prep e preserv amostras biológicas

Prévia do material em texto

MÉTODOS INSTRUMENTAIS EM BIOTECNOLOGIA 
Metodologia aplicadas à preparação de amostras 
biológicas 
• Centrifugação; 
• Liofilização; 
• Criopreservação. 
Centrifugação 
• Princípios da centrifugação; 
• Características de uma centrífuga; 
• Cálculo da velocidade de centrifugação; 
• Principais tipos de centrífugas; 
• Principais técnicas de centrifugação; 
• Uso correto da centrífuga; 
• Aplicações. 
 
 
 
 
 
Princípios da centrifugação 
• Conceito: processo mecânico de separação de 
partículas em uma mistura pela aplicação da 
força centrífuga. 
 
• A força centrífuga relativa (Rcf) cuja unidade é 
o g é gerada quando uma partícula ou 
conjunto de partículas é sujeito a um 
movimento circular de aceleração. 
 
Lucas
Realce
p 
G 
r 
G: força centrífuga; 
P: partícula; 
r: distância de P em 
Relação ao eixo de 
Rotação. 
Força centrífuga: 
 
G = w2 x r 
 
w = velocidade angular; 
r = raio. 
Princípios da centrifugação 
A velocidade das centrífugas pode também 
ser expressa em RPM (revoluções por minuto): 
 
Utiliza-se a fórmula a a seguir para calcular a 
velocidade de uma centrífuga: 
 
 
 
 
RCF(g) = 1,12 X 10-5 X (RPM)2. r 
Lucas
Realce
Ou utilizando o nomograma: 
Sedimentação 
 x 
centrifugação 
Sedimentação 
Centrifugação 
t 
t1 
t>>>>t1 
Esquema de sedimentação e centrifugação de partículas 
• A velocidade G (RCF) influencia a velocidade 
de sedimentação (v) da partícula, ou seja com 
que rapidez a mesma se movimenta ao longo 
do líquido, esta depende de fatores como: 
- Tamanho da partícula; 
- Densidade; 
- Força de atrito; 
- Densidade do solvente. 
 
Princípios da centrifugação 
Lucas
Realce
O atrito é maior para moléculas 
assimétricas (DNA, RNA, proteínas 
fibrosas) que para moléculas esféricas 
com a mesma Mr (proteínas 
globulares) 
• Coeficiente de sedimentação: parte da relação 
entre estes fatores, sendo representado por 
“s”: 
S = v/w2 . r 
(unidade: s de segundos) 
Moléculas biólogicas variam de 1x10-13 a muitos 
milhares x 10-13 
Princípios da centrifugação 
Coeficiente de 
sedimentação de 
algumas moléculas 
Biológicas: 
 
Valor x 10-13 s 
 
 
 
 
MAIORES 
PARTÍCULAS, MAIOR 
COEFICIENTE DE 
SEDIMENTAÇÃO 
 
 
 
 
Centrífuga 
É o equipamento que realiza a centrifugação. 
Gera força centrífuga girando as amostra em 
torno de seu eixo central; 
 
 
 
Camera 
blindada 
Bomba 
de vácuo 
Sistema de 
resfriamento 
tubos 
blindagem 
Eixo de 
transmissão 
Rotor 
-Horizontal 
(oscilante); 
-Ângulo fixo. 
 
motor 
Eixo vertical 
Carcaça 
tampa 
sustentadores 
Centrífuga de bancada 
Tipos de centrífuga 
• De bancada (3000-7000 g ou RCF); 
• Microcentrífuga (até 12000 g); 
• Centrífuga Refrigerada de Alta Velocidade 
(até 100000g); 
• Ultracentrífuga (até 800000 g). 
 
 
 
Tipos de centrífuga 
Centrífugas de bancada: 
 
4.000 – 10.000 rpm 
3.000 – 7.000 g 
Uso: 
 materiais de rápida sedimentação: 
 
- eritrócitos; 
- Leveduras; 
- Proteínas. 
Microcentrífugas 
• 12.000-15.000 rpm 
• RCF: 12.000 g 
 
Uso: 
- Pequenos volumes de 
células; 
- Isolar mili e microgramas de 
RNA e DNA. 
Centrífuga Refrigerada de Alta Velocidade 
 -20°C / 40°C; 
 Força g: 100.000 
 rpm: 28.000 
 Separação de organelas em 
homogenatos de tecidos; 
 Virus/bacterias; 
 Células animais e vegetais; 
 
Ultracentrífuga 
Uso: 
Sedimentação de macromoléculas, 
ribossomos, vírus... 
 
 Até 100.000rpm - 800000rcf (g) 
 Chão ou bancada 
 Programável 
 Sempre refrigerada 
 Câmara fechada à vácuo (atrito 
com ar eleva temperatura 
 e diminui velocidade) 
Tipos de rotores 
• Suporte Oscilante; 
 
• Ângulo fixo; 
 
 
• Vertical. 
 
Lucas
Realce
Classes de centrífuga e suas aplicações. 
Tipos de centrifugação 
Centrifugação Diferencial (fases) 
• Resulta em sobrenadante e fração do pélete; 
• A amostra é isolada pela v de sedimentação; 
• Partículas maiores sedimentam mais rápido. 
 
 
 
 
Ex.: separação do sangue 
em elementos figurados e 
plasma. 
Lucas
Realce
Centrifugação em gradiente de densidade 
 
Envolve: 
• Preparação de um gradiente de densidade; 
• Processo manual (iniciando com mais denso); 
 
Material usado: 
 
Sacarose: separação de organelas; 
Ficoll: Isolamento de células; 
Percoll: Organelas e células; 
CsCl: separações de DNA. 
 
Centrifugação em gradiente de densidade 
Tipo Zonal 
 
• A separação se vale do tamanho e massa da partícula ao 
invés da densidade. 
 
• Partículas com densidade maior do que o gradiente de 
separação. 
 
• Cada componente cria sua própria zona de 
sedimentação. 
 
 
• Controlar o tempo de centrifugação!!! 
 
Lucas
Realce
Fc 
amostra 
Ex.: separação de subunidades ribossomais em gradiente de 
 sacarose 15 a 40 %.; 
Separação de anticorpos que possuem densidades similares, 
 porém massas diferentes. 
Centrifugação em gradiente de densidade 
Tipo Isopícnica: 
Separação de partículas com densidade menor que a do 
gradiente de separação. 
 
Exemplos: 
-Separação de mitocôn- 
drias em gradiente de 
Sacarose. 
 
 
 
 
 
 
Lucas
Realce
Ex.: separação de linfócitos em gradiente de Ficoll. 
As frações isoladas podem, posteriormente, ser 
submetidas a uma gama diversificada de análises 
bioquímicas, para se identificar a composição química, 
a atividade enzimática, bem como as capacidades 
metabólicas ou então serem encaminhadas para 
observação em microscopia eletrônica. 
Isolamento de uma fração obtida de cérebro de abelha 
 Apis mellifera utilizando 
Gradiente de percoll 
 miosina V e VI 
Como centrifugar 
Utilizar tubos apropriados à velocidade da 
centrífuga. 
Exs.: 
Microcentrífugas: eppendorfs (0,5-2 mL); 
Centrífuga clínica: tubos de vidro; 
Ultracentrífuga: nitrocelulose, polialômero. 
 
Lucas
Realce
polipropileno 
polipropileno 
policarbonato 
Cuidado na escolha dos tubos 
Amostra aquosa ou orgânica? 
Aquosa: plásticos ou vidros; 
Orgânica (fenol): vidro. 
A temperatura pode afetar a integridade dos 
tubos. 
Cuidados acima de 5000 g!!! 
 
USO CORRETO DA CENTRÍFUGA 
Lucas
Realce
 Verificar a necessidade de refrigeração. 
Ex.: amostras biológicas: 4°C 
Equilibre os tubos; 
Coloque a cobertura do rotor; 
Programe a centrífuga; 
Feita a centrifugação, remova os tubos 
vagarosamente; 
Limpeza do equipamento. 
 
 
Como centrifugar 
Lucas
Realce
 Conheça as limitações de velocidade da 
centrífuga e dos rotores; 
 Equilibre todos os tubos com seus suportes, 
tampas, proteção e pinos; 
 Se usar um tubo para equilibrar, encher com 
material similar; 
 Preencha os tubos até 1 ou 2 cm da borda; 
 Tubos íntegros ( sem rachaduras) 
 
 
Como centrifugar 
Lucas
Realce
Lucas
Realce
Cuidados na utilização de centrífugas 
 Cuidados com os tipos de amostras. 
 Ex.: material radioativo, infeccioso; 
 Equilibre todos os tubos; 
 
 
 Limpeza; 
 
 Preencha os tubos 1 a 2 cm da borda; 
 
 Remova as amostras da centrífuga imediatamente 
findada a centrifugação. 
 
Lucas
Realce
EXERCÍCIOS 
1. Calcule a RCF para uma partícula distante 8 cm do centro de 
rotação quando centrifugada a 3.500 rpm. 
 
 
2. A técnica de micro hematócrito, recomenda centrifugar75 μl 
de sangue incoagulável em tubo capilar, entre 5 e 10 
minutos a 160 g em microcentrífuga. Podemos aplicar a 
fórmula para achar o valor correspondente a rotações por 
minuto (rpm), partindo do princípio de que a centrífuga só 
apresente escala para rpm. Supondo que o raio da minha 
centrífuga seja de 15 cm, teríamos? 
 
 
2.Qual a força (peso aparente) de um rotor de 
peso 13,5 kg em toneladas, quando 
centrifugado a 150.000 g? (F=m x a) (a= m/s2 ) 
 
3. Calcule a RCF para uma partícula distante 8 
cm do centro de rotação quando centrifugada a 
3.500 rpm. 
 
 
 
 
3. Relacione qual a melhor centrífuga para cada uma 
das técnicas a seguir: 
 
(1) Microcentrífuga 
(2) Ultracentrífuga 
(3) Centrífuga de bancada 
(4) Centrífuga refrigerada de alta velocidade 
 
( ) Isolamento de células bacterianas em meio líquido; 
( ) Obtenção de pequeno precipitado de moléculas de DNA; 
( ) Isolamento de mitocôndrias de um homogenado de tecidos; 
( ) Isolar partículas do vírus da poliomelite (diâmetro de 28 nm). 
4. Em relação a moléculas enzimáticas e de DNA 
de Mr comparável, qual tem o maior coeficiente 
de sedimentação e a maior força de atrito: 
 
5. Diferencie os métodos de separação por 
centrifugação: 
 
6. Como podem ser o rotores?