-fita (dsRNA); 
Histórico 
(PTGS) – Silenciamento Gênico Pos-Transcricional em plantas
Mecanismo natural de defesa a vírus e transposons
Controle do desenvolvimento: mutantes com desenvolvimento anormal
Controle do transcriptoma celular
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Nature (1998) 391:806
WT
Antisense
dsRNA
Controle
Hibridação in situ
C. elegans e o RNA dupla fita(dsRNA) 
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Ingestão ou injeção de RNA dupla fita em C. elegans era mais eficaz utilizando dsRNA para silenciar genes de interesse do que o RNA antisense
O dsRNA como ativador
“Interferência por RNA (RNAi)”
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RNA de interferência
“Processo recentemente descoberto que pode regular a expressão de genes endôgenos”
 RNA de interferencia é uma forma de silenciamento pos transcricional no qual uma fita dupla de RNA induz degradação de um transcrito cuja sequencia é homóloga.
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RNA dupla fita atua como molécula ativadora
RNA dupla fita é processado gerando siRNAs
siRNAs servem de guia para a degradação específica do RNA alvo
RNA alvo é degradado devido à homologia de sequência com o siRNA
Mecanismo de ação do RNAi
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O siRNA atua como guia de reconhecimento
siRNA
21-23 nt
mRNAs celulares
Alta especificidade com o RNA alvo
dsRNA
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Cliva o dsRNA deixando
um fosfato 5’ terminal (siRNA)
Ativação - Dicer
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Dicer 
19-21 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
Endonuclease - RNase do tipo III
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Execução - Complexo RISC
Complexo ribonucleoprotéico composto por siRNA mais diversas outras proteínas incluindo membros da família Argonaute ( atividade dependente de ATP)
(RNA-induced silencing complex)
Endonuclease cliva somente na
região de homologia
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Dicer e RISC 
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Em plantas e C. elegans - Ação da RNA polimerase dependente de RNA (RdRP)
Amplificação - RdPR 
Clivagem
Amplificação
via atividade
da RdRP
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Em plantas e C. elegans - Ação da proteínas transportadoras
Sinalização Sistêmica
Célula a célula e por longa distância
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Sinalização Sistêmica
Waterhouse et al. Nature (2001) 411, 834-842.
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Caracteríticas
Efetivo em baixo número de cópias e altamente específico
Manutenção e persistência
Efeito rápido e eficaz
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Relevâncias da técnica de RNAi
Silenciamento gênico específico
Silenciamento éxon-específico ou alelo-específico
Silenciamento de família multigênica
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Aplicação práticas na área médica
Pode ser utilizado em terapias gênicas;
Genes deletérios altamente expressos (doenças neuro-degenerativas e neoplasias malignas);
Atenuar acúmulo de produto de genes defeituosos (esclerose e Alzheimer)
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Conclusão
Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de bloqueio gênico.
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Técnicas de Biologia Molecular:
CGH, Análise Serial da Expressão Gênica - SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e iRNA
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular
Disciplina: Genética
Eleonidas Moura Lima
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O método de SAGE foi descrito em 1995 por Velculescu e colaboradores e baseias-se em três afirmações:
Fragmentos pequenos de 10 pb, denominados tags, próximos à extremidade 3’ são suficientes para identificar unicamente um gene ou transcrito, sendo que estes tags são depositados em bancos de dados para comparações.
Os tags podem ser ligados uns aos outros, formando fragmentos grandes ou concatâmeros, que facilitam muito a clonagem e sequenciamento dos tags presentes na amostra.
Posteriormente, os tags podem ser separados novamente, porque são intercalados por sítios CATG, e então relacionados aos seus genes correspondentes através da comparação com bancos de dados de tags.
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Como obter estes TAGS?
Com o RNA total é feita a separação do RNA mensageiro através da ligação da
 cauda poli-A a esferas magnéticas acopladas a oligonucleotídeos T, e o RNAm 
é capturado aproximando o tubo de uma bandeja magnética. Este RNAm é 
utilizado como molde para a transcrição reversa e então o DNA complementar 
é obtido. 
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O passo seguinte é digerir o cDNA gerado com a enzima-âncora, NlaIII, e são separados fragmentos que vão desde a cauda poli-A até o primeiro sitio da enzima, CATG. 
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Neste ponto, a amostra é dividida em dois tubos e a cada uma das alíquotas é 
ligados adaptadores diferentes, denominados A e B. Na seqüência destes 
adaptadores está presente o sítio de reconhecimento da segunda enzima a ser 
utilizada e também sítios para primers, para posterior amplificação.
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A próxima etapa é a formação dos tags, utlizando a enzima BsmFI. Esta enzima
De restrição é do tipo IIS, ou seja, tem seu sítio de reconhecimento no 
adaptador, mas só vai cortar o cDNA 14 pares de bases adiante. Estes 14 pb 
são suficientes para a gerar o tag de 10 pb e conservar o sítio da enzima-âncora,
 CATG, na outra extremidade. 
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Em seguida, a amostra que havia sido dividida em dois tubos é novamente 
unida, através do uso de enzima ligase, e o produto formado é o chamado ditag 
de 102 pb, formado pelos adaptadores A e B nas extremidades e por dois tags no
 centro, separados dos adaptadores por sítios CATG. O produto desta ligação é 
amplificado utilizando os primers complementares às seqüências dos 
adaptadores. Após a PCR este produto é purificado.
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Os ditags são submetidos a nova digestão com NlaIII, para retirada dos adaptadores e obtenção do ditag de cerca de 26 pb. Após a digestão, este produto é purificado.
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Através de reação de ligação, os ditags de 26 pb são ligados uns aos outros para formar os concatâmeros. Estes, são fragmentos longos de 200 a 1000 pb contendo os conjuntos de ditags.
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São os concatâmeros que são utilizados para clonagem e sequenciamento.
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Com as sequencias geradas, é feita a extração dos tags através do programa SAGE 2000. Este programa retira os sítios CATG, separa os ditags em tags únicos e gera uma lista que contem todos os tags cncontrados na amostra e também o numero de vezes que cada um deles se repetiu. Além disso, cada tag já é anotado, ou seja, relacionado ao gene ao qual ele corresponde. 
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