Aula_12_-_Rea_o_em_cadeia_da_polimerase

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Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 
Gene pode ser “clonado” quando já sequenciado
sem ajuda biblioteca
PCR - reação de polimerização em cadeia
- reação em cadeia da polimerase
PCR: Método de produzir cópias de DNA in vitro em quantidades 
que aumentam por progressão geométrica por ciclos repetidos de 
alternância de temperatura usando elementos básicos do processo 
celular de replicação do DNA.
AmplificaAmplificaçção seletiva de um segmento de DNA ou RNAão seletiva de um segmento de DNA ou RNA
A Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) ... 
O que ela é?
- A PCR é uma poderosa técnica de amplificação in vitro de seqüências 
específicas de DNA e/ou cDNA.
- Permite a produção de milhões de cópias de uma determinada seqüência 
de DNA/ cDNA em aproximadamente 2 horas.
• A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a 
amplificação in vitro de segmentos de DNA e/ou cDNA sem utilizar um 
organismo vivo, como E. coli ou leveduras.
• Permite que uma pequena quantidade de DNA (até 10kb) seja 
amplificada muitas vezes, de uma forma exponencial.
PCR - reação de polimerização em cadeia
PCR - reação de polimerização em cadeia
• Método para produzir cópias de uma segmento de DNA específico
Um sistema de clonagem “ in vitro”
• Polimerização de DNA em cadeia
• Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável
• São utilizados dois “primers” (iniciadores) - Isso delimita o 
segmento amplificado e determina o crescimento exponencial do 
número de moléculas de DNA
PCR - reação de polimerização em cadeia
� região do DNA já clonada e seqüenciada
� amplificação de seqüência selecionada de DNA sem 
clonagem
� PCR: aplicada apenas quando a seqüência de nucleotídeos de 
pelo menos um pequeno segmento de DNA flanqueando a 
região de interesse é conhecido
PCR - reação de polimerização em cadeia
Antes da técnica, um pouco de história...
• Inventado por Kary Mullis em 1985 (e prêmio 
Nobel da Química em 1993).
• Técnica patenteada em 1989
por Cetus Corporation &
Hoffman-LaRoche.
Histórico
•1983- Kary Mullis- Prêmio Nobel de Química em 1993.
•DNA polimerase- ocorre naturalmente em organismos vivos, 
onde tem a função de duplicar o DNA durante a divisão celular. 
A polimerase se liga a um DNA fita simples criando uma fita de 
DNA complementar.
•Na época ainda não havia sido descoberta uma DNA polimerase
termoestável. Processo inicial de Mullis era ineficiente, 
necessitava de muito tempo, atenção constante e grandes 
quantidades de DNA polimerase.
Antes da técnica, um pouco de história...
•Mais tarde, o processo foi melhorado com a descoberta de uma 
DNA polimerase isolada de uma bactéria termofílica que cresce 
em geisers a uma temperatura maior que 110o C.
•Processo tornou-se simplificado e automatizado.
•Thermus aquaticus - Taq
•Desvantagens da Taq polimerase- não possui atividade de 
correção de erros (exonuclease 3’ 5’)
Antes da técnica, um pouco de história...
Mas, ele realmente inventou a PCR ???
- O princípio básico de replicação in vitro de um fragmento de 
DNA já tinha sido descrito em 1971 pelo grupo de Gobind Khorana: 
J. Mol Biol. 56, 3341-346.
- Mullis, na verdade, explorou e melhorou a técnica de 
amplificação....
- Primeira publicação com aplicação prática desta técnica ocorreu 
em 1985:
Saiki et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences
and restriction site analysis for the diagnostic of sickle-cell anemia. 
Science 230:1350-54
Sensibilidade
A técnica de PCR é extremamente 
sensível, podendo detectar a presença de 
1 única cópia de DNA alvo na amostra!
1. “primers”
2. DNA molde
3. DNA Polimerase
4. Nucleotídeos
5. Tampão
A
C
A
G
TG
T
C
A
H2O, Mg2+
T
O que é necessário para a replicação do DNA?
A reação da PCR
O que é necessário?
Em solução tampão de PCR, H2O ultra-filtrada (pH 7,0) e óleo mineral
dCTP
dGTP
dTTP
Mg2+
dATP
DNA polimerase
Primer
(sequências iniciadoras 
específicas)
dNTPs
A reação de PCR
Materiais necessários: 
Termociclador
Microtubos
A reação de PCR
A reação de PCR
Mecanismo da reação: 
Divide-se em 3 etapas principais, que se repetem por 
25 a 35 ciclos:
- Denaturação;
- Hibridação;
- Extensão.
Ciclos de temperatura
1. Desnaturação
94-96oC / 30s-2 min
2. Pareamento ou Anelamento ou Hibridização
45-65oC / ≈ 30 s
3. Polimerização ou Extensão
72oC / até 1 min
A reação de PCR
Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por 
meio da elevação da temperatura.
• As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários 
minutos: rompimento das pontes de H
• tempo de denaturação depende da complexidade do DNA 
usado como ‘template’ (molde) (30 sec a 5 min)
1- Denaturação do DNA
A reação de PCR
• Os primers hibridam com as sequências complementares do molde 
(template).
• A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns minutos.
• Tempo para “annealing”: 30 sec a 1 min
2- Anelamento dos iniciadores
“Resfriamento” a poucos graus favorece o estabelecimento de pontes de 
H entre os primers e os curtos trechos da molécula de DNA que lhe são
complementares
A reação de PCR
� Eleva-se a temperatura a 72ºC durante alguns minutos 
(dependente do tamanho da molécula que se deseja amplificar).
� A DNA polimerase atua junto dos primers que hibridaram, começando 
a duplicação da cadeia (síntese nova fita) e recrutando no meio os 
nucleotídeos complementares disponíveis.
3- Extensão das fitas
- Tempo de extensão depende do comprimento do fragmento (amplicon)
A reação de PCR
A reação de PCR
A mecanística da PCR
0 1 2 3 4 tempo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
 
(
°
° °
°
C
)
Denaturação do DNA
Anelamento de oligonucleotídeos
Etensão
Pre-requisitos para DNA-polimerase:
- ‘Template’ (molde)
- Primers
- dNTPs
- Mg 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
‘Template’ (Molde) para a reação de PCR:
• DNA genômico
• cDNA
• DNA genômico de micro organismos que estejam 
parasitando uma dada célula (vírus e outros)
• cDNA de micro organismos 
• Produtos de PCR
• Fragmentos de DNA clonados em vetores
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
“Primers” (iniciadores) para PCR:
• “Primers”: oligonucleotídeos com 18 a 24 bases (fita única)
 escritos sempre na direção 5´ ---> 3´
• São necessários dois “primers”:
• Um complementar a um trecho da fita anti-sense
» Primer sense
• Um complementar a um trecho da fita sense
» Primer anti-sense
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Uma única cópia de um gene pode ser 
amplificada a partir de uma amostra genômica
desde que se tenha os primers correspondente à
seqüência conhecida do gene
REAÇÃO EM CADEIA DA 
POLIMERASE (PCR)
REAÇÃO EM CADEIA DA 
POLIMERASE (PCR)
235 = 34.359.738.368 cópias do DNA original
Ao final de 35 ciclos...
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Reação Típica:
95 °°°°C – 1 minuto (denaturação do DNA);
55-60 °°°°C – 1 minuto (anelamento dos oligonucleotídeos);
72 °°°°C – 1 minuto (extensão da cadeia do DNA).
25 a 35
ciclos109 moléculas
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A quantidade de DNA final da reação segue uma função exponencial, 
onde:
N=N0.2
n
N: número final de cadeias de DNA
N0: número inicial de DNA 
molde (template)
n: número de repetições do ciclo
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Cuidados especiais com PCR:
• O único DNA a entrar na reação tem que 
ser a “template” (molde) adicionada 
pelo investigador
• A reação tem que ser realizada em 
ambiente completamente livre de DNA
PCR
- Contaminações;
- Teoricamente uma molécula é capaz de amplificar; 
- o oligonucleotídeo se pareia com uma seqüência 
inespecífica e amplifica um fragmento errado..
Portanto,todo o cuidado é pouco !!!
Cuidados especiais com PCR:
PCR
Verificando os produtos da reação
Amostra
extração
Eletroforese
PCR
Visualização em UV
Produtos finais
A eletroforese é uma metodologia utilizada para separar,
identificar e purificar macromoléculas (DNA ou proteínas).
As partículas carregadas inseridas no gel migram quando sob
influência de um campo elétrico. As moléculas migram de
acordo com o seu tamanho, forma e carga elétrica aplicada.
A separação dos fragmentos por eletroforese é baseada
nestas diferenças. São utilizados géis de agarose ou
acrilamida para a eletroforese de ácidos nucleicos ou
proteínas.
O DNA tem carga elétrica negativa e migra em direção ao
eletrodo positivo.
Eletroforese
Tamanho Poder de resolução Configuração
Fragmentos
Acrilamida 5-500pb Alto* Vertical
Agarose 200pb- 50kb Baixo Horizontal
* Fragmentos de DNA que diferem em tamanho em 1 pb
podem ser separados.
Eletroforese
- Os géis mais utilizados são os de Agarose e Poliacrilamida.
- O gel de Poliacrilamida: Fragmentos pequenos de DNA ou RNA(10 a 500 pb)
- O gel de Agarose: Fragmentos grandes (100 pb até 50 Kb).
Eletroforese
Os Géis são suspensões semi-sólidas
Gel de agarose
Eletroforese
- Também pode ser empregada para análises de RFLPs e produtos 
de amplificacão de DNA obtidos por PCR
- A preparação do gel está baseada no volume total do molde.
- O porcentagem de agarose geralmente é de 1%.
- Para fragmentos maiores, menos porcentagem de agarose (0,5%).
- Tampão TAE ou TBE (Tris acetato ou borato, EDTA, pH 8).
- Brometo de etídio (Abs.UV 260nm e Emite fluorescência 590 nm).
- ‘Ladders’ (marcadores de peso da corrida eletroforética). 
Gel de Agarose
Eletroforese
Fragmentos de PCR
Eletroforese
Verificando os produtos da reação
Gel de poliacrilamida
♠ Polimerizacão da acrilamida.
♠ Agente entrecruzador (cross-linking) : bisacrilamida.
♠ Iniciador : TEMED (N,N,N,N- tetrametilnediamida).
♠ Catalisador : PSA (Persulfato de Amonio), Ribofavina.
♠ A velocidade de polimerização: [ ] de PSA e TEMED.
♠ A porosidade do gel : proporcão de Acri/Bis.
♠ A maioria das proteínas se separam em espectro de 5 a 10%.
Eletroforese
Dispositivos para fazer eletroforese em géis de acrilamida
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
A polimerase termo estável ...
* A primeira polimerase termo estável, Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) 
foi descrita em 1988.
E a DNA polimerase, resiste a tudo isso?
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
• A enzima mais comum no PCR
• A velocidade de polimerização é de 35-100 
nucleotídeos por segundo a 70-80 ºC 
(temperatura ótima)
• Existe uma versão clonada da Taq -
Amplitaq®
• Algumas versões tem atividade
exonuclease 5’→3’ e alta taxa de erros de 
incorporação de nucleotídeos: 1 base em 
104
Taq Polimerase
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
Mantém o pH ótimo para a atividade enzimática
O tampão mais comum usado com a Taq é constituído por:
� 10 mM Tris-HCl, pH=8,3 à
temperatura ambiente;
� 50 mM KCl;
� 1,5 mM MgCl2;
� 0,01% (p/v) de gelatina.
Tampões e pH da reação
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
dNTPs
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
dNTPs: dATP, cCTP, dGTP, dTTP
� Serão adicionados pela enzima da reação para sintetizar novo 
DNA
� Os dNTPs devem estar em concentrações equivalentes para
minimizar erros na incorporação das bases
Deoxinucleotídeos trifosfato
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
DNA molde (DNA template)
• Basta um única molécula de DNA para se efetuar a 
amplificação ...
• Quando a amostra de DNA é muito pequena
podem ser adaptadas as condições de 
reação para que esta se dê de um modo
eficiente.
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
Desenho de oligonucleotídeos
• Complementares ao DNA molde (template );
• Comprimento de 20-30 nucleotídeos;
• As condições da reação devem ser adequadas para
cada oligonucleotídeo.
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Elementos a serem considerados:
���� polimerases
���� tampão – pH e concentrações iônicas
���� dNTPs
���� DNA molde (DNA template)
���� especificidade e seqüência oligonucleotídeos
���� tempo das etapas da reação etc...
1. Desnaturação
94-96oC / 30s-2 min
2. Pareamento ou Anelamento ou Hibridização
45-65oC / ≈ 30 s
3. Polimerização ou Extensão
72oC / até 1 min
Fidelidade da reação e fatores que asseguram a qualidade
Tempo das etapas da reação
Ciclos de temperatura
Os tempos de cada etapa da reação podem interferir 
significativamente na especificidade e rendimento da reação
A otimização da PCR é empírica
• Estudos empíricos da reação possibilitam:
- Aumento do rendimento da reação (eficiência)
- Aumento da especificidade 
- Melhoria da reprodutibilidade