AULA_PREPARA+ç+âO DE AMOSTRA PARA AN+üLISE MICROSC+ôPICA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
MATERIAL DE APOIO 
Preparação de amostra para análise microscópica 
Curso: Farmácia Disciplina: Farmacobotânica Prof. Ionaldo J. L. Diniz Basílio 
Data: Ano: 2012.2 
O objetivo desta aula é demonstrar os métodos básicos de preparação de amostras para análise microscópica 
de drogas vegetais. 
Introdução 
A análise microscópica eficaz exige não só uma boa 
compreensão de anatomia vegetal, mas também de 
habilidades no desenvolvimento de secções que permitem a 
observação de elementos estruturais da planta. Esta aula 
descreve os princípios para a escolha e preparação de 
secções de diversas partes da planta. 
Técnicas básicas de amostragem 
O principal objetivo da análise botânico é assegurar a 
identidade, pureza e qualidade da matéria-prima. Isso é 
relativamente fácil quando é realizada com uma única 
amostra. No entanto, é mais difícil do ponto de vista 
comercial quando se trabalha com vários lotes e em grande 
quantidade. Com quantidades tão grandes, não seria possível 
um analista realizar a análise de todo o material. Portanto, 
para analisar as amostras, várias técnicas de amostragem 
específicas são empregadas. Sem a utilização de tais 
técnicas de amostragem, a confiab ilidade analítica é muito 
menor. 
Antes de realizar a amostragem para análise, a totalidade do 
conteúdo deve ser inspecionada visualmente para observar a 
consistência de cor, odor, textura e uniformidade do lote. 
Quando os materiais são comercializados na forma integra é 
relativamente fácil à detecção de adulterantes, tais como a 
presença de outras espécies ou partes de plantas 
inadequadas, sujeira, assim como, sinais de degradação. 
Caso os problemas citados anteriormente sejam confirmados 
devemos desconsiderar a amostragem. 
Isto é mais difícil com material que tenham sido reduzidos 
juntamente com adulterantes, pois na maioria das vezes são 
impossíveis de serem detectados, uma vez que o material 
encontra-se pulverizado. Quando o material é relativamente 
homogêneo, técnicas de amostragem formais podem ser 
aplicadas. 
A obtenção de uma amostra representativa do material a 
granel pode ser feita usando planos de amostragem 
formalizados em farmacopeias (por exemplo, Farmacopeia 
Brasileira, 2010; Farmacopeia Americana – USP, 2004), 
outras fontes autorizadas (por exemplo, Organização 
Mundial de Saúde, 1998). O uso adequado de dispositivos 
de amostragem também pode ser útil (Figura abaixo). Planos 
de amostragem são baseados em fatores como tamanho e 
homogeneidade do lote, características do produto (por 
exemplo, moído ou material inteiro), o nível de risco 
associado potenciais adulterantes e nível de qualidade 
aceitável. 
 A B 
Figuras. (a, b) Exemplos de dispositivos de amostragem utilizados para 
materiais botânicos. 
A maioria dos planos de amostragem utiliza uma fórmula 
para o tamanho da amostra com base no número de 
embalagens de um lote receb ido. Nos casos, em que um 
adulterante de alto risco pode estar presente, mais amostras 
podem ser tomadas (critério do analista). Por outro lado, um 
lote improvável de ser associada à adulteração (por 
exemplo, espécie cultivada com um h istórico comprovado 
de material vegetal autêntica) pode ter uma menor 
amostragem. Segundo a maioria dos planos de amostragem 
formais (USP, OMS, etc), uma amostra de material deve ser 
retirada da parte superior, mediana e inferior de cada 
embalagem a ser amostrada. Estas subamostras são 
comparadas uns com os outros para assegurar a 
uniformidade. 
Uma vez a uniformidade tenha sido estabelecida, as 
amostras devem ser agrupadas em uma amostra global e 
processadas em laboratório de análise, de acordo com o 
esquema abaixo. 
 
 
 
 
 
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Amolecimento amostra 
Depois de uma amostra do material vegetal tem sido 
escolhido para análise, o primeiro passo na preparação do 
material teste é o amolecimento. Materiais frescos e secos 
podem ser examinados microscopicamente. No entanto, a 
maioria dos materiais vegetais comercializados para 
produção de medicamentos fitoterápicos e suplementos 
encontra-se secos. Há algumas exceções, onde materiais 
frescos são utilizados na produção de muitas tinturas 
homeopáticas "mãe". Além disso, o material pode ser 
comercializado na sua forma integra, tornando a avaliação 
macroscópica importante para a determinação da identidade, 
embora a microscopia deva ser aplicada. 
A principal d iferença entre a análise de amostras frescas e 
secas é que a última precisa ser reidratada para o 
amolecimento dos tecidos, enquanto que o material fresco é 
suficientemente flexível e pode ser facilmente seccionado. 
Quando os materiais frescos são preparados para análise 
devemos tomar o cuidado para assegurar que nenhuma 
degradação estrutural da amostra ocorreu devido ao seu 
manuseio ou conservação. Isto pode ser assegurado, através 
de inspeção visual e pelo uso de um estereomicroscópio, 
antes da preparação da amostra. 
A principal forma de amolecimento dos tecidos é pela sua 
preparação em água ou numa solução de água, álcool e 
glicerina, ou por fervura numa solução de cloral hidratado, 
dependendo das estruturas que se deseja analisar. Parte do 
material seco, em especial de espécies ricas em ó leo pode 
ser seccionada sem o amolecimento prévio. 
Um método alternativo e mais eficaz para o amolecimento é 
a colocação de toda a amostra no centro de uma lâmina com 
uma quantidade suficiente de água ou solução de cloral 
hidratado (60%). A lâmina é cuidadosamente e 
repetidamente passada sobre uma chama ou colocado em 
uma chapa aquecedora, levando a solução até a fervura. A 
solução deve ser escolhida de acordo com as es truturas. 
Caso a intenção é examinar uma secção que contenha amido 
ou mucilagem, o amolecimento deve ser realizado com água 
e sem calor. Fragmentos maiores podem ser amolecidos, 
colocando a amostra num tubo de ensaio com cloral 
hidratado até ebulição (Figura abaixo ). 
 A 
 B C 
Figuras. Amolecimento de amostras com hidrato de cloral e fervura. (a) 
Uso de cloral hidratado para o amolecimento da raiz, (b) Secção aquecida 
com uma chama para a limpeza da amostra, (c) Amolecimento de 
fragmentos maiores. 
Secção em Microscopia 
Características anatômicas que são utilizadas para a 
identificação de partes de plantas encontram-se quer na 
superfície ou em os tecidos mais internos. No caso de 
estruturas encontradas na superfície, como é típico de folhas 
delicadas e estruturas florais, suficientemente finas para 
permit ir a passagem de luz, não é necessário o 
seccionamento da amostra. Materiais ricos em compostos 
voláteis que pode ser destruídos quando expostos ao calor, 
tais como mucilagem e amido, que são frequentemente 
visualizados como pós, para o qual o amolecimento e 
seccionamento não são necessários. Para a análise pós, uma 
pequena quantidade da amostra em pó é aplicada a uma 
lâmina e cuidadosamente misturada com a água. A amostra 
pode então ser visualizada. No caso de materiais mais 
espessos, tais como caules, rizomas, raízes, cascas, frutos, 
sementes e algumas folhas, o seccionamento é necessário. 
Três tipos principais de secções são usados em microscopia: 
transversal; longitudinal radial e longitudinal tangencial. As 
secções transversais são tomadas perpendicularmente ao 
eixo longitudinal (maior) da parte da planta utilizada. 
Secções longitudinais radiais são realizadas paralelamente 
ao eixolongitudinal da planta na sua parte mediana. Seções 
tangenciais são também tidas em paralelo ao longo eixo da 
amostra, como no caso anterior, mas na região periférica em 
relação a linha central (ao longo de um tangente), 
exemplificado abaixo . 
 
 
Figuras . Três tipos principais de secções são usados em 
microscopia: (a) transversal; (b) longitudinal radial, (c) 
longitudinal tangencial. 
 
A B C 
 
 
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Cada tipo de secção oferece ao analista uma visão diferente 
do arranjo dos tecidos vegetais. Após a secção, a maioria 
dos materiais requerem limpeza de p igmentos e conteúdos 
celulares (por exemplo, a clorofila) com uma solução de 
cloral hidratado ou hipoclorito de sódio, a fim de facilitar a 
visualização das estruturas. Alguns materiais também 
requerem o uso de corantes específicos ou reagentes para 
serem v isualizados. 
Visualização da superfície. No caso do órgão ser fino o 
suficiente para a passagem de luz, após a sua preparação 
com a solução de cloral hidratado, a amostra pode ser 
montada diretamente com a solução supracitada sobre uma 
lâmina de vidro e coberta por uma lamínula; posteriormente 
a solução é aquecida até fervura. Características diferentes 
podem estar presentes em ambos os lados do órgão, sendo 
importante a visualização de ambas . 
Secção paradérmica: Essa forma de secção é 
predominantemente utilizada para visualizar caracteres da 
superfície de folhas, frutos e sementes que se apresentam 
espessa. A maioria das folhas e flores é suficientemente fina 
e podem ser vistos de forma adequada, sem maiores 
preparações da amostra. Algumas espécies, como Eucalipto 
(Eucalyptus globulus) e Senna (Senna alexandrina), têm 
folhas mais espessas, coriáceas (consistência de couro) e, 
portanto, são visualizadas com maior nitidez, após 
preparação de secções paradérmicas (Figura abaixo ). 
 A 
 B 
Figuras. Vistas de superfície de folhas de Senna alexandrina com e sem 
secção. (a) vista da superfície sem seccionamento; (b) vista de superfície 
com seccionada. 
Secções paradérmicas de fo lhas podem ser preparadas 
dobrando-se uma parte da amostra em torno da ponta do 
dedo indicador ou um objeto redondo, como um lápis ou 
caneta, e prendendo-o com o polegar e o dedo médio, com o 
auxilio de uma lâmina de barbear. Assim, a epiderme é 
cuidadosamente seccionada, com o cuidado para não cortar 
o dedo (figura abaixo). 
 A B 
 C D 
Figuras. Preparação de seções paradérmicas. 
Secção a mão-livre 
Materiais mais delicados que são difíceis de manusear 
requerem uma montagem e às vezes auxílio de 
estereomicroscópio que permite ao microscopista produzir 
secções suficientemente uniformes, que são extremamente 
importantes para a visualização de caracteres anatômicos 
(figura abaixo). 
 A 
Figura. Secção a mão-livre com auxílio de estereomicroscópio. 
 
 
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Corte usando um suporte 
O segundo método para a preparação de lâminas é pelo uso 
de um material de fixação ou suporte, como isopor para 
segurar o material vegetal e permitir a obtenção de secções 
finas e uniformes. 
Historicamente, materiais como o pecíolo de Embaúba 
(Cecropia sp.) ou de girassol (Helianthus sp.) foram 
utilizados como suportes para corte de folhas e flores 
delicadas. Hoje em dia, a montagem pode ser realizada com 
pedaços de poliestireno (figura abaixo). 
 A B 
 C D 
Figuras. Preparação da amostra utilizando como suporte um pedaço de 
isopor (poliestireno). (a) Prepara-se uma montagem de poliestireno tal 
como ilustrado. O corte vertical deve ser central e ângulo reto em relação ao 
plano superior; (b) o corte vertical deve ser estreito e suficientemente 
profundo para abrigar o material a ser seccionado; (c) a amostra deve ser 
colocada na região do corte citada anteriormente, paralelamente ao eixo 
maior do suporte, a fim de obter secções transversais de qualidade; (d) 
inserção do material de forma incorreta, com ângulo inadequado. 
 
Identi ficação microscópica de matéria-prima 
comercializada em pó 
Procedimento geral 
1. Colocar 1-2 gotas de água, ou glicerol-etanol (1:1), 
solução hidroalcoólica, hidrato de cloral ou hipoclorito de 
sódio 2 %. 
Obs.: Outros corantes ou reagentes histoquímicos podem ser 
utilizados. 
2. Acrescentar um pouco do pó e misturar com uma 
agulha histológica. 
3. Cobrir a lamínula e observar ao microscópio. 
Solução de cloral hidratado 
No exame microscópico de matérias vegetais, as 
características mais utilizadas no diagnóstico são os tipos de 
células específicas e de cristais de oxalato de cálcio, e estes 
são melhores observados quando montadas em cloral 
hidratado. No entanto, a limpeza do material é indispensável 
para a preparação, permitindo que a solução de cloral 
hidratado penetre nos tecidos e remova as bolhas de ar 
aprisionadas. 
Procedimento: 
1. Adicionar duas ou três gotas da solução no material 
em uma lâmina e cobrir com uma lamínula; 
2. Passar o material montado com muito cuidado em 
uma chama baixa, em movimento de vaivém (o uso de um 
micro aquecedor é recomendado). Logo que começarem a 
aparecer bolhas, pare o aquecimento e, se necessário, 
adicione mais solução sob a lamínula; 
3. Se o material contém quantidades consideráveis de 
amido ou mucilagem, provavelmente será necessário repetir 
várias vezes o aquecimento. 
Obs.: É importante que se garanta a presença de líquido 
suficiente para impedir a secagem da preparação. 
4. Quando obtiver uma preparação satisfatória, 
levante a lamínula e acrescente uma ou duas gotas de cloral 
hidratado com glicerina para inib ir a formação de cristais de 
cloral hidratado, em análises posteriores. 
Obs.: O processo de clareamento remove os grânulos de 
amido e todas as inclusões celulares solúvel em água. 
 
Etanol e água 
Para determina a presença de grânulos de amido de um 
material em pó, monte a lâmina da seguinte forma. 
Procedimento: 
1. Acrescentar uma ou duas gotas de álcool; 
2. Misturar até que o material fique bem diluído; 
3. Adicionar uma ou duas gotas de água, e aplicar a 
lamínula; 
4. Para confirmar a identidade dos grânulos, adicionar 
uma gota de solução de iodo sob a lamínula, e observar. 
5. A coloração azul-enegrecida indica resultado 
positivo. 
Obs.: Caso o material a ser analisado contenha uma elevada 
quantidade de óleo (material pulverizado de frutos e 
sementes), a lâmina pode ficar embaçada após a adição de 
água, o que tornará a análise insatisfatória. Por isso, o óleo 
deve ser removido de tais materiais utilizando-se um 
solvente adequado (éter ou clorofórmio), antes da analisar 
dos grânulos de amido. 
 
Floroglucinol e ácido clorídrico 
Para determinar células e tecidos lignificados. 
Procedimento: 
1. Acrescentar uma ou duas gotas de solução de 
floroglucinol, e misturar; 
 
 
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2. Permitir que o solvente evapore, até próximo a 
secura; 
3. Adicionar uma ou duas gotas de ácido clorídrico e 
aplicar uma lamínula; 
4. Examinar imediatamente; 
5. A coloração vermelha indica a presença de lignina. 
Obs.: A reação é semi-quantitativa, ou seja, quanto mais 
intensa for à coloração, mais a célula ou tecido é lignificado, 
dando uma cor vermelho escuro para células e tecidos 
bastante lignificados e rosa pálido quando menos 
lignificados. O material perde a coloraçãogradualmente. 
Obs.: Assim como no exame dos grânulos de amido, acima 
descrito, quando o ácido clorídrico é adicionado após a 
solução alcoólica de floroglucinol, manchas pode ocorrer se 
grande quantidade de óleo estiver presente na amostra, 
sendo necessária a remoção do óleo.