AULA Eletroforese

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Métodos 
De Separação e 
Caracterização de 
Macromoléculas 
 Métodos Instrumentais 
em Biotecnologia 
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Método de separação por Eletroforese 
 
Histórico: 
• Técnica Desenvolvida nos anos 30: Arne Tiselius, 
 Prêmio Nobel em Química, 1948. 
Separação de proteínas do soro humano. 
 
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ELETROFORESE 
APLICAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE 
MACROMOLÉCULAS CARREGADAS EM ALGUM TIPO DE MATRIZ 
QUE CONFERE ESTABILIDADE E PROMOVE A SEPARAÇÃO 
COM BASE NO TAMANHO E CARGA DA MOLÉCULA. 
3 
Lucas
Realce
Fa 
Separação por ELETROFORESE 
Princípio Geral: Transporte de partículas através de 
um campo elétrico (E) gerado por uma diferença de 
potencial (V). 
Fa: força de atrito 
FE: força elétrica 
Dentre as forças que atuam sobre as moléculas, estará a força elétrica 
e a força de atrito. 
4 
Lucas
Realce
Movimento de ânions e cátions em um campo 
elétrico 
5 
Depende: 
- Do tamanho e formato da molécula; 
- Viscosidade do meio; 
 
Velocidade de separação 
É diretamente proporcional à carga da molécula e 
 inversamente proporcional ao tamanho e formato da molécula. 
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Força de atrito 
Fatores que afetam a separação 
eletroforética 
• Forma e tamanho das moléculas; 
• Tampão (concentração iônica; pH); 
• Matriz de separação; 
• Força elétrica aplicada; 
• Temperatura. 
 
 
7 
Aplicações da técnica de eletroforese: 
• Separação de moléculas carregadas de interesse em 
biotecnologia, biologia , bioquímica e química clínica; 
- proteínas (enzimas, hormônios, anticorpos) 
 - Ácidos nucléicos (DNA, RNA). 
 
• Determinação do peso molecular de moléculas; 
 
• Determinação do grau de pureza de amostras. 
 
 
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Equipamentos utilizados em eletroforese 
9 
Cubas 
Fonte 
horizontal 
vertical 
10 
Sistema de Eletroforese horizontal 
11 
Sistema de Eletroforese Vertical 
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1-molécula pequena, mas bem carregada; 
2- moléculas grandes e bem carregadas 
3- molécula pequena com carga pequena. 
 Relação carga/massa x velocidade de 
separação 
13 
V
el
o
ci
d
ad
e 
d
e
 s
e
p
ar
aç
ão
 
Concentração do gel 
Eletroforeses em matrizes sólidas 
• Matriz utilizada: Depende do tipo de 
molécula e do tipo de separação: 
por carga elétrica, peso molecular, ou ambos 
 
• Tipos de matriz: 
- géis de poliacrilamida (proteínas); 
- Agarose (DNA, RNA); 
- Celulose; 
- Amido; 
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Principais matrizes utilizadas em eletroforese 
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A DENSIDADE DA MATRIZ AFETA A SEPARAÇÃO 
DAS MOLÉCULAS 
 
> DENSIDADE > SEPARAÇÃO 
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Gel de agarose 
Gel de poliacrilamida 
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 
“PAGE” 
 
• Separação de proteínas ou ácidos nucléicos a 
partir de uma mistura de moléculas, em gel de 
poliacrilamida. 
 
• Em cuba vertical; 
 
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Polimerização de um gel de poliacrilamida 
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A razão acrilamida/ bis- 
Acrilamida interfere no 
Tamanho dos poros do gel. 
Visualização dos poros de um gel de poliacrilamida 
por microscopia eletrônca. 
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APARATO TÍPICO PARA 
REALIZAÇÃO DE “PAGE” 
(SDS-PAGE): Eletroforese em Gel de 
SDS 
SDS-PolyacrilAmide Gel Electrophoresis. 
 
 
 
 
 
 
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Uso: 
 
- Análise de proteínas; 
- Determinação da Mr e pureza da amostra. 
Ação do SDS sobre as proteínas 
1. Confere carga negativa ligando-se 
igualmente a todos os aminoácidos. 
 
2. Formam-se moléculas lineares – resultante 
da sua ligação à interações hidrofóbicas das 
proteínas. 
 
23 
Lucas
Realce
Lucas
Realce
3. Desenovela as proteínas. 
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Calor + SDS 
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Emulsificação de proteínas pelo SDS 
SDS LIGA-SE IGUALMENTE EM TODAS AS PROTEÍNAS NUMA 
RELAÇÃO 1 SDS/2 RESÍDUOS DE aa. 
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( aquecimento) 
AÇÃO DE AGENTES REDUTORES AUXILIA NO DESENOVELAMENTO 
DA ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS 
• Exemplos de Agentes Redutores (rompimento 
das ligaçãos dissulfetos S-S). 
 
- 2-mercaptoetanol ; 
- DTT (di-tiotreitol) é o mais utilizado. 
 
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REDUÇÃO DE DISSULFETOS PELO DTT 
Lucas
Realce
Lucas
Realce
Eletroforese de proteínas 
• Estima o peso molecular da cadeia polipeptídica: 
Passos: 
1- desnaturação: 
Aquecimento em solução com detergentes (Ex.: SDS); 
Causa rompimento das estruturas 2ª, 3ª e 4ª. 
 
Adição de agente redutor (DTT, β-mercaptoetanol); 
Redução de pontes dissulfeto. 
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Lucas
Realce
ETAPAS... 
• O gel é colocado entre duas placas de vidro 
contendo tampão; 
• A solução com macromoléculas é colocada no 
topo do gel; 
• Aplica-se a voltagem, iniciando a migração das 
moléculas através do gel com adição de um 
corante para marcação de mobilidade. 
• v í d e o !! 
 
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Análise de subunidades protéicas por eletroforese em 
SDS/gel 
• SDS dissocia subunidades protéicas; 
desfazendo ligações não covalentes 
(hidrofóbicas) 
 
Pode revelar detalhes sobre diferentes 
subunidades da proteína. 
 
Esta técnica não é interessante para estudo do peso 
molecular de proteínas nativas. 
 
 
30 
Cuidados na estimativa do peso molecular por 
eletroforese 
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Algumas proteínas não perdem sua carga intrínseca, 
por ter pouca interação com SDS. 
 
 
ERROS NA ESTIMATIVA DO PESO MOLECULAR 
 
 
Ex.: Histona H1 (PM 21 kDa), aparece no peso 30 kDa 
(carga intrínseca muito positiva) 
• Ex.: eletroforese de histonas 
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nucleossomas 
Forte 
carga (+) 
Erros na estimativa 
do PM 
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Proteína de 100kDa 
20kDa 
60kDa 1 subunidade de 60 kDa 
2 subunidade de 20 kDa 
Se após adicionar agente redutor tivermos a seguinte situação: 
2 subunidade de 30 kDa 
2 subunidade de 20 kDa 
20kDa 
30kDa 
Uso da eletroforese para determinação do nº de 
subunidades de uma proteínas 
Podemos inferir que a subunidade de 60 kDa era de 
fato um dímero ligado por pontes dissulfeto!!!!!! 
Padrão de Peso Molecular: solução composta por proteínas de 
diferentes pesos moleculares, podem ser fluorescentes ou 
coloridos. 
- Utilizado como um padrão na determinação do PM de uma 
proteína. 
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Modelos de padrão de peso molecular