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APOSTILA DE MET

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 Ministério da Educação
Universidade Federal de Lavras – MG
Departamento de Fitopatologia – DFP
Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-estrutural - LME
APOSTILA DO CURSO INTRODUTÓRIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
COORDENADOR: Prof. Dr. Eduardo Alves
Lavras – MG
2004
ÍNDICE
1. O Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-estrutural (LME)
1.1 Introdução
1.2 Histórico
1.3 Funcionamento atual.
2. Filosofia de trabalho do LME.
2.1 Quanto à utilização
2.1.1 Deveres do usuário
2.2 Quanto aos cursos
2.3 Quanto à direção e funcionamento
3. Tipos de microscopia
3.1 A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
4. Princípios da óptica eletrônica
4.1 – Conceito de resolução
4.2 - Interação elétrons/átomo
5- O Microscópio Eletrônico de Transmissão.
5.1 – Fonte de elétrons
5.2 – Sistema de lentes
5.3 – Sistema de vácuo
5.4 – Sistema de refrigeração
5.5 – Formação da imagem. 
6 – Preparo de amostras para MET
6.1 – Fixação 
6.1.1 – Fixação primária
6.1.2 – Fixação Secundária
6.2 – Desidratação
6.2.1- Desidratação em acetona
6.2.2- Desidratação em etanol.
6.3- Inclusão
6.3.1- Tipos de resina e aplicações
6.4- Polimerização
7.- Desbaste (Trimming)
7.1- Desbaste manual
7.2- Desbaste Mecânico
8 . Preparo de soluções
9- Ultramicrotomia
10- Preparo de Telinhas (Grids)
11 – Contrastação
11.1 – Contrastantes
11.2 – Técnicas de contrastação
12- Técnicas rápidas (Leaf dip)
13- Preparo de material em suspensão
14- Técnicas de Imunomarcação.
15- Protocolos
16- Instruções sobre o uso dos aparelhos
16.1- Uso do evaporador de carbono MED. 
16.2- Uso do ´knife maker` da Leica.
16.3- Uso do Ultramicrótomo Reichert-jung – Ultracut.
16.4- Uso do MET
16.4.1- Procedimentos para registro de imagens utilizando o sistema CCD e o Programa Analys Sis.
16.4.2- Procedimentos para gravação de imagens em CD
17- Literatura Recomendada.
O laboratório de microscopia eletrônica e análise ultra-estrutural (LME)
Introdução
Este texto destina-se a auxiliar aos participantes do curso de introdução a Microscopia eletrônica de transmissão (MET), ministrado pelo LME a conhecer o laboratório, sua filosofia de trabalho e oferecer as bases teóricas de funcionamento e constituição do Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET), noções básicas das técnicas de preparo de espécimes e alguns exemplos de aplicações do MET. Além disso, o texto traz as instruções básicas para o uso dos equipamentos envolvidos no preparo de amostras e na observação das mesmas, quais sejam: MET EM 109 ZEISS COM CÂMERA CCD PARA CAPTURA DE IMAGENS, KNIFE MAKER, METALIZADOR DE CARBONO e ULTRAMICRÓTOMO.
 Histórico
O laboratório de microscopia eletrônica foi idealizado em meados dos anos 70 com o apoio do programa EMBRAPA/BID/PROCENSUL. Em abril de 1982 foi importado através da EPAMIG/EMBRAPA o Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET), Mod. EM-109 da Zeiss e alguns acessórios para preparação de amostras. Nós dez primeiros anos o microscópio funcionou pouco devido à falta de um programa de manutenção e de um técnico responsável. Na década de 90 com o empenho da Professora Antônia dos Reis Figueira o microscópio voltou a funcionar e vários trabalhos foram desenvolvidos com a assistência de uma bolsista de recém doutorado (Maria das Graça Ongarelli) até 1997. De 1998 até 2003 o microscópio ficou parado devido à falta de um programa de manutenção sendo os equipamentos reativados em abril de 2003. A reativação do aparelho foi possível graças à verba de R$ 162.500,00 conseguida junto a Finep (INFRA I), como apoio ao projeto submetido pelo Departamento de Fitopatologia através da Pró-Reitoria de Pesquisa. A verba foi destinada à atualização e recuperação do MET, através da compra de uma câmara CCD (que permite a captura de imagens), um software para análise de imagens, um novo sistema de vácuo (bomba turbo que permite o restabelecimento do vácuo em menor tempo e com melhor qualidade), dois anos de manutenção para o MET e reforma de um ultramicrótomo (aparelho utilizado para obtenção de cortes ultrafinos). Em outubro de 2003 graças a mais uma verba da FINEP (programa INFRA II) foram adquiridos um microscópio eletrônico de varredura (MEV) LEO 40VXP e aparelhos acessórios para preparação de amostras para microscopia eletrônica de varredura. 
 Funcionamento atual
A revitalização do laboratório de microscopia eletrônica da UFLA resultou de uma vontade coletiva da Reitoria, através da Pró-reitoria de Pesquisa, de professores do Departamento de Fitopatologia e de outros departamentos para atender a demanda de inúmeras linhas de pesquisa desenvolvidas na UFLA. Foi então criado em março de 2002, através da resolução No 007 do CUNI, como uma das Unidades Centrais de Apoio à Pesquisa da UFLA, o Centro de Microscopia de Precisão, hoje chamado de Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-estrutural (LME), localizado no Departamento de Fitopatologia. Este é um laboratório multi-usuário (institucional), aberto a todos os pesquisadores da UFLA, EPAMIG e outras instituições de ensino da região e também a Empresas Privadas. 
O laboratório possui uma completa infra-estrutura para a condução dos estudos nas diversas áreas do conhecimento. Este conta atualmente com uma área laboratorial de 175,15 m2 (dividido em salas para alocação dos microscópios, ultramicrótomia e de preparação de amostras) e com os seguintes equipamentos: Microscópio Eletrônico de transmissão (MET) Zeiss EM 109 (atualizado e em pleno funcionamento), ultramicrotomo (Reichrt-jung ultracut), aparelho Knife Maker (Leica), Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) LEO EVO 40 XVP (recém adquirido), aparelho de ponto Crítico (Bal-Tec), aparelho evaporador de ouro (Sputtering) (Bal-Tec), aparelho evaporador de carbono (Bal-Tec), botijões para nitrogênio líquido. Estes aparelhos se aplicam a estudos relacionados a várias áreas de pesquisa da UFLA, tais como Fitopatologia, Entomologia, Botânica, Citologia, Genética, Microbiologia, Bioquímica, Zootecnia, Ciência dos Alimentos, Veterinária, Engenharia Florestal, entre outras além de atender a outras instituições.
	
2. Filosofia de trabalho do LME.
O Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-estrutural (LME) tem como finalidade desenvolver e incentivar a pesquisa científica de alto nível, através do uso da microscopia eletrônica e de luz e de técnicas associadas, bem como desenvolver atividades de ensino de pós-graduação e graduação. 
	Dentro da filosofia de um laboratório multi-usuário a proposta de trabalho do LME é:
2.1 Quanto à utilização
 	O laboratório está aberto a todos os pesquisadores que precisem destas ferramentas em seus estudos. Para isso, o interessado deverá fazer um curso de qualificação que é fornecido periodicamente ou uma disciplina de graduação ou pós-graduação. Após os interessados passarão a serem considerados usuários e terão livre acesso as instalações para a utilização dos aparelhos para os quais foram treinados. O Laboratório não cobrará pelo uso dos aparelhos da comunidade da UFLA, até o fim do contrato de manutenção. Novos projetos serão preparados para que esta isenção permaneça. Quanto a outros usuários: pessoas ou empresas privadas, que queiram utilizar o laboratório, terão que fazer os cursos de qualificação e pagar uma taxa por hora de uso. Usuários de outras instituições públicas poderão utilizar os aparelhos perante a elaboração de convênio com a UFLA/FAEPE e também atendido as normas para a utilização. 
O laboratório não presta serviço, ou seja, nenhum membro do laboratório fará serviço por encomenda. O interessado poderá receber treinamento para utilizar os aparelhos e executar os seus trabalhos.
2.1.1 Deveres do usuário:
O usuário deverá: utilizar apenas os aparelhos para os quais foi qualificado e ter todo o cuidado na utilização;agendar com antecedência os horários para utilizar os aparelhos; mencionar o nome do laboratório em todos os trabalhos que forem apresentados em congressos ou publicados em revistas científicas; repor os reagentes utilizados e cuidar para que a organização do laboratório seja mantida.
2.2 Quanto aos cursos.
	Os cursos de qualificação serão fornecidos periodicamente (cada curso 2 a 3 vezes por ano, conforme demanda). Será cobrada uma taxa, tendo o usuário direito a uma apostila para o acompanhamento do curso e posterior orientação no modo de operação dos aparelhos. Serão também emitidos certificados de participação e autorização para a utilização do laboratório. Periodicamente, conforme solicitação da comunidade, poderão ser fornecidos cursos avançados, por especialista de diversas áreas da Microscopia. Também são oferecidas disciplinas de graduação e pós-graduação que qualificarão usuários para utilizarem os aparelhos do laboratório. Nestas disciplinas não haverá nenhum ônus para o aluno.
2.3 Quanto à direção e funcionamento.
	O Laboratório é gerido por um comitê, chamado Comitê Gestor (CG), formado por seis membros, conforme recomendação da resolução do CUNI, uma Coordenação Técnica (CT) Prof. Eduardo Alves e ainda uma comissão de usuários. Esta comissão de usuário verifica periodicamente se o laboratório está funcionando dentro das regras estabelecidas e se o mesmo está sendo realmente multi-usuário. O gerenciamento dos recursos é feito pela FAEPE, através de uma conta bancária do laboratório. 
3. Tipos de microscopias
A microscopia é definida como o campo da ciência que utiliza o microscópio como ferramenta. Basicamente, temos três tipos de microscopia: a microscopia de luz (ML) ou fotônica, a microscopia de varredura (MV) e a microscopia de transmissão (MT). Devemos considerar que em todos os tipos é utilizado um sistema de lentes na geração de imagens. Desta forma, todas as microscopias são ópticas. Na ML a fonte de iluminação podem ser lâmpadas incandescentes (p. ex: filamentos enrolados e quartzo-halogênio ou descargas de gases p.ex: mercúrio, xenônio e sódio) em que a luz é absorvida pela amostra gerando a imagem. Na MV a amostra é varrida e um sinal é gerado e capturado produzindo uma imagem em um monitor. O tipo mais conhecido de MV e a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), em que os elétrons são utilizados para a varredura das amostras gerando elétrons secundários ou retroespalhados que podem ser capturados para gerarem a imagem. Porém nas últimas décadas, outros tipos de MV têm surgido como a microscopia de tunelamento e a microscopia de força atômica, que permitem resoluções a nível atômico. Finalmente temos a MT que será tratada em maiores detalhes nesta apostila. Neste tipo de microscopia um feixe de elétrons é incidido sobre a amostra e a atravessa em maior ou menor intensidade. Isto ocorre porque as parte mais eletrodensas apresentam a capacidade de desviar os elétrons, formando uma sombra em uma tela fluorescente, enquanto que as parte menos eletrodensas deixam os mesmos atravessarem ficando claro, deste modo, gerando as imagens, como apresentado na Figura 1.
3.1 A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
O microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi introduzido como instrumento de pesquisa por volta de 1950 e sua utilização trouxeram contribuições marcantes ao conhecimento humano, ao mostrar detalhes jamais antes visualizados na área biológica e de ciência de materiais. Por exemplo, a biologia celular sofreu marcante revolução quando a ultra-estrutura celular foi revelada em toda sua exuberância, não só mostrando detalhes de poucas organelas até então conhecidas (membrana plasmática, núcleo, nucléolo, cromossomos, cloroplasto, mitocôndria, centro celular, plasmodesma, p.ex.), mas também permitindo a descoberta de uma série de outros componentes como retículo endoplasmático, ribossomos, microtúbulos, microfilamentos, filamentos intermediários, lisossomo, peroxissoma, complexo juncional, junções comunicantes, glicocalix, etc.
	A aplicação do MET tem, contudo, limitações impostas pela necessidade do alto vácuo na coluna do aparelho e pelo baixo poder de penetração do feixe de elétrons. Assim, o exame dos espécimes pode ser realizado apenas em secções ultrafinas (50-200 nm em espessura), o que dificulta a visualização da organização tri-dimensional dos mesmos. Contudo, um certo nível de informação pode ser obtido pelo estudo de secções seriadas ou técnicas especiais como a criofratura.
Figura 1. Esquema mostrando os tipos de microscopia e uma comparação do processo de formação de imagem em cada tipo.
4. Princípios básicos de óptica eletrônica
4.1 Conceito de resolução
A primeira pergunta que ouvimos do leigo ao ver um microscópio é: Qual é o aumento? Na verdade, o aumento que tanto impressiona o usuário ocasional de microscopia, não é o parâmetro mais importante a considerar. Parece-nos, à primeira vista, que se dispuséssemos de instrumentos perfeitos poderíamos examinar uma amostra com aumentos cada vez maiores, e perceber detalhes cada vez menores, até distinguir os átomos, ou quem sabe, as partículas que os compõem. Não é isto o que ocorre: existe uma limitação física relacionada com a radiação utilizada, para a menor distância entre dois pontos que permite distingui-los separadamente. A esta distância chama-se "limite de resolução", e um aumento maior não revelará nenhum detalhe adicional da estrutura.
	Entende-se por resolução, a menor distância entre dois pontos do material em exame nitidamente distinguível, em princípio, quanto menor, melhor; poder de resolução de um instrumento de óptica é a capacidade de resolver detalhes. O correto é falar em melhor e não maior poder de resolução. Assim, a resolução do olho humano é da ordem de 0.1 mm, a de um microscópio de luz, cerca de 200 nm (0.2 µm), de um MEV é de 10 A (1 nm) e de um MET, ao redor de 1-2 A (0.1-0.2 nm)�.
	O olho desarmado não distingue dois pontos situados a menos de 0.1 mm devido à natureza da retina, o órgão foto-receptor, que é formado por um tapete de células fotossensíveis de formato cônico ou de bastonetes. O diâmetro médio de cada unidade foto-receptora é de cerca de 0.1 mm. Assim, para dois sinais luminosos serem interpretados como dois pontos independentes, os mesmos devem atingir duas unidades receptoras diferentes. Dessa maneira, os impulsos nervosos gerados serão interpretados no cérebro como dois pontos distintos. Se a distância for menor que 0,1 mm, os dois sinais serão recebidos por apenas uma unidade foto-receptora e assim interpretados no cérebro como um sinal apenas. É possível melhorar a resolução de nossa vista se antepusermos entre o olho e o objeto uma lente ou complexo de lentes (uma lupa ou microscópio) que amplia a distância entre os pontos em observação. Usando o microscópio de luz consegue-se melhorar o poder de resolução do olho desarmado, em cerca de 1000 X, chegando a micrometros.
	Após os trabalhos pioneiros de Leeuwenhoek no século XVII, a evolução do microscópio de luz atingiu seu apogeu já no fim do século XIX. Algumas inovações como contraste de fase ou contraste interferencial melhoram a contrastação do espécime, mas não a resolução. Um leigo poderia imaginar que seria possível distinguir pontos situados a menos de 200 nm no microscópio de luz (ML) caso uma micrografia tomada fosse ampliada centenas ou até milhares de vezes. Entretanto, a prática revela que apenas serão ampliados borrões sem melhoria da resolução. A limitação da resolução do ML se deve a um fenômeno conhecido como difração, que deriva da natureza ondulatória da luz. Se interceptarmos um feixe de luz com um anteparo, no qual há um pequeno orifício, é possível projetar a imagem deste orifício em uma tela. O senso comum nos levaria a acreditar que uma mancha luminosa deveria surgir, o que de fato acontece, entretanto ao redor da mancha forma-se uma série de anéis concêntricos, de intensidade que se reduz à medida que se afasta do centro. Esta figura é conhecidacomo disco de Airy.
Figura 2. Esquema mostrando porque a difração da luz, criando o disco de Airy, faz com que a imagem de dois pontos muito próximos aparece fundida a partir de distâncias aproximadamente iguais à metade do comprimento de onda da luz.
O disco de Airy se deve à interferência das ondas luminosas que se iniciam no orifício, cujas cristas e depressões se sobrepõem ou se anulam. Caso sejam feitos dois orifícios, cada vez mais próximos, haverá uma situação a partir da qual, embora exista uma distância real entre eles, suas imagens não serão distinguíveis, como acontece na situação mostrada pela figura 2A. Ao contrário, as imagens serão fundidas devido aos anéis (figura 2B), quando então dizemos que foi atingido o limite de resolução. Baseado nestes fenômenos, em fins do século XIX Abbe formulou uma expressão matemática para definir o poder de resolução:
		d = k ( / n sen ( [1].
Onde d = resolução (quanto menor o valor, melhor!); k = uma constante de proporcionalidade que depende do brilho da amostra; (= comprimento de onda da radiação usada no sistema de iluminação (no caso, luz visível é uma radiação eletromagnética de ( entre 400 a 700 nm); n = índice de refração do meio; (= ângulo formado pelo eixo óptico e a reta que passa no bordo da lente e no seu ponto focal. A expressão n sen( é conhecida como abertura numérica do sistema óptico. Na prática, a expressão k/n sen( é na melhor das hipóteses 0.5 (e, portanto d = 1/2 (). Dessa maneira, podemos, com aproximação considerar a resolução de um instrumento óptico como metade do comprimento de onda da radiação empregada na iluminação. No caso das luzes visíveis, usando a forma mais curta (violeta, de 400 nm), teríamos uma resolução de 200 nm, que é o atingível na prática. Usando luz ultravioleta (( em torno de 200 nm), conseguiríamos uma resolução de 100 nm, necessitando, contudo, o uso de lentes especiais de quartzo.
	Nota-se pela expressão [1] que a única maneira de diminuir d é reduzindo (. De fato, existem muitas formas de radiações eletromagnéticas de ( bastante inferior ao da luz, mas existem enormes dificuldades em manipulá-las e gerar imagens. Dentre elas temos, por exemplo, o feixe de elétrons. Elétrons são partículas subatômicas, de carga negativa e massa muito pequena (ao redor de 1/1800 da massa do próton) órbitando em torno do núcleo. É possível arrancar estes elétrons dos átomos, e gerar um feixe e esta tecnologia já estava disponível no início do século XX. Os estudos de Louis de Broglie na década de 20 permitiram estabelecer a dualidade partícula/onda das radiações eletromagnética e no caso de partículas em movimento, calcular seu (. Assim, (=h/mv [2] (h- constante de Plack [6,55 x 10-27]; m = massa do elétron = 9,107 X 10-28 g; v = velocidade). Sendo a energia cinética dos elétrons função da voltagem de aceleração temos: mv2/2=Ve[3] (V = voltagem de aceleração; e = carga do elétron [=1,603x 10-19 c]). Reunindo [2] e [3] temos (e= 12/ V-0.5 A[4], onde V é a sua voltagem de aceleração (para se acelerar um feixe de elétrons, aplica-se aos mesmos uma tensão). Assim, se V = 90.000 V (uma tensão que se usa em um MET) (e = 0,04 A e, portanto d = 0,02 A. Infelizmente problemas de aberração de esfericidade (feixes de elétrons mais periféricos são mais fortemente defletidos do que os centrais, gerando imagens em forma de borrões de objetos pontuais). Em função destes problemas ainda não terem sido resolvidos na confecção das lentes eletrônicas atuais, a resolução do MET está limitada a 1-2 A. Os MEVs convencionais tem resoluções da ordem de 30-50 A, e recentemente usando canhões do tipo “field emission” tem-se atingido valores próximos a 10 A.
4.2. Interação elétrons/átomo
	No caso do MET a imagem é gerada pelo feixe de elétrons que atravessa o espécime, o qual deve ser suficientemente delgado para permitir a transmissão. A imagem é na realidade uma “sombra” do espécime, projetada na tela fluorescente, em que, quanto maior os átomos dos elementos que compõe certa porção do espécime, maior a quantidade de elétrons que se desviam (“espalhamento”) da trajetória e maior o contraste na imagem.
	No MEV, o processo de geração de imagem é completamente distinto. Para compreender como isto se dá, teremos que discutir antes os fenômenos que se sucedem quando um feixe de elétrons incide sobre a superfície da amostra: (1) se o espécime for suficientemente delgado, parte do feixe poderá atravessá-lo e teremos os elétrons transmitidos; se o espécime for cristalino, com estruturas periódicas estes elétrons transmitidos podem gerar imagens difratadas (imagem em MET); (2) se a superfície da amostra for condutora, parte dos elétrons poderá ser absorvida e originar uma corrente, ou força eletromotriz; (3) dependendo da substância que forma a amostra, esta poderá, sob o bombardeio de elétrons, ter seus átomos excitados e ocorrer à emissão de fótons (luz) e o fenômeno é conhecido como catodoluminescência ou em outros termos, fluorescência (é o fenômeno que ocorre p.ex. na tela do MET (local onde se observa à imagem) ou no tubo de TV e na lâmpada fluorescente); (4) parte dos elétrons pode ricochetear na superfície da amostra, sem perder energia. Temos então, elétrons retroespalhados (backscattered electrons), que podem ser eventualmente coletados e gerar imagens (imagem em MEV); (5) parte dos elétrons incidentes, primários, pode ser retido nos átomos da amostra, com que se chocam deslocando simultaneamente elétrons da órbita deste átomo que seriam ejetados, e que são referidos como elétrons secundários (imagem em MEV). (6) quando há emissão de elétrons secundários, ocorre no átomo que os gerou, um desbalanço energético, pois os elétrons secundários têm nível de energia mais baixo que os primários. Esta diferença de energia é dissipada em forma de raios X, que é característico em termos de energia e de ( para cada elemento (Figura 3). Os raios X podem ser coletados e analisados indicando qual o elemento que os emitiu. Esta técnica é conhecida como microanálise de raios X, e o instrumento que o faz, é a microssonda. Na figura 3 podem-se também observar as regiões da amostra onde são gerados os sinais. Elétrons secundários que são gerados em uma menor área permitem uma melhor resolução do que os retroespalhados e raios X que são gerados em uma área maior, porem as informações geradas por estes são apenas da parte mais superficial da amostra.
Figura 3. Esquema da interação elétron/amostra gerando diferentes sinais e as área/volume da amostra envolvidas na emissão de elétrons secundários, reproespalhados e raios X, após a amostra ser irradiada pelos elétrons primários.
5 . O microscópio eletrônico de transmissão
	O microscópio eletrônico de transmissão é composto por um sistema de iluminação (uma fonte de elétrons), um sistema de lentes, um sistema de vácuo, um sistema de estabilização e refrigeração e um sistema de registro das imagens, os quais serão discutidos em detalhes a seguir.
5.1 – Fonte de elétrons
A fonte de iluminação é composta por um canhão de elétrons. Duas fontes de elétrons são utilizadas: termiônica e de emissão de campo. Em todas as fontes, o emissor age como cátodo, e os elétrons são focalizados em um ponto, denominado cruzamento, por um ânodo com potencial negativo. Os materiais adequados para as fontes de elétrons precisam ser refratários e também atingir altas temperaturas para que os elétrons sejam emitidos. O tipo mais barato, mais robusto e de mais fácil operação é o filamento de tungstênio. Este material tem a desvantagem de fornecer menor intensidade e brilho dos feixes de elétrons. Outras fontes de elétrons podem ser utilizadas. Como exemplo temos o Hexaborato de Lantânio (LaB6), que tem a vantagem de fornecer brilho uma grandeza maior, porem com um custo muito elevado.
5.2.. Lentes nos microscópios eletrônicos
	Pelo que foi descrito acima, o uso de um feixe de elétrons ao invés da luz visível permitiria resoluções significativamente melhores que a do ML. Contudo, houve dificuldadesiniciais em se manipular um feixe de elétrons em função do baixo poder de penetração e propagação apenas em alto vácuo. Assim, lentes convencionais de vidro, quartzo, plástico, etc. não foram consideradas adequadas, pois não permitem a passagem dos elétrons. O impasse foi resolvido por um físico alemão, Busch, que no fim da década de 20 verificou que se o feixe de elétrons se propagasse ao longo do eixo de um solenóide (um cilindro oco, no qual se enrolam fios e ao se passar uma corrente elétrica nos fios, cria-se um campo magnético simétrico em torno do eixo), seu campo magnético desvia este feixe convergindo-o em um ponto (Figura 4).
Figura 4. Esquema de uma “lente eletrônica” gerada por um solenóide excitado por uma corrente elétrica. Note que a trajetória dos elétrons sofre também uma rotação.			
	Nos anos subseqüentes, um grupo de técnicos alemães da Escola Técnica Superior de Berlin se empenharam no projeto de construir um microscópio, de transmissão, usando estas lentes eletrônicas. Entre estes pioneiros estava o Doutor Ernst Ruska (que recebeu prêmio Nobel cerca de 50 anos depois). Tais esforços resultaram no primeiro protótipo comercial de MET produzido pela Siemens em 1939. Com o advento da guerra o projeto foi paralisado e retomado após o fim da conflagração, por volta de 1950, quando a ciência finalmente teve a sua disposição este equipamento. 
	5.3 – Sistema de vácuo
O interior da coluna e a câmara onde ficam os espécimes ficam sob alto vácuo. Se existirem moléculas de gases, estas desviam o feixe, impedindo a formação da imagem e podem se ionizar e causar descargas junto ao catodo e ao ânodo.Também, o filamento, devido às altas temperaturas necessárias para gerar elétrons, na presença de ar poderia se queimar facilmente. O vácuo requerido é da ordem de 10-4 mmHg ou menor. Para que este seja obtido são utilizadas bombas rotativas, de difusão a óleo ou turbomolecular, sendo esta última de melhor performance. 
5.4 – Sistema estabilização e refrigeração
Flutuações na rede elétrica podem afetar a estabilidade do feixe de elétrons e das lentes. Assim, os METs contam com um sistema sofisticado de regulagem e estabilização das correntes. Também, é comum a instalação de um estabilizador de tensão e mais recentemente de nobreak. As lentes e o sistema de vácuo também necessitam refrigeração, o que é feito geralmente por um circuito fechado de água. A sala onde fica o MET também deve contar com um sistema de ar-condicionado, que é importante para assegurar o bom funcionamento dos componentes eletrônicos, evitar dilatações do material constituinte do aparelho, o que pode provocar o desalinhamento do feixe de elétrons e para maior conforto do usuário. O microscópio de transmissão também possui um reservatório para N-líquido, mas que não tem nenhuma função de refrigeração, mas sim de limpeza das lentes, pois as partes internas de cobre destas lentes quando resfriadas atraem impurezas presentes no interior da coluna, desta forma evitando que estas prejudiquem o desempenho do aparelho.
5.5 – Formação da imagem. 
Um filamento pontiagudo é excitado por uma alta voltagem produzindo elétrons, que são conduzidos através da coluna do aparelho e atravessam ou são retidos pela amostra (secções ultrafinas do espécime com 60 a 100 nm de espessura) formando uma imagem em um anteparo fluorescente (Écran – formado por uma película fluorescente composta de uma mistura de Zn, Cd e S, ligada a uma base de metal geralmente com nitrocelulose), através de um mapa de elétron-densidade. Esta imagem pode ser registrada em filmes de 70 mm ultra-sensíveis ou capturada por uma câmera CCD que transfere a mesma para um computador.
6. Aplicação da Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
	A MET pode ser utilizada em uma grande gama de pesquisa, cujo objetivo seja a observação de estruturas e fenômenos que ocorrem no interior das células, tecidos e órgão, tantos os de origem vegetal como animal. Pode também ser utilizado para a observação de pequenas partículas de origem mineral e outras como vírus, além de microrganismos como phytoplasmas, micoplasmas, bactérias, fungos de dimensões micrométricas.
7. Preparo de amostras para MET
	A fim de aproveitar o poder de resolução do MET, as amostras devem ser devidamente preparadas. Alguns pontos são importantes para se definir o que é necessário para a preparação de uma amostra para MET: 1) devido ao baixo poder de penetração dos elétrons é importante que as amostras sejam bem delgadas em torno de 60 a 100 nm de espessura; 2) devido à necessidade do vácuo as amostra precisam estar totalmente sem umidade; 3) amostras biológicas necessitam também sofrer tratamentos que aumentem sua capacidade de desviar elétrons, o que é alcançado com a fixação e contrastação com metais pesados; 4) devido a necessidade de cortes ultra-finos as amostras necessitam ser incluídas em resinas que facilitem o corte posterior. Considerando estes fatores varias etapas são necessárias para a preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão, as quais serão comentadas a seguir:
7.1 Fixação 
Como o próprio nome sugere, a fixação é o processo pelo qual se obtém estabilização das estruturas celulares e intercelulares. O que se busca é a preservação da morfologia das biomacromoléculas, suas relações topológicas, bem como da fase aquosa com os respectivos solutos, da forma que os mesmos se encontram "in vivo". Além disto, à fixação tem a finalidade de aumentar a eletrodensidade das amostras biológicas, aumentando o contraste. Isto é essencial uma vez que, estas amostras são compostas de átomos leves como C, H, O, N, P, etc, que não permitem um bom contraste. Depois de fixados os espécimes biológicos podem suportar melhor os traumáticos eventos impostos pelo M.E., ou seja, o extremo vácuo e o intenso aquecimento provocado pelo feixe de elétrons, além de permitir uma melhor resolução.
Naturalmente, dependendo da natureza do espécime, as condições de fixação (componentes, concentração, tipo de tampão (substâncias, molaridade, pH), tempo, temperatura, etc.) podem variar. A fixação pode ser feita através de secagem ao ar livre, que não oferece bons resultados; através da criofixação que consiste em submeter os tecidos a congelamento rápido e super-rápido, i.e, à velocidade de congelamento da ordem de 1000oC por segundo (porém este tipo de fixação requer equipamentos especiais) ou o uso de substâncias químicas. Este tipo de fixação é o mais utilizado, sendo obtido através do emprego de substâncias que reagindo com determinados sítios das moléculas estabilizam as mesmas. Hoje em dia, tem sido utilizada mais freqüentemente uma dupla fixação, sendo a primeira com uma mistura de aldeídos e a segunda com tetróxido de ósmio. Uma breve explicação de como atuam os fixadores em cada etapa é dada a seguir:
7.1.1 Fixação primária
7.1.1.1 Fixação com glutaraldeído:
	A utilização de glutaraldeído ou aldeído glutárico é uma molécula com 5 carbonos com um grupo aldeído em cada extremidade e foi inicialmente descrita em 1963 (J. Cell Biology, 17:19, 1963). É recomendada devido a sua capacidade de penetração e por precipitar prontamente as substâncias protéicas da célula, assegurando ótima preservação da ultra-estrutura. A velocidade de penetração deste fixador é de (0,2 mm – 0,6mm/hora) semelhante a do tetróxido de ósmio. Sendo este um composto orgânico, é geralmente necessário proceder a uma pós-fixação com tetróxido de ósmio, para assegurar a elétron-densidade necessária. Esta pós-fixação também é importante, desde que o glutaraldeído não é um bom fixador para lipídeos, que podem ser extraídos durante a desidratação. 
	Deve-se ressaltar que este é um fixador aditivo, que à medida que vai penetrando, vai sendo irreversivelmente incorporado às estruturas, portanto a concentração na solução vai decrescendo. Por isso o volume de fixador a ser utilizado deve ser pelo menos 10 vezes maior do que o da amostra. 
7.1.1.2 Fixação com paraformaldeído:
	O paraformaldeido preserva menos asestruturas celulares que o glutaraldeído, por ser menos eficientes em estabelecer ligações cruzadas. Porém é utilizado pela rapidez de penetração (5 a 10 vezes superior a do aldeído glutárico) e por manter melhores as propriedades enzimáticas e imunogênicas que outros fixadores. Este é muito utilizado em trabalhos imunohistoquímicos.
 	
7.1.1.3 Fixação com Karnovsky:
Este fixador combina a rapidez com que o formol penetra, matando rapidamente a célula, com a capacidade de o glutaraldeído preservar a estrutura da célula, formando pontes entre as moléculas graças aos dois grupamentos aldeídicos nas extremidades, criando assim uma trama tridimensional.
	A fixação pode ocorrer à temperatura ambiente ou na geladeira, mínimo de 1 hora. Se necessário, a amostra pode ser mantida no fixador por até semanas e assim, ser remetida de um local distante ao laboratório pelo correio. O volume do fixador deve ser de cerca de 10x o da amostra. Tubos Eppendorff de 1,5 ml são recipientes convenientes para a fixação. 
	
7.1.2 Fixação Secundária
7.1.2.1 Pós-fixação com tetróxido de ósmio (OsO4)
O tetróxido de ósmio (ou ácido ósmico) é usado em misturas fixadoras desde o começo do século passado e permite obter ao nível do microscópio de luz e transmissão as melhores preservações possíveis. Este funciona como uma segunda etapa de fixação, graças aos oito grupamentos ativos que possui, os quais ao reagir com lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos resultam em uma trama tridimensional estabilizando a estrutura da célula. É também importante, pois protege as lipoproteínas naturais do tecido evitando sua coagulação, devido reagir com lipídios, normalmente não fixado pelos aldeídos. O OsO4 age também como contrastante, devido ao seu poder de espalhamento dos elétrons. Além disso, abole as propriedades osmóticas das membranas celulares, estabilizando as estruturas celulares durante a desidratação e inclusão. Os espécimes para uma boa fixação necessitam ter dimensões de 0,5 a 1 mm, devido a lenta e baixa capacidade de penetração do produto. 
DICA: usar luvas e manipular o produto no interior de capelas.
7.1.3 Fixação complementar ou contrastação em bloco
	Esta fixação é feita com o acetato de uranila, que normalmente é utilizado como contrastante de cortes ultra-fino. Freqüentemente utiliza-se acetato de uranila 0,5% e isso é referido também como contrastação em bloco, pois o tratamento melhora a preservação de membranas destacando o aspecto trilaminar das mesmas. Após, o tratamento com uranila, a extração de proteínas e fosfolipídeos, que ocorreriam num processamento normal são substancialmente reduzidas. Também a preservação das junções das células, mitocôndrias e nucleoproteínas são melhoradas. A uranila se prende aos radicais fosfatos, grupos carboxilas e grupos aminos livres. 
DICA: Na presença de fosfatos e cacodilato a uranila precipita, devido a isto é importante uma boa lavada em água após a fixação em OsO4.
7.2 Desidratação
	Desidratação é a substituição da água da amostra por um solvente para os hidrofóbicos meio de embebição. Esta é uma etapa importante do processo de preparação da amostra, pois praticamente todos os meios de inclusão utilizados na microscopia eletrônica, atualmente, não são miscíveis com água. Conseqüentemente torna-se necessário à retirada de toda a água da amostra que está sendo preparada. Entretanto, isto não pode ser feito de maneira abrupta, pois pode causar o rompimento de membranas e a desestruturarão dos tecidos. Desta forma após a fixação o espécime deverá passar por banhos sucessivos de um agente adequado para substituir a água. Os agentes mais utilizados são acetona e etanol. 
7.2.1 Desidratação em acetona
	Esta tem sido mais utilizada por causar menor retração dos tecidos do que o etanol. Apresenta uma menor reatividade em geral e é mais facilmente miscível com as resinas mais utilizadas. No entanto, a acetona é mais hidrofílica e absorve água facilmente do ambiente.
O procedimento de desidratação segue as seguintes etapas: a amostra fixada em OsO4 pode ser lavada com água destilada e a seguir submetida a soluções de concentração crescente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) permanecendo cerca de 10 min em cada uma. Este procedimento é importante para evitar a ruptura da membrana. Na solução a 100% deve ser passada três vezes. Se houver necessidade de interromper o processo, isto deve ser feito na solução a 70%. Quando as amostras são muito pequenas, pode se colocá-las em gaiolas individuais, devidamente identificadas (com pedaço de papel escrito a lápis ou marcando as próprias gaiolas) para facilitar o trabalho.
7.2.2 Desidratação em etanol.
	Esta desidratação é mais indicada quando se querem realizar trabalhos de imuno-localização, em que se utiliza resina de baixa viscosidade como LRWhite e Spurr. Quando se utiliza resina como Epon e se realiza desidratação com etanol é recomendável utilizar no último banho óxido de propileno que é extremamente volátil é potencialmente cancerígeno. Exemplo de um protocolo com etanol é apresentado a seguir: Etanol (50 e 70 por 15min; 95% duas vezes de 15 min e 100% duas vezes de 15 min Oxido de propileno duas vezes de 15 min, 1:1 oxido de propileno /epon por 30min e epon puro por 30min, seguido de embebição por 24 horas. 
	7.3 Inclusão, embebição ou infiltração.
	Este é o processo de gradual substituição do agente desidratante pela resina. Isto é necessário, pois o espécime deve ser incluído em um material que permita a posterior obtenção de cortes ultrafinos. Este material deve ter uma boa estabilidade quando submetido ao feixe de elétrons e permitir uma boa contrastação. O liquido de inclusão deve endurecer (sobre determinadas condições) formando uma sólida matrix que permeia os tecidos. 
7.3.1 Tipos de resina e aplicações
As principais resinas utilizadas hoje são Epon, Spurr e LRwhite. Um breve comentário sobre as características e aplicações de cada uma é apresentado a seguir:
EPON: é uma resina de alta viscosidade muito utilizada no passado, mas que ainda hoje é utilizada em muitos laboratórios. A resina básica é uma mistura com DDSA (anidrido dodecenil succínico) e MNA (anidrido metil nádico) mais um catalizador DMP-30 (2,4,6 – tridimetilaminametilfenol). A mistura pode ser guardada em freezer por várias semanas, mas é sempre recomendável preparar pequenas quantidades para evitar possíveis prejuízos, devido ao endurecimento.
SPURR: é utilizada quando o espécime é de penetração difícil (material vegetal, células de paredes mais grossas), por ser de baixa viscosidade. Esta característica lhe confere melhor penetração. È uma mistura de resinas EPOXI, como o ERL – 4206 (vinil ciclohexeno dióxido) e a DER -736 (diglicidileter de prolipropilenoglicol) com o NSA (anidrido nonenil succínico) e o catalisador DMAE (dimetilaminoetil).
LRWHITE: é um meio acrílico de baixa viscosidade, rápida inclusão, recomendada para imunohistoquímica e citoquímica. Esta apresenta também uma natureza hidrofílica que permite a penetração de moléculas de água que contenham substrato ou anticorpos que possam revelar a natureza das moléculas presentes no espécime. Para esta resina a desidratação em etanol é preferível. A inclusão deve ser feita overnight e a polimerização em cápsulas de gelatina, tanto pelo calor como por luz UV. È composta da resina acrílica e de um catalisador (peróxido de benzoil). A infiltração com esta resina é feita com uma mistura etanol/resina 1:1, por 4-5h, resina pura overnight e polimerização em cápsulas de gelatina a 50-60oC.
	7.4 Emblocamento
7.5 Polimarização
	Esta etapa é também chamada cura. Consiste no endurecimento da resina na qual foi incluído o espécime. Para isto, após a inclusão o espécime é colocado em formas de silicone no caso de se ter utilizado Epon ou Spurr ou em cápsula de gelatina se a inclusão foi em LRWhite. Após o material ter sido bem orientado nos moldes, o mesmo é colocado em placas de Petri e levados a estufa (50-70 oC) para a polimerização.Em certos casos a polimerização do material em tampas de filme ou de vidro de remédio tem sido utilizada. Isto permite, que as bolachas produzidas, possam ser observadas em microscópio de luz, e assim localizados os espécimes com as características de interesse. A polimerização pode também ser realizada no caso de LRWhite na presença de luz UV. 
8. Desbaste (Trimming)
	Antes de ser seccionado o bloco deve ser aparado. Este processo é chamado de toilette, trimming ou desbaste. O processo pode ser manual (utilizando laminas de barbear ou especiais (americanas)), com o auxílio de aparelhos como o Leica EM Trimer, ou no próprio ultramicrótomo. Esta operação destina-se a reduzir a superfície de corte, eliminando o excesso de resina e de tecido. Ao realizar o trimming deve se procurar deixar uma mesa de corte de formato trapezoidal com a base de no máximo 1,5 mm para cortes semi-finos e menos de 1 mm para cortes ultra-finos.
9. Ultramicrotomia
Ultramicrotomia é o processo de obtenção dos cortes ultra-finos para observação em MET, utilizando navalhas de vidro ou diamante (Figura 5) presas ao ultramicrótomo. Porém antes de se obter cortes com esta espessura é recomendável em muitos casos obter as secções chamadas semi-finas (1-2 (m) e examiná-las ao ML para verificar se a fixação está adequada e se o material de interesse está presente.As navalhas devem possuir um reservatório de água destilada, logo após o fio cortante, para que as secções possam flutuar após serem obtidas. O procedimento para o uso do ultramicrótomo e obtenção das secções são apresentados no item 17.3. Aqui vamos descrever o processo de recuperação dos cortes semi e ultra finos. 
Recuperação e coloração de cortes semi-finos.
a) AZUL DE TOLUIDINA/BORATO SE SÓDIO
1) Cortar secções semi-finas (entre 0,5 a 1,5 (m, cor violeta).
2) Pescar as secções com anel (ouro, alumínio, paládio), pincel, palito ou bastão de vidro com a ponta em bisel.
3) Transferir para uma lâmina os cortes. No caso de não usar o anel a lâmina deverá conter uma gota de água destilada.
4) Deixar secar completamente em chapa quente (60oC aproximadamente).
5) Cobri o corte com uma gota grande de corante.
6) Aquecer na chapa até a borda da gota começar a secar (torna-se dourada).
7) Lavar em água e secar em chapa quente ou ao ar.
Recuperação de cortes ultra-finos em telinhas
	As secções a serem selecionadas para observação em MET devem ser avaliadas pela cor. As de coloração (azul, verde, vermelha) devem ser descartadas. As secções de coloração dourada (ca. 100nm), prateados (70-80nm) e cinzas (50-60nm) são consideradas ultra-finas e podem ser coletadas para observação em MET. Quando as secções formam fitas estas podem ser coletadas por baixo, ou seja, mergulha-se a telinha na água e vai erguendo a mesma até que as secções estejam aderidas. Porem quando não se obtém fitas o melhor e coletá-las por cima. Para isto, devem-se reunir os grupos de secções, com um fio de cabelo aderido à ponta de um palito. Em seguida, com o lado da telinha que contém o filme plástico voltado para baixo tocar os cortes, empurrando e retirando-os. Uma pequena gota de água irá aderir à telinha junto com os corte, para seca-lá será necessário colocar um pedaço de papel de filtro sobre a tampa de uma placa de Petri, molhá-lo levemente e colocar a telinha sobre o mesmo até que a gota de água seja absorvida. Em seguida é só pegar a telinha e guardar em caixinhas apropriadas, para posteriormente proceder a contrastação e observação em MET.
Figura 5. Desenho mostrando as navalhas de vidro e diamante, com os reservatórios para água.
Figura 6. (1) Tipos de telinha para microscopia eletrônica, (2) detalhe de uma telinha de cobre com película de plástico e secções.
10 . Preparo de soluções
10.1 Preparo de soluções tampões
	A manutenção do pH durante a fixação de tecidos para estudo á microscopia eletrônica é seguida pela utilização de uma solução-tampão, que serve de veículo para a substância fixadora. O tampão impede a acidificação da solução fixadora, fenômeno usual durante o processo de fixação devido à dissociação de macromoléculas e conseqüente exposição de grupos carboxilas ionizáveis. Tecidos fixados na ausência de tampão apresentam artefatos significativos resultantes da acidificação do meio. Na escolha do tampão deve-se considerar, entre outros: a faixa do pH na qual o tampão é eficiente, o agente fixador a ser utilizado, peculiaridades das estruturas celulares que se deseja realçar, e a presença de elementos (metais em meio de cultura, por exemplo) que possam reagir com o tampão.
DICA: para histoquímica o tampão cacodilato deve ser utilizado.
TAMPÃO FOSFATO: pH 5,0 a 8,2
São os mais “fisiológicos”, porque fosfatos inorgânicos e ésteres de fosfato existem normalmente nos meios celulares. São excelentes tampões para as fixações com tetróxido de ósmio e o glutaraldeído. Porém permiti a formação de precipitados e podem ser contaminados por microrganismos. Este também não deve ser utilizado quando são acrescentados cátions (cálcio por exemplo) na solução fixadora. 
Sol A: NaH2PO4. 2 H2O (Fosfato monossódico) (PM. 156) 	2,76g 
	H2O DDD								 	100mL
Sol. B: Na2HPO4. 12 H2O (PM 358)							3,56g
	H2O DDD									100 mL
OBS: o pH varia em função da mistura A com B tabela abaixo:
	pH
	A (mL)
	B (mL)
	pH
	A (mL)
	B (mL)
	5,8
	92,0
	8,0
	5,8
	51,0
	49,0
	5,9
	90,0
	10,0
	6,9
	45,0
	55,0
	6,0
	88,0
	12,0
	7,0
	39,0
	61,0
	6,1
	85,0
	15,0
	7,1
	33,0
	67,0
	6,2
	81,5
	18,5
	7,2
	28,0
	72,0
	6,3
	77,0
	23,0
	7,3
	23,0
	77,0
	6,4
	73,5
	26,5
	7,4
	19,0
	81,0
	6,5
	68,0
	32,0
	7,5
	16,0
	84,0
	6,6
	62,5
	37,5
	7,6
	13,0
	87,0
	6,7
	57,0
	43,0
	7,7
	10,0
	90
TAMPÃO VERONAL: pH 7,2
Sol. Mãe:
	NaCl 								 85g
	Veronal (ou Dietil barbiturato de sódio) 				20,6g
	H2O DDD									100 mL
Sol. Estoque: completar a solução mãe com H2O DDD, até 5000 mL. Antes de completar a diluição, adicionar 80,6 mL de HCl
Sol. de uso: solução estoque 1:1 com H2O DDD e acertar o pH com HCl ou NaOH.
TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO – HCl. (pH 5,0 á 7,4) 0,2 M
Sol. A:Na(CH3)2 AsO2 . 3 H2O (PM 214)						4,28 g
H2O DDD									100 mL
Sol. B: HCl 								1,66 mL ou	1mL
	H2O DDD							100mL ou	60,3 mL
Sol. estoque: 	Sol. A 				100 mL
 		Sol. B					 até atingir o pH 7,2 a 7,4 (± 8 mL)
Soluções de menor concentração devem ser preparadas diluindo. Ex. 0,1M = 1:1 de estoque e água destilada.
OBS: o cacodilato de sódio contém aproximadamente 30% de arsênico por peso, portanto deve ser manuseado com cuidado, evitando a inalação do produto ou seu contato com pele e mucosas. A reação do cacodilato com ácido pode produzir gás arsênico.
PREPARO DE SOLUÇÃO DE GLUTARALDEÍDO EM TAMPÃO CACODILATO 0,1M.
	Solução
	Quantidade
	Quantidade
	Quantidade
	Quantidade
	Quantidade
	Tampão 0,2M mL
	50
	50
	50
	50
	50
	Aldeído Glut. 25%
	4
	6
	8
	10
	12
	H2O D
	100
	100
	100
	100
	100
	Conc. Final
	1,0%
	1,5%
	2,0%
	2,5%
	3,0%
DICAS: Se a solução fixadora de glutaraldeído se tornar amarelada esta terá perdido grande parte do seu poder de fixação, devendo ser descartada.
Para melhor contrastação de membranas celulares e fibras colágenos e elásticas, pode se acrescentar no momento do uso, 1 a 2% de ácido tânico.
CaCl2 deve ser adicionado na proporção de 0,05g para cada 100mL de água para favorecer a preservação de membranas celulares.
 
10.2 Preparo de fixadores
PREPARAÇÃO DE PARAFORMALDEIDO
Aquecer 40 mL de água destilada a 60-70oC em béquer;
Adicionar 4,0g de Paraformaldeído mantendo o aquecimento. Agitar com bastão de vidro (Em capela);
Adicionar gotas de solução de NaOH 0,1 M 0,04g de NaOH para 10,0 ML de H2O D). Adicionargota a gota até clarear.
Esfriar a solução tampada. 
O paraformaldeído é o formaldeído puro obtido a partir do pó de paraformaldeido. A formalina comercial contém ácido fórmico e metanol prejudicando a qualidade do fixador. Produz-se uma solução estoque, p.ex. a 10%, dissolvendo-se o paraformaldeído em pó em água aquecida; produz-se uma solução leitosa que se clareia com a adição de algumas gotas de hidróxido de sódio normal (a solução deve ser preparada na hora do uso).
PREPARAÇÃO DE GLUTARALDEIDO
O glutaraldeído usado como fixador dever ser “EM grade”, isto é, livre de contaminantes (ác.glutárico, resultante da oxidação). Para isto o glutaraldeido (ou aldeído glutárico) deve ser destilado. Os fornecedores de produtos especializados para microscopia eletrônica oferecem glutaraldeido bidestilado, em ampolas, mantidos em atmosfera de nitrogênio. Se houver material precipitado já ocorreu à oxidação e o glutaraldeído deve ser descartado. As soluções são fornecidas em concentrações de 8, 25 e 70% em ampolas de 10 ml. Mantenha as ampolas no congelador e use o conteúdo de 1 ampola de uma só vez. 
OBS: Glutaraldeido + Cafeína: Quando as células vegetais são fixadas com glutaraldeido seguindo pela tetróxido de ósmio, os fenólicos lixiviam dos vacúolos para o citoplama onde os mesmos subseqüentemente reagem com o OsO4. O resultado é um denso e osmofílico citoplasma, os detalhes do qual fica obscuro. Para evitar a lixiviação pode se utilizar a mistura de glutaraldeído com 1% de cafeína ou utilizar também a cafeína no tampão. 
PREPARO DO FIXADOR KARNOVSKY MODIFICADO.
Glutaraldeído 2,5%, formaldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,05M, pH 7,2, CaCl2 0,001M.
	SUBSTÂNCIA
	QUANTIDADE
	Glutaraldeído 25 %
	10 mL
	Formaldeído 10 %
	20 mL
	Tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,2
	25 mL
	CaCl2 0,1M
	1 mL
	Água destilada
	44 mL
 
PREPARO DO TETRÓXIDO DE ÓSMIO
Remover o rótulo da cápsula. Se precisar deixar de molho em água com detergente. Lavar bem; passar álcool, para retirar resíduos de gordura e enxugar com papel de filtro;
 Lavar a vidraria que será utilizada com capricho, inclusive a tampa. Usar vidros escuros com gargalo grande;
Antes de quebrar a cápsula, serrá-la superficialmente;
Colocar a cápsula de ósmio em vidro juntamente com o tampão ou H2O D (NESTE CASO A ÁGUA DEVERÁ SER FERVIDA E ESFRIADA TAMPADA), e quebrar a cápsula com um pilão de vidro.
Deixar descansar por 1 hora e depois guardar em freezer tendo o cuidado de manter um frasco de reserva.
DICA: preparar pelo menos um dia antes do uso.
Obs.: O OsO4 produz vapores extremamente cáusticos e que também enegrecem as superfícies expostas (principalmente o plástico). Assim deve ser manipulado em ambiente bem ventilado, e de preferência, em capela. O produto vem em forma de cristal, em ampolas de 1 g. É um reagente caro. Deve ser mantido em uma solução aquosa estoque e mesclada ao tampão apenas na hora do uso para evitar sua oxidação. Se a solução se tornar escura deve ser descartada. Pode-se preparar uma solução estoque de 2%, dissolvendo 1 g em 50 ml. Para isto, ferve-se previamente a água destilada para eliminar os gases. A ampola com OsO4 deve ser quebrada dentro do frasco que conterá a solução estoque (de vidro e com tampa esmerilhada) acrescentando-se a água previamente fervida e esfriada. Após o preparo, deve-se esperar um dia antes da utilização para que ocorra a dissolução total. Não conservar o frasco com solução estoque na geladeira, pois enegrecerá seu interior. Coloque o frasco dentro de um vasilhame maior (vidro de palmito usado), e mantenha-o na capela ou coloque no freezer. O OsO4 usado pode ser descartado em um frasco contendo etanol que o precipita, ou óleo de soja.
PARA REMOVER OsO4: Peróxido de hidrogênio ou ácido peróxido
10.3 Preparo de resinas
PREPARO DA RESINA DE SPURR
	
	FIRME
	DURA
	 MACIA
	LONGA VIDA
	ERL 4206
	10,0 g
	10,0 g
	10,0 g
	10,0 g
	DER 736
	6,0 g
	4,0 g
	8,0 g
	6,0 g
	NSA
	26,0 g
	26,0 g
	26,0 g
	26,0 g
	DMAE
	0,3 g
	0,3 g
	0,3 g
	0,2 g
Como preparar:
Colocar um Erlenmeyer de 125 mL ou um béquer de plástico sobre uma balança de precisão na capela e tarar. Em seguida com uma pipeta de plástico pesar o ERL 4206 e tarar e em seguida pesar o DER 736. Agitar na menor velocidade em um agitador magnético por 30 segundos. Em seguida pesar o NSA (DICA: escorrer na pipeta), levar para o agitador por 1 min. Pingar o DMAE e agitar mais um pouco.Limpar com álcool a balança, o peixinho e o agitador. Descartar as pipetas no pote de resíduo para resina. PODE-SE TAMBÉM PESAR TODOS OS COMPONENTES E AGITAR COM UM PALITO SEM FAZER BOLHAS ATÉ FICAR TOTALMENTE AMARELO.
10.4 Preparo de corantes para cortes semi finos
PREPARO DO AZUL DE TOLUIDINA/BORATO DE SÓDIO
Dissolver 1 g de borato de sódio em 99 mL de água destilada.
Acrescentar 0,5g de Azul de toluidina. Agitar
Manter em frasco escuro ou no abrigo da luz. Filtrar antes de usar.
11. Preparo de telinhas
11. 1 As telinhas ou grades
	Para observação em MET, os cortes são geralmente recolhidos em telinhas que podem ser de cobre, ouro ou níquel (para trabalhos com imunomarcação) ou outras ligas metálicas. Há telinhas com aberturas de diferentes formatos mais comumente quadrados ou hexágonos. Algumas têm a forma de fenda única e são úteis para observação de grandes áreas ou cortes em série, sem interrupção. Para isto devem ser revestidas com filme mais resistentes. As de formato quadrado, pequenos (por ex: 300 a 400 Meshs) podem ser utilizadas sem filme, possibilitando imagens com maior contrate. 
	11.2 O filme plástico
 
PREPARO DE FILME COM PARLODION 2%
Fazer isto em ambiente seco.
Preparar uma solução de Parlodion 2% em Acetato de amila. Em uma placa de Petri de 20cm colocar água destilada. Pigar uma gota da solução na superfície da água utilizando uma pipeta de Pauster (evitar deixar entrar bolha na pipeta). Em certos casos duas gotas podem ser necessárias. Neste caso, as gotas devem ser pingadas em seqüência. Esperar um tempo para ocorrer a evaporação do acetato de amila. Colocar as telinhas com o lado brilhante voltado para baixo, em contato com o filme, de modo a formar uma figura retangular. Cortar um pedaço de parafilm e colocar sobre as telinhas. Pegar o parafilm com as telinhas e colocar em uma placa de Petri com papel de filtro, sendo que as telinhas devem ficar voltadas para cima. Deixar de um dia para o outro. Cobrir o material com um filme de carbono.
OBS: O FILME DE CARBONO AUMENTA A RESISTÊNCIA DO FILME DE PARLODION E MELHORA O CONTRASTE. NA MICROSCOPIA DE VARREDURA AJUDA NA CONDUTIVIDADE.
PREPARAÇÃO DE TELINHA COM PELÍCULA DE FORMVAR
1- Limpeza das telinhas
a) Colocar as telinhas em um Becker com acetona.
b) Deixar no ultra-som por 5 min.
c) Tirar as telinhas do Becker, colocá-las sobre papel de filtro.
d) Deixar secando em estufa.
2) Preparação da película
a) Lavar uma lâmina de vidro sem uso e secar em estufa. Não se deve esfregar excessivamente com papel de filtro para evitar a formação de cargas eletrostáticas.
b) Mergulhar 2/3 da lâmina no FORMVAR. Aguardar alguns segundos e retirar num só golpe para evitar estrias. Esperar secar e cortar as margens com auxílio de uma lâmina de barbear, a aproximadamente 1-2 mm do bordo.
c) bafejar sobre a lâmina e mergulhá-la em Becker com água destilada, fazendo movimento de rotação no sentido vertical, à medida que a película for se despregando.
d) Colocar na água.
3) Colocar as telinhas sobre a película com o lado brilhante para baixo, mantendo uma distância uma das outras e tentando formar uma figura quadrangular. 
4) Pescar as telinhas com Parafilm ou papel de filtro.
5) Secar por um dia e cobrir com o filme de carbono.
6) Usar as telinhas com o lado brilhante para cima (lado com FORMVAR)
OBS: Quanto maior a concentração de FORMVAR, ou quanto menor a velocidade de retirada da lâmina da solução, maior seráa espessura da película. 
SOLUÇÕES PARA LIMPAR TELINHAS
	1) Solução com acetona:
	2) Solução com ácido clorídrico
	2 mL de acetona
	1 gota de HCl
	18 mL de água destilada
	20 mL de água destilada
TAMANHO DAS TELINHAS
	MESHS
	ÁREA/MESH
	300
	50 x 50 (m
	200
	80 x 80 (m
	100
	120 X 120 (m
12. Contrastação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão (MET). 
	Tecidos emblocados em resinas plásticas geralmente produzem pouco contraste e para melhorá-lo são tratadas com contrastantes. Os mais utilizados são a solução aquosa de acetato de uranila a cerca de 3% e citrato de chumbo.
12.1 – Técnicas de contrastação
Contratação em solução de Citrato de Chumbo (Reynolds, J. Cell Biology, 17:208 (1963).
A) PREPARO:Pesar : 1,33 g de nitrato de chumbo
			1,76 g de citrato de sódio
			30 mL de água destilada, previamente aquecida e resfriada, livre de CO2
- Agitar intermitentemente por 30 minutos. Vá adicionando NaOH 1N (8 mL) até clareamento da solução. A soda deve ser fresca e livre de CO2.
- OBS: Evitar a aspiração do pó de nitrato de chumbo durante a pesagem, bem como dos vapores liberados durante a agitação. ALTAMENTE TÓXICOS
B) USO DA SOLUÇÃO DE CITRATO DE CHUMBO
Gotas da solução de citrato de chumbo (3%) são colocadas sobre uma película de Parafilme, aderida ao fundo de uma placa de Petri (manter tampada a placa). Abrir a placa com cuidado para evitar a aspiração dos vapores e colocar, com auxílio de pinças apropriadas, as grades com os cortes voltados para baixo para a contrastação. Aguardar de 3 A 10 min. para retirar as grades, lavando-as em uma serie de 3 beackers de 100 mL, contendo água destilada. Em seguida secar e observar em MET.
OBS: Evitar a aspiração dos vapores liberados, bem como, contato com o resíduo de citrato de chumbo que aderem à pinça, à placa de Petri e à película.
Contrastação em Acetato de Uranila.
a) Faça a solução a 2% de acetato de uranila com água destilada. 
b) Conserve em frasco escuro ou seringa em local escuro e filtre quando for utilizar em filtro Millipore 0,2.
c) Usar o mesmo processo do citrato de chumbo.
Contrastação em ácido tânico.
Preparar uma solução de 0,3% de ácido tânico em água destilada.
Aquecer a solução a 60o C e colocar as telinhas com os espécimes por 5 min, antes da contrastação com citrato de chumbo.
13- Técnicas rápidas (Leaf dip)
	Algumas vezes, e para determinadas finalidades (como a visualização de vírus e algumas organelas das células) é possível a preparação de amostras para MET sem um completo processo de fixação. Neste caso o tecido vegetal é picado em fragmentos que são mergulhados em uma gota do contrastante e depois de 1-2 min, flutua-se sobre a gota uma telinha com o lado da película voltado para baixo. Aguardar 1-2 min, remover o excesso de líquido e depois de seco o material pode ser observado. Uma variação da técnica pode ser utilizada colocado a telinha primeiro sobre a gota da suspensão e depois no contrastante. Muitas vezes para se evitar a oxidação utiliza-se preparar as amostras em tampão.
	A visualização de material em suspensão como bactérias, vírus purificados, também pode ser feita da mesma forma.
15- Técnicas de Imunomarcação.
	Estas técnicas baseiam-se na especificidade antígeno/anticorpo. A variante mais utilizada atualmente é o do uso de ouro coloidal como marcador, em secções de tecidos emblocados em resinas apropriadas (LRWhite, LRGold, Lowicryl), que permitem melhor acesso dos anticorpos aos antígenos. O tecido deve ser fixado apenas em aldeídos (OsO4 pode inativar os antígenos), emblocados e seccionados. As secções são postas para flutuar sobre a solução de anticorpo (que pode já estar conjugado com ouro coloidal, mas geralmente faz-se uma marcação indireta, em que o anticorpo é detectado por um anti-anticorpo ou proteína A, conjugados ao ouro coloidal. Os grãos de ouro coloidais, que podem variar de 5 a 20 nm de diâmetro, indicam a presença do antígeno. Várias substâncias podem ser detectadas na amostra, como proteínas, enzimas e com certos artifícios carboidratos. Esta técnica é de grande utilidade pois permite determinar a natureza dos constituintes da amostra.
16- Protocolos
PROTOCOLO PADRÃO PARA MET DO LME (Resumo)
	As amostras, depois de coletadas, devem ser cortadas em pedaço com no máximo 2mm sedo o volume ideal de 0,5 mm3 e imersos em solução fixativa (Karnovsky`s modificado), pH 7,2 por um período de 24 h (este período pode ser estendido por semanas), lavados em tampão cacodilato (três vezes de 10 min para retirar os resíduos de glutarldeído que podem reduzir o tetróxido de ósmio), pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% em água (misturar volumes iguais de tetróxido de ósmio 2% (estoque) em tampão cacodilato 0,1 M) por 1 hora (no máximo 4 horas), a temperatura ambiente em uma capela, lavados por duas vezes de 15 min em água destilada, transferidos para solução a 0,5 % de acetato de uranila durante 12h a 4(C e em seguida, lavados novamente em água destilada e desidratados em gradiente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100 % por três vezes). Em seguida, o material deve ser incluído em gradiente crescente de Spurr/acetona 30 % (8h), 70 % (12h) e 100 % duas vezes por 24 h cada, sendo os espécimes montados em moldes e colocados para polimerizar em estufa a 70 (C por 48 h. 
METODOLOGIAS PARA PREPARAÇÃO DE ESPOROS PARA TEM.
MÉTODO 1: Esporos são colhidos e centrifugados a 3000g e lavados 2 vezes em água destilada. Em seguida estas são re-suspendidos em 2% de ágar derretido e solidificado na geladeira. O agar é cortado em cubos de 1mm e fixados com 15% de formaldeído em tampão fosfato 0,1M (pH 7,2) por duas horas a temperatura da sala. Os cubos são transferidos para glutaraldeído 6% no mesmo tampão por 2 horas. Após a lavagem em tampão, os cubos são pós-fixados com 1% de OsO4 no mesmo tampão por 2 horas. A adição de Dibutil fosfato a resina do Spurr permite o corte de finas secções das paredes de ascos e esporos dos ascomicotina.
METODO 2: PARA ESPÓROS DORMENTES: A PENETRAÇÃO DO FIXADOR É UM PROBLEMA NESTE CASO. Este método pode ser útil. Esporos dormentes são lavados 5 vezes em água deionizada por centrifugação. Os esporos prefixados com 5% de glutaraldeído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2) por 5-8 horas á 4oC e centrifugados a 1500g. Após ser lavados 5 vezes com tampão 0,05M, os peletes são fixados com 1% de OsO4 em tampão por 3 dias a 4oC e logo lavados por centrifugação. A pós-fixação é acompanhada com 2% de KMnO4 em água deionizada por 3 horas a 4oC. Os esporos são lavados repetidas vezes com tampão 0,05M e centrifugadas até a cor púrpura do supernadandte estar ausente. Os esporos são suspenso em 2% de agar derretido, e logo solidificado e cortado em cubos de 1 mm para desidaratação.
PREPARAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA TEM
1- Bactérias em meio de cultura sólido; 
2- Suspensão em PBS -1mL (105 a 106);
3- Centrifugação a 1200g por 15 min.;
4- Os pelletes são resuspendidos em 1mL de PBS;
5- 0,5 mL são transferidos para uma cápsula embebida em polypropileno;
6- Centrifugar a 2100g por 20 min.;
7- O supernadante é removido e colocado em uma igual quantidade de 4% de glutaráldeido em 0,2 M PBS;
8- Remover totalmente uma substância antes de colocar a outra;
9- Secar a cápsula em disco de papel;
10- Após 1 hora os pelletes são lavados por 3 vezes em tampão PBS;
11- Colocar 90 min. em OsO4;
12- Lavar em PBS por 3 vezes e desidratar normalmente.
LOCALIZAÇÃO DE AMILASE
Fixação por 2 h a 4º C em glutaraldeído 0,3% e paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M ( glutaraldeído 0,6% + t. fosfato 0,2M 1:1 paraformaldeído 8%);
Lavagem 5 vezes 20min. a 4º C em tampão fosfato;
Desidratação em etanol: 5 vezes de 5 min. em 70%, 2 vezes de 10 min. em 90% (agitando)
Embebição: LRWhite –Etanol 1:1, 2 vezes de 10 min. agitando, LRwhite puro over night à 4ºC
No outro dia LR White, 3 vezes de 10 min. girando
OBS: usar tela de níquelpara não oxidar
Os cortes devem ser feitos até 24 horas antes do início do processamento.
IMUNOMICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VIRUS
Prefixação em 1% de acroleina em tampão fosfato 0,1M (pH 7,4) por 10 min. a 4oC. Células são lavadas 3 vezes em PBS e incubados por 30 min. a temp. ambiente em 30 a 50 (L de antisoro diluído 1:10 a 1:64 ou com similar quantidade de antiso conjugado com ferritina ou peroxidase. As células são então fixadas em glutaraldeido em tampão por 30 min.
Para imunoferritina o material ainda deve ser fixado em OsO4 por 30 min. á 4oC.
CURIOSIDADE: As fixações químicas, desidratações e embebições levam a distorções das atividades biológicas. A crioultramicrotomia foi desenvolvida para minimizar este efeito adverso. 
EMBEBIÇÃO DE ASCOMYCETES
As paredes dos ascos e esporos de ascomycetes são difíceis para seccionar devido sua pobre embebição em um meio Epon de média dureza. Esta dificuldade pode ser sobreposta pelo uso do seguinte meio (Merkus et al, 1974)
ERL 4206 		 10 g
DER 736 		 6 g
NSA 		 26 g
DMP-30 		 0,4 g
DIBUTYLPHTHALATE 0,8 g
Este meio é infiltrado dentro de um espécime via acetona após desidratação com etanol. A polimerização é acompanhada por 12h a 70o C.
17- Instruções sobre o uso dos aparelhos do LME
[Atenção: Anote no caderno ao lado do aparelho data/hora/nome do usuário]
17.1- Uso do evaporador de fio de carbono (BALZERS CED 020)
	Este aparelho é usado para reforçar a película de Formvar ou collodium sobre telinhas para MET. Passos:
1 – Preparando o evaporador: 
A) preparação do fio – dois tipos de preparação podem ser utilizadas a simples que permite uma camada mais fina e a dupla que permite a obtenção de uma camada mais espessa. Na simples o fio é passado na parte interna de um pólo e na externa do outro. No duplo o fio sai da parte externa de um pólo passa em volta do outro pólo e retorna por cima do primeiro fio formando um X. 
B) As telinhas com a película de plástico, que se encontram sobre um papel de filtro deve ser colocadas no interior do cilindro de vidro.
C) Ajuste do cabeçote – o cabeçote deve ser colocado sobre o cilindro de vidro, verificando se a borracha de vedação não está dobrada. 
D) Conexão dos cabos - os cabos devem ser conectados em ambos os orifícios existentes na parte superior do cabeçote
E) Ajuste da distância de trabalho – Maiores distâncias permitem uma camada mais fina e menores camadas mais espessas. No entanto, se o espécime a ser coberto pela camada de carbono estiver muito próximo pode ocorrer à queima do mesmo devido ao alto calor. UMA DISTÂNCIA APROXIMADA DE 40 mm (4cm) TEM PROPORCIONADO BOA ESPESSURA DE CAMADA.
2 – Fazendo a metalização: Depois de ajustada a distância de trabalho ligue a chave MAIN (verde) (7), a qual também liga automaticamente a bomba de vácuo. Em seguida deve se aguardar até o vácuo atingir um bom nível (ex. 0,02 mbar). Feche o diafragma para proteger o espécime. Lentamente aumente a corrente no transformador ( 5 ) até o fio de carbono começar a ficar rubro. Aguarde 15 a 20 sec. OBSERVE QUE A VÁCUO IRÁ CAIR UM POUCO. ESPERE O VÁCUO RETORNAR. Volte o transformador para 0. Então abra o diafragma e evapore o carbono apertando HIGH CURRENT (6). Aguarde aproximadamente 3 sec. Para o fio simples e 6 segundos para o fio duplo. Logo depois o aparelho pode ser desligado chave MAIN. Aguarde até o vácuo ser quebrado para retirar as amostras.
Figura 7. Foto do evaporador de carbono: 1 = cabeçote do compartimento de evaporação, 2 = compartimento de evaporação (cilindro de vidro), 3 = borracha de vedação, 4 = vacuometro, 5 = botão de aquecimento do fio de carbono (gira) e 6= botão de evaporação (vermelho - aperta), 7= botão de liga-desliga, 8 = regulador da altura da mesa porta espécime e 9 = mesa porta espécime. 
17.2- Uso do ´knife maker II `da Leica.
OBS: NÃO ALTERE, EM HIPOTESE ALGUMA, OS AJUSTES DO APARELHO.
Preparo das barras de vidro para o corte
Passos:
1- Retirar as barras de vidro da caixa, retirar o papel e lavá-las em uma solução com pouco detergente. NÃO TOQUE NOS BORDOS DA BARRA. 
2 - Enxágüe bem as barras inicialmente com água de torneira e depois com água destilada. 
3- Secar com cuidado usando um pano sem fiapos.
4 – Coloque as barras sobre um papel toalha para finalizar a secagem.
Obtenção de quadrados das barras de vidro
Depois de lavada e seca a barra pode ser inserida no knifemaker. Para isso é importante verificar se o riscador de diamante está todo inserido e se a alça da pressa está toda voltada para traz (sentido anti-horário).
Insira a barra de vidro com o lado riscado para baixo até tocar no pino no canto esquerdo da máquina. Prenda a barra usando o suporte de localização
Mova a prensa para baixo, com cuidado, até prender a barra sem, no entanto fazer muita força.
Selecione a posição mostrada abaixo no botão posicionado no cabeçote. �
Puxe o riscador de diamante num só movimento. NÃO O RETORNE
Gire a alavanca de quebra para cima lentamente até o vidro quebrar. Em seguida retorne-a para a posição inicial.
Com a mão direita segure a cabeçote da prensa e com a esquerda gire a alavanca para traz.
Remova uma das barras de 200mm e posicione a outra de tal modo que a ponta da mesma entre em contato com o segundo pino do lado esquerdo
Repita os passos de 3 a 7 novamente
Selecione uma das barras de 100mm e coloque a mesma em contato com o terceiro pino e repita os passos de 3 a 7.
 Selecione uma das barras de 50mm, coloque o garfo de mão entre os pinos e posicione-a, em contato com o quarto pino. Repita os passos de 3 a 7. Retire o quadrado da esquerda com o garfo de mão.
Continue a fazer quadrados de 25mm até finalizar a barra. SE ALGUM QUADRADO APRESENTAR BORDOS IRREGULARES DESCATE-O. Não toque nos bordos do quadrado.
Obtenção de navalhas: 
1- Empurre a presilha do lado de traz para a posição mais externa e verifique se a escala do garfo está na posição 8.
2- Alinhe o quadrado na diagonal. Com os dois cantos na direção das presilhas dos garfos com o auxílio do garfo manual.
3- Use a mão esquerda para segurar o quadrado e a mão direita para mover a presilha do lado de traz cuidadosamente de volta.
4- Abaixe o cabeçote da prensa e trave. Sem fazer muita força.
5- Selecione o riscador na posição longo simétrica.
�
6- Puxe o riscador num só movimento. NÃO O RETORNE.
7- Empurre o garfo com borracha até tocar o canto do quadrado fazendo uma pequena endentação sobre a borracha.
8- Mova a prensa lenta e uniformemente para quebrar o quadrado. Logo retorne a mesma para a posição de descanso.
9- Retire o garfo com borracha.
10- Retire as navalhas com o garfo manual e retorne o riscador.
11- Guarde com cuidado as navalhas, sem tocar nos bordos.
Figura 8. Desenho do Knifemaker com suas partes.
17.3- Uso do Ultramicrótomo Reichert-jung – Ultracut.
	Antes de utilizar o ultramicrótomo é importante que você familiarize-se com o nome e a função das partes do aparelho apresentadas na Figura 9. LEMBRE-SE QUE ESTE É UM APARELHO CARO E NECESSITA QUE SE TENHA CUIDADO NA OPERAÇÃO PARA NÃO DANIFICA-LO.
	Após ter-se familiarizado com o aparelho podemos iniciar o processo de uso do mesmo para a obtenção de cortes.
Pressione o botão vermelho (53) na unidade controle;
Pressione o botão branco SL (52) para acender a luz superior e o botão laranjado ( (51) para ligar a luz inferior;
Gire a parte superior do aparelho (26) para a esquerda;
Deslize a alavanca (6) para a esquerda e retorne o suporte da navalha (9/10) para a posição mais externa;
Levante a trava do volante manual para a posição superior e gire o volante até o mesmo parar;
Deslize o botão interno do volante até o ponto vermelho (definição da área a ser cortada);
Inserir o bloco com seu espécime na peça (37) e trave usando a chave localizada na mesa do aparelho (42);
Ajuste a navalhano porta-navalha, tendo o cuidado de regular o ângulo para 5-6 º (ou conforme recomendação do fabricante da navalha) com o botão (41);
Retorne a parte superior do aparelho, ajuste o zoom da ocular para mínimo e desloque o suporte da navalha até a mesma aparecer no centro da imagem obtida na ocular e mova a alavanca (6) para a posição FIX; posicione o bloco com a parte maior a ser cortada para baixo.
 Com o cursor (3) movimente a navalha em direção ao bloco lentamente. Vá movimentando o bloco com o volante para facilitar a aproximação. Com os botões 36 e 45 vá ajustando o bloco e a navalha, respectivamente de modo que os dois se posicionem paralelamente um ao outro. À medida que ocorre a aproximação, observe que irá formar uma sombra na mesa de corte do bloco a qual vai cada vez se tornando mais próxima e desaparece (posição de corte);
Complete a barca com água destilada utilizando uma pipeta da ponta fina. O nível ideal é quando uma imagem brilhante é observada na ocular;
A aproximação final é feita girando com sincronia o volante e a roda 40 no sentido horário. Repita o movimento até observar o início de corte. Neste momento pare retire os corte que já se depositaram na superfície da água. 
Complete novamente o volume, posicione o botão de ultra-alimentação automática (48) no botão vermelho e o de micro-alimentação (38) na posição verde. Em seguida selecione a velocidade de corte para 90mm/segundos. no botão 54. Para iniciar o corte leve a alavanca 12 para posição mais inferior. Observe na ocular sem respirar forte, quando iniciarem os cortes insira a peça de acrílico para evitar interferência de correntes de ar. 
Após obter os primeiros cortes gire o botão 38 para a posição 0 para obter cortes ultra finos.
Boa secções serão obtidas a partir do 3 a 5 cortes. Estes terão a coloração ouro ou prata.
Para parar de cortar levante a alavanca 12 para a posição intermediaria. Porem só faça este movimento depois que o corte foi obtido. 
Figura 9. Desenho do ultramicrótomo com indicação de suas partes.
17.4- Uso do MET ZEISS EM 109
OBS: 
1- ANOTE NO LIVRO DOS USUÁRIOS A DATA, SEU NOME E O TEMPO DE UTILIZAÇÃO DO MET.
2 - NÃO CONTINUE SE TIVER DÚVIDAS. CHAME ALGUÉM DO LABORATÓRIO. NUNCA FORCE BOTÕES.
3 - SE OCORRER ALGO INESPERADO CHAME ALGUÉM! 
4- LEMBRE-SE QUE O MICROSCÓPIO ELETRÔNICO É UM APARELHO DELICADO QUE EXIGE TODA SUA ATENÇÃO E CUIDADO NO MANUSEIO.
5 - PARA O USO DO APARELHO É NECESSÁRIO FAZER RESERVA COM ANTECEDÊNCIA, ANOTANDO NA FOLHA JUNTO À PORTA DA SALA DO MET, ALÉM DE ESTAR HABILITADO.
6 - SÓ OPERE QUALQUER PARTE DO APARELHO COM ELE LIGADO.
Ligando o aparelho: Esta é uma etapa que deve ser executada pelo pessoal do laboratório.
Passos:
1- Ligar a bomba de refrigeração:
a) Abrir o registro da direita;
b) Inserir a tomada na parede;
c) Observar o barulho da bomba funcionando.
2 – Ligar o microscópio EM - 109.
a) Depois de ter ligado a bomba de refrigeração, gire a chave (canto esquerdo do aparelho) para a posição II (80 KV mais utilizado) e observe o barulho da bomba de vácuo funcionando. A POSIÇÃO I DEVERÁ SER UTILIZADA PARA OPERAR A 50KV;
b) Aguarde até o vácuo atingir um valor suficiente (acima de 10 -5) para o funcionamento do aparelho (Luz V3 verde irá acender NO PAINEL LADO ESQUERDO E NA COLUNA LADO DIREITO);
c) Observe se alguma luz vermelha não acendeu no painel. 
Se acender: 	IG – Pump – a bomba de vácuo deve estar com defeito;
		Change Filament – o filamento deve ter queimado;
		Water – o sistema de refrigeração está com problema (DESLIGUE O APARELHO IMEDIATAMENTE);
		Close V3 – indica que o vácuo está ruim em alguma parte do aparelho (FECHE a válvula V3);
		Lock in – indica que o vácuo está bom para acabar de introduzir a eclusa
3- Operação do aparelho:
a) Conhecendo o aparelho: Acompanhe na Figura 10 a função das teclas e botões do aparelho.
PAINEL DO LADO ESQUERDO:
MAGNIFICATION: este botão apresenta 3 posições na parte de baixo e 5 na parte de cima:
I – 150 a 1100 vezes de aumento (A lente objetiva deve ser retirada, pois não trabalha nesta posição).
II – 3000 a 20.000 vezes
III – 30.000 a 250.000 vezes
BRIGHTNESS: o botão maior regula a quantidade de elétrons e o menor concentra o feixe de elétrons da lente condensadora.
VENT: Tecla para arejamento da coluna quando troca filamento.
VENT-CAM: Tecla para arejamento da câmara eletrográfica – usado para trocar o filme.
PUMP LOCK: Pressiona esta tecla antes de introduzir o porta espécime.
STIG OBJ 1-2: Para ajustar o astigmatismo da objetiva
FIL: Liga o filamento
ALTA TENSÃO: �
PAINEL DO LADO DIREITO:
FOCUS: Ajuste médio e fino do foco. A parte inferior (ajuste médio) e a parte superior (ajuste fino)
COARSE: Ajuste grosso do foco
P1 STIG: corrige o astigmatismo da projetiva
C2 STIG: corrige o astigmatismo da condensadora
BEAM ALIGNMENT: Alinha o feixe no centro do ECRAN. Observe o ponto no ECRAN menor.
IMAGING MODE: Deve estar sempre no N.
LIGHT: Regula a luz do painel.
COLUNA:
 De cima para baixo: 
1) condensadora a)mais externa- para grandes aumentos, b) médio aumento e c) baixos aumentos;
 2) objetiva = diafragma de contraste
3) Projetiva: 1) para aumentos acima de 12.000, 2) para aumentos acima de 20.000 e 3) para aumentos acima de 85.000. 
b) Operando o aparelho:
B-1 ) Introduzindo a amostra no aparelho
- Aguarde a válvula V3 acender;
- retire a eclusa, pressionando para cima a extremidade vermelha do pino-suporte da pré-câmara do espécime, trazê-lo para a posição mais externa. Em seguida virar e encaixar o pino suporte no sulco apropriado;
- abrir a pré-câmera girando o disco denteado para a esquerda;
- com as ferramentas, que estão na gaveta, retire o trenó porta-espécime. SEM TOCAR COM OS DEDOS, colocar o trenó no suporte e firmar seu cabeçote na posição vertical com a chave apropriada;
- abra o compartimento para telinha com a chave apropriada e com o auxílio de uma pinça, retire a telinha existente e guarde;
- pegue a nova telinha que contém o espécime a ser observado e coloque no porta-espécime COM O LADO PRATEADO PARA CIMA;
- coloque a rosca de contenção novamente;
- voltar o trenó na posição horizontal e introduzi-lo na pré-câmara;
- Desenroscar a chave. Dar uma batidinha no porta espécime para dentro com a chave, para verificar se está todo introduzido;
- fechar a pré-câmara girando o disco dentado todo para a direita.
B-2) Ligando o filamento:
-Depois de fechar a porta do porta-espécime, gire o pino vermelho da eclusa para a posição 90 º aperte a tecla LOCK (lado esquerdo do painel) e aguarde até a luz verde do LOCK-in acender;
- acabe de introduzir o espécime (APERTE O PINO VERMELHO, GIRE PARA BAIXO E ENPURRE SEM FAZER FORÇA, MAS COM RAPIDEZ). Aguarde até o vácuo atingir o valor necessário.
- Abrir V3 (Esta deve estar acessa na coluna do aparelho e no painel)
- ligar alta tensão (botão da direita em baixo)
- ligar filamento (botão do centro em baixo)
B-3) Localizando o espécime
O aparelho deve estar no aumento de 3000X, coloque o BRIGHTNESS no penúltimo ponto da direita (BOTÃO DE BAIXO) e gire o botão de cima para a esquerda até aparecer luz. MANTENHA ESTA LUMINOSIDADE BAIXA ATÉ LOCALIZAR A POSIÇÃO A SER OBSERVADA, para evitar danos a sua amostra. Com os dois volantes (Charriot) existentes nas laterais do compartimento do ECRAN em baixo movimentar a amostra até localizar a área a ser observada. Vá aumentando (MAGNIFICATION) e ajustando o foco no FOCUS e ajustando brilho e contraste no BRIGHTNESS. Quando localizar algo que se queira fotografar inserir a câmera CCD e abra o programa de captura de imagem (INSTRUÇÕES ABAIXO).
3 – Desligando o aparelho.
a) Girar o botão do condensador todo para a direita (botão superior do BRIGHTINESS) e coloque o botão de baixo no centro.
b) colocar o aumento em 3000 X (MAGNIFICATION)
c) colocar BRIGHTNESS no meio (botão de baixo)

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