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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/268422657 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS Article · August 2008 CITATIONS 0 READS 5,321 8 authors, including: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: Infectious diseases View project Triazene analogues for treatment of solid tumors View project Maria Eugénia M Cruz University of Lisbon 74 PUBLICATIONS 1,363 CITATIONS SEE PROFILE Barbara Martins University of Lisbon 44 PUBLICATIONS 460 CITATIONS SEE PROFILE Manuela Gaspar University of Lisbon 55 PUBLICATIONS 689 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Manuela Gaspar on 19 January 2015. The user has requested enhancement of the downloaded file. ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS Maria Eugénia M. Cruz, Maria Bárbara Martins, Maria Luísa Corvo, Maria Manuela Gaspar, Edna Maria Morais Oliveira e Maria Antonieta Ferrara SUMÁRIO Ouso terapêutico de enzimas remonta ao final do século 19, quando preparações bru- tas de enzimas pancreáticas de origem suína já eram empregadas no tratamento de de- sordens gastrointestinais. Atualmente, existe nomercado uma ampla variedade deme- dicamentos à base de enzimas para aplicação como auxiliares digestivos, antiinflamató- rios, tratamento de coágulos sangüíneos, câncer, fibrose cística, gota e deficiênciasme- tabólicas, dentre outras. Como exemplos podem ser citados o uso de estreptoquinase como agente antitrombótico, de asparaginase no tratamento de leucemia e de glicoce- rebrosidase no controle da doença de Gaucher. Outro importante uso terapêutico das enzimas é na ativação seletiva de pró-fármacos, uma alternativa de superação da toxicidade de determinados quimioterápicos. Odesenvolvimentodenovas estratégias de formulação envolvendoo confinamento em sistemas de transporte e direcionamento, comoos lipossomas, ou conjugação quími- ca commoléculas de baixopesomolecular oupoliméricas, comoopolietilenoglicol, per- mite contornar limitações relacionadas à instabilidadedos biocatalisadores, suscetibilida- de ao ataque de proteases, dificuldade de acesso ao órgão alvo e antigenicidade. O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimática nos últimos anos deve-se à identificação, purificação e caracterização de enzimas emetabólitos rele- vantes e ainda ao advento das técnicas de DNA recombinante e de processos de produ- ção em larga escala que possibilitam a produção de enzimas em grandes quantidades e com custos mais convenientes. 1ª prova 305 13 Da mesma forma, o uso de enzimas em diagnósticos foi facilitado pelos avanços recentes e, atualmente, muitos enzimas com elevada especificidade ao substrato fo- ramdesenvolvidas e são empregadas comocatalisadores emdiagnósticos em três cate- gorias: métodos enzimáticos de ensaio para análises clínicas, enzimas marcadoras em imunodiagnóstico e enzimas cujos níveis são avaliados para diagnósticos clínicos de doenças. Novos usos terapêuticos e em diagnósticos, ainda em fase de pesquisa, represen- tam umpotencial que pode repercutir demaneira aindamais significativa nomercado mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilhão de dólares por ano. INTRODUÇÃO A alta especificidade e eficiência catalítica das enzimas são características importantes que alicerçam sua aplicação como agentes terapêuticos. Assim sendo, a relevância do uso de enzimas comomedicamento relaciona-se ao fato de que pequenas quantidades do catalisador biológico podem produzir efeitos bastante específicos em condições fisiológicas. O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimática nos últimos anos deve-se principalmente à identificação, purificação e caracterização de enzimas e metabólitos relevantes e ainda ao advento das técnicas deDNA recombinante e de pro- cessos de produção em larga escala, que possibilitam a obtenção de elevados rendimentos, em larga escala e com custos relativamente baixos. Damesma forma, o uso de enzimas emdiagnósticos foi facilitado pelos avanços re- centes e, atualmente,muitas enzimas comelevadaespecificidadeao substrato foramde- senvolvidas e são empregadas como catalisadores em diagnósticos. USO DE ENZIMAS COMO MEDICAMENTOS As primeiras preparações enzimáticas industrialmente produzidas e comercializadas ti- verama finalidadede atuar comoauxiliares digestivos. Assiméque, já antes daPrimeira Guerra Mundial, Takamine comercializou uma preparação enzimática denominada “Takadiastase”, que era produzida por fermentação semi-sólida pelo fungo Aspergillus oryzae. Este produto, que ainda hoje é comercializado, contém hidrolases como amilases e proteases, sendo utilizado como auxiliar digestivo (BURKE, 2003). Atualmente, existe nomercado uma ampla variedade demedicamentos à base de enzimas (HAMMER, 2001) para aplicação como auxiliares digestivos, antiinflamatóri- os, anti-sépticos, na reposição de enzimas hemostáticas, na inibição da coagulação, na prevenção de lesões de reperfusão, no tratamento da icterícia neonatal, no tratamento de fibrose cística, na reposição de enzimasmetabólicas e na terapia do câncer. A tabela 13.1 relaciona algumas enzimas com importantes atividades terapêuticas. ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO306 1ª prova Tabela 13.1 Exemplos de enzimas terapêuticas (TRAMPER e POULSEN, 2000; CHAPLIN, 2002, MARSHALL et alii, 2003;WALSH, 2003) Enzima Número EC Reação Uso/indicação terapêutica Asparaginase* 3.5.1.1 L-asparagina + H2O � L-aspartato + NH3 Leucemia Colagenase 3.4.24.3 Hidrólise de colágeno Úlceras de pele Fator VII 3.4.21.21 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo Hialuronidase 3.2.1.35 Hidrólise do hialuronato Ataque cardíaco Lisozima 3.2.1.17 Hidrólise da parede celular bacteriana Antibiótico Rodanase 2.8.1.1 S2O32- + CN- � SO32- + SCN- Envenenamento com cianeto Ribonuclease 3.1.26.4 Hidrólise de RNA Antiviral �-lactamase 3.5.2.6 Penicilina � peniciloato Alergia a penicilina Estreptoquinase 3.4.22.10 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo Tripsina 3.4.21.4 Hidrólise de proteína Inflamação Uricase* 1.7.3.3 Urato + O2 � alantoína Gota Uroquinase 3.4.21.31 Plasminogênio � plasmina Coágulo sangüíneo Superóxido dismutase 1.15.1.1 Radical superóxido � peróxido de hidrogénio + O2 Inflamação �-glucocerebrosidade* 3.2.1.45 Terapia de reposição enzimática Doença de gaucher Galactosidase* 3.2.1.23 Terapia de reposição enzimática Doença de Fabry Catalase 1.11.1.6 peróxido de hidrogénio � H2O + O2 Inflamação / stress oxidativo * aprovadas para uso clínico Aterapia enzimática apresenta, entretanto, algumas limitações relacionadas coma instabilidade dos biocatalisadores, suscetibilidade ao ataque de proteases, dificuldade de acesso ao órgão alvo e antigenicidade. Esta última está associada à presença de uma proteína estranha ao organismo, o que pode causar resposta imune, provocando rea- ções alérgicas severas, particularmente com o uso contínuo. Diversas estratégiasde formulação têmsidodesenvolvidasno sentidodecontornar essas limitações. Dentre elas podem ser citadas a incorporação da enzima em sistemas de transporte/direcionamento, comoos lipossomas e a conjugaçãoquímica commolé- culas de baixo peso molecular ou poliméricas, como o polietilenoglicol. CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 307 1ª prova Ao contrário das enzimas de uso industrial, as enzimas terapêuticas são requeridas em quantidades relativamente pequenas, devendo apresentar, entretanto, elevado graudepureza, alta especificidade, baixa antigenicidadeeestabilidadeemcondições fi- siológicas. Com relação às propriedades cinéticas, a constante de Michaelis (Km) deve ser baixa e a velocidademáxima (vmax) elevada,de forma a se obtermáxima eficiência mesmo em condições de concentrações muito baixas de enzima e substrato. As fontes de obtençãodas enzimas terapêuticas devem ser selecionadas de forma a se evitar qualquerpossibilidadede contaminação indesejada.De acordo coma finalida- de, as formulaçõesque contêmenzimaspodemser administradaspor via tópica, oral ou parenteral. As enzimas administradas por via parenteral devem apresentar grau de pu- reza especialmente elevado, o que se reflete no custo. As preparações enzimáticas de uso terapêutico são em geral liofilizadas e contêm sais tamponantes biocompatíveis e manitol como excipiente. Aplicações Enzimas digestivas Desdeo final do século 19, preparações brutas de enzimaspancreáticas deorigemsuína vêm sendo empregadas no tratamento de desordens gastrointestinais (TRAMPER e POULSEN, 2000). Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medica- mentos à base de enzimas para problemas digestivos. Estes medicamentos podem con- ter em sua formulação, além de proteases, amilases, lipases, celulases, sais biliares e outros. Enzimas em doenças inflamatórias As enzimas proteolíticas também são amplamente empregadas como agentes antiinfla- matórios. A reduçãode inflamação e edemaé atribuída àdissoluçãode fibrina e à elimi- nação de fragmentos protéicos presentes em exudatos inflamatórios. Como exemplos, a papaína produz redução significativa de inflamação e inchamento obstétricos e de edema pós-cirúrgico dental; colagenase, enzima que hidrolisa seletivamente colágeno, é utilizada para tratamento de úlceras dérmicas e queimaduras; tripsina e quimiotripsi- na vêm sendo empregadas no tratamento de trauma pós-operatório, ferimentos espor- tivos, e ciática (BICKERSTAFF, 2003); enzimas proteolíticas (bromelina, papaína, trip- sina e quimotripsina) administradas por via oral apresentam efeito analgésico e antiinflamatório em pacientes com problemas reumáticos (LEIPNER, 2001). Em adição, as doenças inflamatórias das articulações têm sido intensamente estu- dadas no que diz respeito ao possível envolvimento de situações de stress oxidativo (de- sequilíbrio entre a produção de formas reativas de oxigênio e os respectivos sistemas de defesa) (HALLIWELL, 1995, HENROTIN et alii, 1992; MERRY et alii, 1989, MAPP et alii, 1995). O envolvimento destas situações de stress está na base da chamada terapia antioxidativa, que utiliza agentes antioxidantes, entre os quais enzimas antioxidantes, como agentes terapêuticos (MATES et alii, 1999). ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO308 1ª prova Uma das enzimas propostas como agente terapêutico para inúmeras doenças nas quais as formas reativas deoxigênio têmumpapel importante é a superóxidodismutase (SOD).Diversos estudos têmsido conduzidospara tentar esclareceropossível papel be- néficodesta enzimana reduçãodedanosde tecidos emdoenças inflamatórias crônicas, nasquais se inclui a artrite reumatóide (REGNAULTet alii,1996).Apropostadousode SODbaseia-senahipótesedequeumaumentoda concentraçãoextracelulardaenzima diminuiria a quantidadede superóxidoproduzidoporneutrófilos ativados, impedindo destemodoquerpossíveis danosprovocadosporeste radical, quer a suapossível ativida- de quimiotática (BARET et alii, 1984). As limitações potenciais para o uso de SOD como agente terapêutico são a sua rápida eliminação do sangue por filtração glomeru- lar (GREENWALD, 1991;Dowling et alii, 1993; TAKAKURA et alii, 1994) e o seu tempo de meia-vida muito reduzido (SOD de origem bovina - 6 min no rato (HUBER et alii, 1977) e 30 min em humanos (HUBER et alii, 1980)). Enzimas em oncologia Uma importante estratégia para o combate ao câncer consiste em explorar as diferen- ças bioquímicas entre as células normais e as células neoplásicas. Estas últimas apresen- tam alterações substanciais em seus perfis metabólicos que estão relacionadas ao au- mento da síntese de proteínas e dos ácidos nucléicos e à eliminação ou limitação da sín- tese de moléculas conhecidas como “blocos construtores”, como os aminoácidos, por exemplo, levando à dependência do suprimento externo destas substâncias. As enzi- mas podem ser empregadas para esgotar o organismo de um determinado nutriente, privando, seletivamente, as célulasneoplásicas donutriente, semafetar células e tecidos normais. A L-asparaginase, por exemplo, é uma enzimamuito eficaz no combate a leucemi- as linfocíticas (linfomas) porque esgota os estoques de asparagina circulante,metabóli- to essencial para as células tumorais em contraposição às células normais, que são capa- zes de sintetizar este aminoácido. Um grande impulso na terapia enzimática do câncer surgiu da observação de Broome (1961), que identificou como sendo a asparaginase o fator antilinfoma presente no soro de porquinhos da Índia. Subseqüentemente, foram identificadas fontes bacterianas e vegetais da enzima (MÜLLER e BOOS, 1998; WRISTON e YELLIN, 1973). A asparaginase foi introduzida no mercado em 1978. As formulações Elspar, da Merck, e Erwinase da Speywood, preparadas a partir de enzimas bacterianas produzida por Escherichia coli e Erwinia carotovora, respectivamente, são utilizadas por via intra- venosa, geralmente associadas a agentes alquilantes e outros antagonistas metabólicos (MULLER e BOOS, 1998; NARTA, et alii, 2007). No Brasil, tem-se conhecimento de que somente o Elspar está em uso. Apesar de efetiva, a asparaginase apresenta limitações como o baixo tempo de meia-vida eo riscodeprovocar reações imunológicas.Adicionalmente, opacientepode desenvolver resistência aomedicamento. Assim, a utilização da asparaginase está restri- ta ao ambiente hospitalar com acompanhamento médico rigoroso. Em 1994, a FDA CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 309 1ª prova aprovou o uso da L-asparaginasemodificada com polietilenoglicol (PEG). Esta modifi- cação da enzima foi positiva porque aumentou ameia-vida do antineoplásico e reduziu consideravelmente os efeitos imunogênicos, ampliando aindamais o espectro de ativi- dade contra linfomas previamente resistentes. No entanto, as reações imunogênicas não foram completamente eliminadas e quando ocorrem são de longa duração e, portanto, mais difíceis de controlar. Outras enzimas capazes de decompor aminoácidos vêm sendo testadas para o tra- tamento de diversos tipos de tumores: L-glutaminase-L-asparaginase, L-metionina-�-lia- se, L-fenilalanina amonialiase, L-arginase, L-tirosinase, L-serinadehidratase, L-treonina desaminase e indolil-3-alcano hidroxilase (BICKERSTAFF, 2003). Esta relação vem crescendo de forma notável tendo em vista as novas técnicas de clonagem e expressão de enzimas e à identificação de metabólitos relevantes. Outro tipo de enzima oncolítica, ainda em fase experimental, é a toxina da difte- ria, cuja ação interrompe a síntese protéica. A sensibilidade das células tumorais a esta toxina é de 100 a 10.000 vezesmaior em relação às células normais (AYESH et alii, 2003; BICKERSTAFF, 2003). As enzimas que degradammacromoléculas (polissacarídeos demembrana, prote- ínas estruturais e funcionais ou ácidos nucléicos), como neuramidase, ribonuclease e carboxipeptidase, são tambémpromissoras para o tratamento de neoplasias (AYESH et alii, 2003; BICKERSTAFF, 2003). Enzimas como anticoagulantes Ouso de enzimas no tratamento de doenças tromboembólicas iniciou-se como conhe- cimentodequea liseda fibrinapode ser efetuada in vivo atravésdeumprocessoqueen- volve a conversão de plasminogênio a plasmina e de que ativadores do plasminogênio podemproduzir fibrinólise enzimática controlada. A primeira geração de agentes anti- trombóticos inclui a estreptoquinase bacteriana e a uroquinase de urina humana. A crescente incidência de doenças troboembólicas tem estimulado a busca, utilizando a tecnologia do DNA recombinante, de novos agentes capazes de estimular, com maior especificidade, os sistemas fibrinolíticos naturais (PIDRARD e BOLLEN,1990; BICKERSTAFF, 2003). Terapia de reposição enzimática O tratamento de deficiências enzimáticas, particularmente as decorrentes de erros ina- tos dometabolismo, é umcampode aplicação dosmais relevantes para as enzimas tera- pêuticas.Comoexemplos, podemser citadosousodaglicocerebrosidaseparaocontro- le da doença deGaucher, da alfagalactosidase para doença de Fabry, do fator VIIa para hemofilia, da pegademase para imunodeficiência intensa (doença domenino bolha) e da sacarosidase para deficiência congênita de sacarase e isomaltase (NOTHENBERG, 1999; BRADY, 2003; BRADY e SCHIFFMA, 2004). ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO310 1ª prova Enzimas ativadoras de pró-fármacos Um dos principais obstáculos ao emprego de quimioterápicos no cãncer é a limitação de dose devida à toxicidade dos fármacos. Esta toxicidade é causada pela baixa seletivi- dade dos agentes, que se tornam lesivos para as células neoplásicas e também para as células normais. Uma alternativa para superar essas limitações é a estratégia denominada ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy). A metodologia ADEPT compreende a administração de profármacos, formas quimicamente inativas de moléculas antineo- plásicas, e suaposterior conversãona formaativa in vivo, exclusivamentenasproximida- des do local de ação. Para isso, administra-se previamente ao paciente uma enzima ca- paz de promover a ativação da droga. Esta enzima é direcionada para as células tumora- is através da associação com um anticorpo específico para os componentes superficiais das células antineoplásicas. A enzimaconversoradoantineoplásico se fixa ao tumore só então promove a ativação do fármaco, minimizando assim os efeitos colaterais. Alguns artigos relatam ensaios ADEPT empregando as enzimas carboxipeptidase G2, carboxipeptidase A, beta-glicuronidase, fosfatase alcalina, nitroredutase, citosina desaminase, beta-lactamase e penicilina V amidase, dentre outras. Para o sucesso da aplicação da metodologia ADEPT, é fundamental que os pró-fármacos sejam projeta- dos para resistir ao ataque das enzimas do organismo do paciente. Outros sistemas análogos em estudo são: PDEPT (polymer-directed enzyme-pro- drug therapy), GDEPT (gene-directed enzyme-prodrug therapy), VDEPT (virus-direc- ted enzyme-prodrug therapy), GPAT (genetic prodrug activation therapy) e TEPT, (Targeted Enzyme Prodrug Therapy). Na ativação seletiva de profármacos, têm sido utilizadas enzimas microbianas, o que pode acarretar reações alérgicas. Assim, também está em estudo o uso de enzimas “humanizadas”. Esses novos usos terapêuticos, que ainda se encontram em fase de pes- quisa, apresentam potencial que pode repercutir de maneira muito significativa no mercado mundial de enzimas de uso farmacêutico (BLAU et alii, 2006; NICULESCU-DUVAZ e SPRINGER, 1997; NOTHENBERG, 1997; NAYLOR e THOMSON, 2003). Estratégias de formulação para fins terapêuticos Lipossomas como veículos de transporte in vivo Diversas estratégias podemserutilizadas comoobjetivodemelhorar o índice terapêuti- co de enzimas. Uma delas é a associação a sistemas que possam transportá-las em orga- nismos vivos, de tal modo que haja aumento da dose eficaz média e /ou redução da dose tóxica média. Um dos sistemas de transporte mais utilizado são os lipossomas, en- tendidos como microesferas constituídas por lipídios organizados em bicamadas concêntricas e separadas por compartimentos aquosos (figura 13.1). Os lipossomas podem incorporar praticamente qualquer tipo de substância, inde- pendentementedopesomolecular (desdemoléculas debaixopesomolecular amacro- moléculas); da carga elétrica (moléculas carregadas ouneutras); e da solubilidade (par- CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 311 1ª prova tículas hidrofílicas, que se incorporamnos espaços internos aquosos - figura 13.1-A; par- tículashidrofóbicas, que se incorporamnabicamada lipídica - figura13.1-B; epartículas anfifílicas, que se distribuem entre os dois meios). Os lipossomas foram preparados pela primeira vez em 1965 por Bangham para uso como modelos de membranas (BANGHAM et alii, 1965) e, posteriormente, como transportadores de agentes bioati- vos in vivo (GREGORIADIS e RYMAN, 1972). Atualmente, é possível preparar lipossomas com características bem definidas e adaptadas para cada objetivo em vista, como por exemplo, o órgão alvo. De acordo com suas características e comportamento in vivo após a administração intravenosa, os lipossomas, podem ser classificados em quatro grupos (CRUZ, 1997; LASIC e PAPAHADJOPOULOS, 1998; WOODLE e STORM, 1998; TORCHILIN e WEISSIG, 2003): � Lipossomas convencionais, caracterizados por uma captura rápida pelas células do sistema mononuclear fagocitário (SMF) apresentando, por isso, reduzidos tempos de circulação na corrente sanguínea. � Lipossomas de longo tempode circulação, que contendodeterminadasmolécu- las (como gangliosídeos) ou polímeros (comopolietilenoglicol - PEG), apresen- tam tempos de circulação na corrente sanguínea prolongados; � Lipossomas catiônicos, contendo fosfolipídios carregados positivamente e ade- quados para o transporte de material genético. � Lipossomas direcionadas, contendo ligantes à superfície capazes de reconhecer especificamente determinadas células e, portanto, apropriados para um direcionamento específico. ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO312 1ª prova Figura 13.1 Representação esquemática de um lipossoma e localização de enzimas no espaço lipossomal de acordo com as suas propriedades. Enzimas hidrossolúveis no espaço interno aquoso (A); enzimas lipopossolúveis na bicamada lipídica (B). Hidrófila Hidrófoba Enzima Figura 1 - A Figura 1 - B Atualmente, existemdiversas formulações lipossomais nomercado.Aprimeirade- las foi comercializada em 1990 nos EUA, contendo anfotericina B e utilizada no trata- mento de infecções sistêmicas fúngicas e infecções parasitárias, como a leishmaniose. Conforme já mencionado, a administração terapêutica de enzimas na forma livre pode apresentar graves limitações, como reações imunogênicas severas; dificuldade de acesso aoórgão alvo, vidamédia curta e rápida inativação após administração.Na forma lipossomal este panorama é alterado porque ocorrem modificações nas propriedades farmacocinéticas e de biodistribuição das enzimas, ocorrendo redução da sua toxicida- de e aumento da eficácia (CRUZ et alii, 1993; JORGE et alii, 1994;GASPAR et alii, 1996, CORVO et alii,1999). Após incorporação em lipossomas, a localização da enzima no interior da vesícula depende da sua solubilidade: as enzimas hidrossolúveis localizam-se no espaço interno aquosoe as lipossolúveis, namatriz lipídica.Omecanismodeaçãodas enzimas incorpo- radas depende de sua localização no lipossoma. Assim, as enzimas hidrossolúveis só po- dem degradar os substratos após a ruptura dos lipossomas (figura 13.1-A); enquanto que as lipossolúveis, capazes de expor o centro ativo para o exterior do lipossoma, po- dem exercer a sua atividade enzimática (efeito terapêutico) independentemente da ruptura do lipossoma (figura 13.1-B). Modificação química de enzimas terapêuticas Amodificação química de enzimas tem sido uma das estratégias utilizadas para contor- nar algumas limitações apresentadas pela terapia enzimática, tais como reduzidos tem- pos em circulação, degradação proteolítica, toxicidade e reações adversas do sistema imune. Amodificação química permite alterar as propriedades físico-químicas de enzi- mas terapêuticas, especialmente por interferência ao nível da biodistribuição ou do reconhecimento da macromolécula no organismo. Diversos tipos demoléculas podem ser utilizadas comeste objetivo (FUJITA et alii, 1992; IGARASHI et alii, 1992; VERONESE, 1994), destacando-se a conjugação compo- límeros de diferentes comprimentos de cadeia e cuja presença permite camuflar a ma- cromolécula na circulaçãosanguínea (ABUCKOSKI e DAVIS, 1981; VERONESE, 1994). Amodificação de enzimas por conjugação commoléculas hidrofóbicas, para au- mentar a afinidadepelas bicamadas lipídicas de lipossomasoudemembranas celulares, tem sido também utilizada (MARTINS et alii, 1990, 1996; TORCHILIN, 1991). Amodificação por reações químicas possibilita a introduçãode alterações nas pro- priedades deumaenzimapor atuaçãodiretana estruturadamoléculanativa. Sãométo- dos particularmente úteis quando se pretende introduzir substituintes que não podem ser inseridos por via genética, por exemplo, aminoácidos dextrógiros, análogos ouderi- vados de aminoácidos inexistentes na natureza, oligosídeos, sondas radioativas, sondas de fluorescência, polímeros, resíduos de ácidos graxos ou outras moléculas. A modificação química de uma enzima resulta da reação entre determinados rea- gentes químicos e alguns grupos laterais de resíduosde aminoácidos, comformação,na maiorpartedos casos, de ligações covalentes. Essas reações foram,durantemuitos anos, CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 313 1ª prova utilizadas para a identificação e localização de aminoácidos em estruturas de enzimas (MEANS e FEENEY, 1971) e no esclarecimento da relação entre a atividade catalítica e os aminoácidos existentes no centro ativo (EYZAGUIRRE, 1987). Só no final do século passado é que se assistiu a um crescente interesse pela modificação de enzimas com o objetivo de alterar suas propriedades (GEISOW, 1993). Dada a grande complexidade estrutural das enzima e a dificuldade de predizer as conseqüências funcionais das modificações introduzidas, as técnicas de alteração de propriedades de enzimas através de reações químicas são freqüentemente utilizadas de um modo iterativo. A extensão da modificação química é uma função da reatividade quer do reagente quer do grupo lateral do resíduo de aminoácido, bem como das alterações que a reação de modificação induziu na conformação da molécula. Ao envolver a ligação aleatória com grupos reativos da enzima, a modificação quí- mica pode dar origem a alterações no centro ativo ou na conformação da macromolé- cula, com a conseqüente alteração de suas características. As enzimas podem conter vá- rias centenas de resíduos de aminoácidos, mas apenas alguns destes estão diretamente envolvidos na sua ação catalítica (PAGE, 1984a).Oprincipal papel do grande conjunto de resíduosde aminoácidosdeumaenzimaéoda formaçãodeumaestrutura tridimen- sional com rigidez suficiente para maximizar a energia de ligação entre o substrato e a enzima (PAGE, 1984b).Omeio envolvente tambémpode induzir alteraçõesna estrutu- ra tridimensional da molécula. A intervenção em qualquer destes níveis pode afetar as características de uma proteína e tem conseqüências particularmente críticas quando afeta a atividade catalítica. É dada preferência às reações de conjugação em que são unicamente modificados grupos distantes do centro ativo, o que pode afetar consideravelmente as propriedades da enzima, sem, contudo, alterar a atividade específica. A preservação das propriedades catalíticas de uma enzimamodificada pode ser al- cançada através da utilização de um adequado estabilizante da estrutura da enzima. Alguns solventes (TIMASHEFF e ARAKAWA, 1993) e sistemas micelares naturais ou sintéticos, capazes de afetar a velocidade de muitas reações químicas quer in vivo quer in vitro, são usados como estabilizadores. O polietilenoglicol (PEG) é umpolímero bastante investigado para amodificação covalente de macromoléculas biológicas visando aplicações farmacêuticas. Seu uso é uma prática aceita na formulação terapêutica aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration).As primeiras enzimasmodificadas comPEGcolocadasnomercado fo- ram a pegademase bovina, utilizada no tratamento de imunodeficiência intensa e a L-asparaginase, para o tratamento de leucemia (ROBERTS et alii, 2002). O efeito damodificação química dos grupos å- NH2 da lisina na atividade e na esta- bilidade damolécula de L-asparaginase foi investigado por alguns autores (SADANA e Henley, 1988). Estudos sobre a ligação covalente de cadeias acila a grupos reativos da enzima mostraram retenções de atividade entre 10% e 75% (CLASSEN e ROOIJEN, 1983; KITO, 1986; SADANA e HENLEY, 1988). ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO314 1ª prova Afigura13.2apresentadaesquematicamenteamodificaçãodeumaenzimapor liga- ção a cadeias hidrofóbicas, a inserção de uma enzimamodificada numa bicamada lipídi- caeumexemplodeconjugaçãopor intermédiodareaçãocovalenteentreogrupocarbo- nilodeumcloretodeaciloeosgrupos laterais ��-NH2dos resíduosde lisinadaenzima. Comoobjetivo de aumentar o caráter hidrofóbico da enzima, outros autores estu- daram a reação demodificação da L-asparaginase por ligação a cadeias acila utilizando o reagente de modificação convenientemente disperso em micelas. (MARTINS e CRUZ, 1988; MARTINS et alii, 1990, 1996; MARTINS, 1998; CRUZ et alii, 2005). O efeito da presença de substrato no meio reacional, adicionado para proteger o centro ativo da enzimadurante a reaçãodemodificação, e da relação cloreto de acilo:en- zima,paraumareaçãoemmeioheterogêneo, éapresentadona figura13.3.Os resultados do estudodemonstraramque épossível aumentar o graudemodificação até ser atingido umpercentual de gruposmodificadosmáximo, sem alterar a atividade catalítica da enzi- ma Acil-L-asparaginase. Foi ainda avaliado o efeito de meios heterogêneos nos parâme- tros cinéticos do bioconjugado e realizado um estudo comparativo de propriedades da enzima modificada e da enzima nativa, tais como a mobilidade eletroforética, potencial zeta a determinados valores de pH, perfis de pH e de temperatura, estabilidade em soro humano e estabilidade ao armazenamento (MARTINS et. alii, 1996). Estudos semelhantes de otimização da reação demodificação com cloreto de pal- mitoílo e de caracterização da enzimamodificada foram realizados para as enzimas uri- case, superóxido dismutase e catalase (Martins, 1998; Aguiar et alii, 1998). No caso da superóxido dismutase e da catalase, estudou-se o efeito dos comprimentos de cadeia de cloretos de acila no grau de modificação das enzimas. Os resultados obtidos para a enzima superóxido dismutase podem ser observados na figura 13.4. CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 315 1ª prova Figura 13.2 Representação esquemática da ligação de cadeias hidrófobas à superfície da enzima, com a conseqüente alteração de afinidade por bicamadas lipídicas (A) Exemplo de conjugação por intermédio da reação covalente entre o grupo carbonilo de um cloreto de acilo e os grupos laterais �-NH2 dos resíduos de lisina da enzima (B). A B proteína nativa (hidrófila) proteína modificada bicamada lipidica afinidade para bicamadas -NH 2 -N H 2 -N H 2 + -N H 2 Enzima nativa (hidrófila) Enzima modificada cloreto de acilo Estabilizavel em meio aquoso ultra-sons micelas de tensioactivo pH > pKa -NH2 -NH 2 -N H 2 -N H 2 O C Cl + -N H 2 insolúvel em água (C>10) instável em água ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO316 1ª prova Figura 13.3 Efeito da relação molar cloreto de acilo:enzima no grau de modificação e na retenção de atividade da enzima, quer na ausência de substrato quer na presença de substrato no meio reacional. modificação na ausência de substrato: 0 20 40 60 80 100 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Razão molar (CIP:P) % modificação retenção de actividade retenção de actividade % modificação p e rc e n ta g e m (% ) modificação em presença de substrato: Figura 13.4 Evolução do grau de modificação da enzima superóxido dismutase em função da razão molar cloreto de acila /proteína e do comprimento da cadeia acílica. 0 5 10 15 20 25 30 35 0100 200 300 400 500 600 C 8 C14 C16 C18 G ra u d e m o d if ic a ç ã o (% ) Razão molar cloreto de acilo/proteína retenção de actividade > 70% A figura 13.5mostra esquematicamente a incorporação destas enzimas na estrutu- ra de um lipossomamultilamelar e a destruição da estrutura lipossomal com liberação gradual da enzima incorporada nas bicamadas. As enzimas L-asparaginase e superoxido dismutase modificadas com cadeias de palmitoílo foram incorporadas em lipossomas, tendo-se observado um aumento de afi- nidade destas enzimas para a bicamada dos lipossomas (CRUZ et alii, 1990; 1991; MARTINS et alii, 1992, GASPAR et alii, 2003). Resultados de atividade biológica dos sis- temas constituídos por enzimas modificadas incorporadas em diferentes tipos de lipossomas são apresentados no próximo item. Terapia enzimática via lipossomas A seguir são apresentados exemplos demelhoria dodesempenhodeduas enzimas com atividade terapêutica, L-asparaginase e superóxido dismutase, e respectivas formas aci- ladas após incorporação em lipossomas. L-asparaginase e acil L-asparaginase incorporadas em lipossomas e testadas em modelos animais Conforme jámencionado, a enzimaL-asparaginase éusadana terapiada leucemia,mas existem inconvenientes comoo reduzido tempode residência na corrente sanguínea e elevada toxicidade. Comoobjetivo de contornar essas limitações, foramdesenvolvidos estudos de for- mulações lipossomais de L-asparaginase visando à seleção das composições lipídicas ca- pazes demanter a atividade enzimática e simultaneamente maximizar a eficácia de en- capsulaçãoeas concentrações intralipossomaisdaenzima(CRUZet alii,1993;GASPAR et alii, 1996). Foi também testada a incorporação em lipossomas de um derivado desta CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 317 1ª prova Figura 13.5 Representação esquemática de enzima hidrofobizada e incorporada em lipossoma multilamelar (A). Representação esquemática da destruição gradual do lipossoma e da enzima incorporada (B). Estabilidade em soro humano lipossoma multilamelar enzima soro soro enzima obtido por ligação de cadeias de ácido palmítico aos grupos amina da enzima (Ac-L-asparaginase).Autilizaçãodederivados acilados teve como finalidadeaobtenção deumanovaentidadeenzimática comcaráterhidrofóbicoemaior afinidadepelas bica- madas lipídicas dos lipossomas contrariamente à L-asparaginase nativa, de caráter hi- drofílico (JORGE et alii, 1994). A composição lipídica dos lipossomas temumefeito importante não só na eficácia de encapsulação das enzimas,mas tambémna retenção da atividade enzimática. Assim, observou-se que alguns lipídios como o dicetilfosfato (DcP) reduziram a atividade cata- líticada enzima, enquantoqueoutros lipídios, comoo fosfatidilinositol (PI), a estearila- mina (SA) e os gangliosídeos (GM1), conservaram quase 100% da atividade e permiti- ram a encapsulação da enzima com alta eficácia e elevadas concentrações intraliposso- mais. A tabela 13.2 apresenta, a título de exemplo, a caracterização físico-química de formulações lipossomais de L-asparaginase eAcil L-asparaginase para o caso da compo- sição lipídica contendo SA. Tabela 13.2 Caracterização físico-química de formulações lipossomais de L-asparaginase e Acil-L-asparaginase Enzima Incorporada Proteína final / Proteína inicial (%) Eficácia de encapsulação (%) Atividade enzimática dos lipossomas intactos (%) L-Asparaginase 31 ± 1 52 ± 2 < 5 Acil-L-Asparaginase 43 ± 15 74 ± 12 74 ± 11 Composição lipídica – fosfatidilcolina: colesterol: estearilamina. Cruz et alii, 1993; Jorge et alii, 1994. Conforme mencionado acima, as enzimas hidrossolúveis, localizadas no espaço in- terno aquoso dos lipossomas, só podemdegradar os substratos após ruptura dos liposso- mas; enquanto que as lipossolúveis, localizadas namatriz lipídica, podemexercer sua ati- vidade enzimática independentemente da ruptura do lipossoma. Assim, quando a forma hidrofóbica da enzima, L-asparaginase acilada, foi incorporada em lipossomas, a princi- pal característica foi àpossibilidadedaexpressãodaatividadeenzimáticana forma intacta dos lipossomas, ao contrário das formulações lipossomais da enzima nativa. Estudos in vitrode citotoxicidade emcélulas de ovário de hamster chinês demons- traram que a L-asparaginase encapsulada em lipossomas foi menos tóxica para as célu- las normais em cultura do que a enzima na forma livre (CRUZ et alii, 1993). Uma vez que a enzima encapsulada em lipossomas é liberada lentamente das vesículas, a degra- dação de asparagina é tambémmais lenta, o que dá às células mais tempo para se recu- perar dos danos resultantes do contato da enzima com seu substrato. De acordo coma composição lipídica e o tipo de lipossomas, os parâmetros farma- cocinéticos da enzima variam: em lipossomas com diâmetro inferior a 0,2 µm, obser- vou-se um aumento do tempo demeia-vida da enzima nativa de 2h (enzima livre) para 9h (lipossomas convencionais) ou 29 h (lipossomas de longo tempo de circulação) (GASPARet alii,1996).Aenzimaacilada apresentouumtempodemeia-vidade3h, que após incorporação em lipossomas foi aumentado para 24 h (JORGE et alii, 1994). ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO318 1ª prova Foi estudada a toxicidade com vistas à avaliação da segurança imunológica das for- mulações lipossomais de L-asparaginase e acil-L-asparaginase após sensibilização dos animais por via intra muscular e desafio (challenge) por via intra venosa. Verificou-se que a encapsulação da enzima nativa em lipossomas impediu a indução de anticorpos anti-asparaginase uma vez que não ocorreu morte nos grupos de animais pré-sensibili- zados que receberama enzimana formade lipossoma. Por outro lado, todos os animais sensibilizados com L-asparaginase na forma livre e tratados com enzima livre sofreram choque anafilático e 17%dos animaismorreram.Nocasoda acil-L-asparaginase, embo- ra esta enzima se encontre parcialmente exposta para o exterior, os lipossomas conseguiram mascarar as reações imunogênicas. (tabela 13.3). Tabela 13.3 Toxicidade aguda in vivo: influência da formulação utilizada de L-asparaginase e Acil-L-asparaginase Sensibilização (i.m.) “Challenge (i.v.) Animais c/ choque anafilático (%) Animais mortos (%) L-Asparaginase Livre Livre 100 17 Livre Lipossomas 0 0 Lipossomas Livre 100 0 Lipossomas Lipossomas 0 0 Acil-L-Asparaginase Livre Livre 66 17 Livre Lipossomas 0 0 Lipossomas Livre 0 0 Lipossomas Lipossomas 0 0 i.m. – via intramuscular; i.v. – via intravenosa Dose administrada para as formulações de L-asparaginase e acil-L-asparaginase: 2000 U/kg. (Gaspar et alii, 1996; Jorge et alii, 1994) A atividade terapêutica das formulações de L-asparaginase nativa emodificada foi avaliada em um modelo animal de linfoma após administração subcutânea de células P1534. Observou-se que a enzima acilada livre e as formas lipossomais da enzima nativa emodificada têmefeito terapêutico superior à formacomercial. Aatividade terapêutica foi estimada através do número de animais curados e do índice de sobrevivência (razão entre o tempo de sobrevivência dos animais tratados e os animais controle). Verifi- cou-se que tanto as formas lipossomais quanto a enzima modificada têm um índice de sobrevivência superior a 700 e umnúmerode animais curados de 7 em10. Para a forma comercial, o índice de sobrevivência é 400 e o número de animais curados, de apenas 2 em 10 (figura 13.6). CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 319 1ª prova Concluindo, tanto amodificação química quanto a incorporação em lipossomas ou a associação de ambas as estratégias promoverama reduçãoda toxicidade, o aumento do tempo de circulação na corrente sanguínea e conseqüente aumento da atividade tera- pêutica, resultando numaumento substancial do índice terapêutico da enzima L-aspara- ginase.Estas formas poderão constituir uma alternativa à forma comercial da enzima. Superoxido-dismutase e acil superoxido-dismutase incorporadas em lipossomas e testadas em modelos animais A enzima superóxido dismutase, com atividade antioxidante, apresenta, como já men- cionado, limitações terapêuticas devido essencialmente à sua rápida eliminação da cor- rente sanguínea. Uma estratégia para contornar este inconveniente e melhorar o po- tencial terapêutico é a sua incorporação em sistemas de transporte/direcionamento (STONE e SMITH, 2004). É possível prever três vantagens do uso de lipossomas como transportadores de superóxido dismutase: �O aumento da disponibilização da enzima nos locais de artrite provoca uma au- mento correspondente da atividade terapêutica. � Acinética de liberação controladada enzimados lipossomaspode reduzir a dose a ser administrada, bemcomoonúmerode administrações necessárias à eficácia terapêutica. ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO320 1ª prova Figura 13.6 Atividade terapêutica de formulações de L-asparaginase e Ac-L-asparaginase nas formas livre e lipossomal em um modelo animal de linfoma. Dose administrada 800 U/kg. (JORGE et alii, 1994; GASPAR et alii, 1996). Comercial L - ASNase 8 6 4 2 0 Lipossomas Ac -L - ASNase Semi - L - ASNase sintética Ac - Lipossomas L - ASNase 0 800 600 400 200 10 T ra ta d o s / C o n tr o le (% ) A n im a is c u ra d o s - Tratados / Controle (%) - Animais curados �No caso da formamodificada da enzima (superóxido dismutase acilada), as for- mulações lipossomais podem exercer atividade terapêutica antes de sua destrui- ção, resultando em efeito terapêutico mais rápido. A enzima superóxido dismutase nativa e umderivado obtido por ligação de cadei- as de ácido palmítico a grupos amina da enzima foram incorporados em lipossomas. A seguir, foram efetuados estudos de caracterização das formulações, de farmacocinética e biodistribuição e de atividade in vivousando comomodelo a artrite adjuvante de rato. A utilização de derivados acilados de superóxido dismutase teve como finalidade a ob- tenção de umanova entidade enzimática comcaráter hidrofóbico e por isso commaior afinidade para as bicamadas lipídicas dos lipossomas contrariamente à enzima nativa, de características hidrofílicas. As formulações lipossomais com superóxido dismutase nativa e acilada foram de dois tipos: lipossomas convencionais contendo estearilamida (SA) (CORVO, 1997) e de longo tempo de circulação revestidos com polietilenoglicol (LCL) (CORVO, 1999, 2002). Em todos os estudos comparativos realizados in vivo, as formulações lipossomais foram preparadas com razões proteína/lipídeo iniciais entre 12 a 15 �g de enzima nativa ou acilada (concentrações intralipossomais de proteína) por µmol de lipídeo. Os resultados obtidos são relatados a seguir. A eficácia de encapsulação da superóxido dismutase em lipossomas variou com a composição lipídica, o tipo de lipossomas e o tamanho, podendo ir até 80%em liposso- mas SA (0,2 �m). No entanto, todas as formulações apresentaram valores de retenção de atividade enzimática superiores a 90%. Os valoresmais elevados de eficácias de incorporação observados para superóxido dismutase acilada resultamdamaior afinidade desta pela bicamada lipídica dos liposso- mas contrariamente à superóxidodismutase nativa (localizadano espaço interno aquo- so). Estes resultados estão de acordo com o valor de coeficiente de partição em octa- nol/água da enzimamodificada, 20 vezes superior ao obtido para a nativa (3,13 contra 0,15, respectivamente) (MARTINS et alii, 1994). Os lipossomas de superóxido dismutase nativa emodificada apresentaram ativida- des enzimáticas na forma intacta bastante diferentes evidenciando a diferente localiza- çãodestas duas entidades enzimáticas no espaço lipossomal. Para os lipossomas da enzi- ma acilada, 40 a 47% da enzima encontrava-se parcialmente exposta à superfície do li- possoma, enquantoquepara os lipossomasda formanativa, este valor era inferior a 5%, confirmando a sua localização no espaço interno aquoso. Para os estudos de farmacocinética e biodistribuição, os lipossomas com superóxi- dodismutase nativa e acilada forammarcados radioativamente através da co-encapsula- ção do complexo 111In-DTPA e administrados intravenosamente. A monitoração do seu comportamento in vivo foi realizada numa câmara �. A análise das imagens obtidas (figura 13.7)mostra que no caso das formulações lipossomais LCL e SAno tempo zero, o contorno do fígado, baço e região cardíaca eram visíveis. No entanto, após 24 h, no caso da formulação SA, a região do coração já não era visível, evidenciando o desapare- cimento da formulação do sangue, enquanto que para a formulação LCL, esta região ainda era visível, mostrando que uma alta percentagem da dose injetada ainda se en- CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 321 1ª prova contrava em circulação. De fato, após 48 h, ainda se detectou em circulação 23% da dose administrada, enquantoquepara as outras duas formulações após 24h só seobser- vou cerca de 10% da dose administrada (CORVO et alii, 1999). Os perfis sanguíneos obtidos para as diferentes formulações lipossomais de supe- róxido dismutase em ratos com artrite adjuvante, após administração intravenosa das formulações enzimáticas, mostraram que o revestimento dos lipossomas com polietile- noglicol associado a seu pequeno tamanho são fatores favoráveis para a obtenção de longos tempos de circulação da enzima. Em termos de acumulação nos locais de inflamação em ratos com artrite adjuvan- te, o resultado mais importante observado foi a acumulação muito superior (10 vezes) observada na pata inflamada comparativamente à pata normal obtida com lipossomas LCL (figura 13.7). Os estudos de farmacocinética e biodistribuição das formulações lipossomais com a enzimamodificada demonstraram que a presença da enzima na superfície dos lipos- somas não se traduziu em alterações no comportamento in vivo dos lipossomas, isto é, na acumulação nos locais de inflamação, que seguiram o perfil observado para as formulações da enzima nativa. Para a avaliação do efeito terapêutico das diferentes formulações de superóxido dismutasenativa, foi calculada a regressãodoedemaprovocadono final do esquemade tratamento. Realizaram-se estudos do efeito da dose (dose única de 33, 198 e 363 �g) e da freqüência de tratamento (1 a 11 administrações de 33 �g de enzima por animal). Ambas as formulações lipossomaismostraramumefeito terapêutico significativamente superior quando comparados com a enzima não encapsulada para as doses estudadas. Noentanto, só a formulaçãoLCLapresentouefeito terapêutico significativamentedife- ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO322 1ª prova Figura 13.7 Imagens obtidas com uma câmara �, às 0 h e 24 h, para os lipossomas SA e lipossomas LCL (Corvo et alii, 1999). t = 0h t = 24h SA 200nm LCL 110 nm rente para a dose mais baixa. Comparando os dois sistemas lipossomais, o efeito tera- pêuticoda formulaçãoLCL foi superior em todas as doses relativamente aos lipossomas SA.Observou-se aindaque com6administrações, apenas, a formulaçãoLCL já apresen- tava o seu efeito máximo (CORVO et alii, 2002). Deste estudo pode-se concluir que o tipo de lipossomas, seu tamanho, dose e nú- merodeadministrações são fatores importantes.Orevestimentode lipossomas compo- lietilenoglicol confere superioridade a estes sistemas no transporte de superóxido dis- mutase para os locais de inflamação, sendo o seu tamanho (aproximadamente de 0,10 µm) um fator crítico. Oefeito terapêutico comparativo das formulações lipossomais, quer LCLquer SA, de superóxido dismutase nativa e acilada, foi avaliado através do diâmetro da pata infla- mada, quemede o inchaço da articulação, e do volumedapata, que relaciona a intensi- dade do edema na articulação e nos tecidosmoles. O esquema de tratamento utilizado foi constituído por uma injeção única das diversas formulações lipossomais com uma dose de 363 µg de SOD por rato. Observou-se redução mais rápida do volume da pata inflamada para os lipossomas de superóxido dismutase acilada 4 dias após a injeção das formulações comparativamente aos lipossomas da forma nativa (GASPAR et alii, 2007) Apresençade superóxidodismutase aciladanas superfícies dos lipossomaspermiteque estes exerçam o seu efeito terapêuticomesmo antes do rompimento das vesículas. Esta é uma vantagem em relação aos lipossomas da enzima nativa, nomeadamente em situações de isquemia seguida de reperfusão. Os exemplos de terapia enzimática envolvendo amodificaçãoquímica eposterior- mente associação a lipossomas podemserutilizados para a incorporaçãodeoutras enzi- mas de características hidrofóbicas. USO DE ENZIMAS EM DIAGNÓSTICOS Durante muito tempo, o diagnóstico clínico utilizou principalmente métodos quími- cos. Recentemente, diversas enzimas com excelente especificidade pelo substrato fo- ram desenvolvidas e são empregadas como catalisadores em diagnósticos. Da mesma forma que as enzimas de uso terapêutico, o uso demétodos de ensaio enzimáticos para diagnósticos foi facilitado pelos avanços das áreas bioquímica e biomédica que permiti- ram a identificação e caracterização de enzimas/metabólitos relevantes e pelo desen- volvimentodabiologiamolecular, que tornoupossível a produçãode enzimas emgran- des quantidades comcustosmais convenientes.Omercadodediagnósticos pode ser di- vidido em três categorias principais (GOLDBERG, 2005; KOPETZKI et alii, 1994; MUROOKA e YAMASHITA, 2001): Métodos enzimáticos em análises clínicas Através do uso de enzimas, é possível analisar uma substância específica a partir de amostras biológicas semnecessidade de isolamento, o que simplifica o processo e dimi- nui o tempo de ensaio. As enzimas utilizadas em análises clínicas são usadas como insu- mos em kits de reagentes. Estes kits reagentes são empregados em instrumentos alta- CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 323 1ª prova mente automatizadosque analisamamostras biológicas e servemdeauxiliares paraodi- agnóstico e tratamentodedoenças. Exemplos de enzimas empregadas para este fim são apresentados na tabela 13.4. Tabela 13.4 Exemplos de enzimas empregadas em análises clínicas Enzima Substrato avaliado álcool desidrogenase álcool álcool oxidase álcool aldeído desidrogenase indicador p/ reações que produzem acetaldeído catalase/aldeído desidrogenase ácido úrico colesterol oxidase/peroxidase colesterol colesterol oxidase colesterol total creatinase creatinina e creatina creatininase creatinina Glicose-6-P desidrogenase/hexoquinase glicose e ATP glicose oxidase (/peroxidase) glicose �-glicosidase �-amilase �-glicosidase � -amilase �-glucuronidase esteróides glutamato desidrogenase/urease uréia glicerol-3-P desidrogenase triglicérides e glicerol, indicador em ensaios de aldolase, triose-P isomerase e glicerol quinase lactato desidrogenase indicador em ensaios de GPT lactato desidrogenase/piruvato quinase indicador em reações em que ADP, ATP ou piruvato são produtos lipase/glicerolquinase/glicerol-3-P oxidase/peroxidase triglicérides e glicerol malato desidrogenase oxaloacetato e malato malato desidrogenase/fosfoenolpiruvato carboxilase CO2/carbonato maltose fosforilase �- amilase mutarotase/glicose oxidase/peroxidase glicose sarcosina oxidase creatinina e creatina sacarose fosforilase fosfato inorgânico urease uréia uricase/peroxidase/aldeído desidrogenase ácido úrico ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO324 1ª prova Enzimas marcadoras em imunodiagnósticos Enzimas para imunodiagnósticos são usadas comomarcadores em sistemas ELISA, por exemplo, e são ligadas aumanticorpopara testar de formabastante específica apresen- ça da substância alvo. Exemplos: fosfatase alcalina, peroxidase e uréase. Enzimas avaliadas em diagnósticos clínicos de doenças Alterações emsistemas enzimáticos estão envolvidas emmuitas doenças. Assim, a avalia- ção dos níveis enzimáticos em amostras biológicas vem sendo cada vezmais empregada em diagnósticos clínicos de doenças. A tabela 13.5 apresenta exemplos de enzimas utilizadas com este fim. Tabela 13.5 Exemplos de enzimas empregadas em diagnósticos clínicos de doenças Enzima avaliada Doença alvo Fosfatase ácida Câncer de próstata, doença de Gaucher Alanina aminotransferase Problemas hepáticos Fosfatase alcalina Problemas hepatobiliares e ósseos Amilase Pancreatite aguda Enzima conversora angiotensina Doença de Gaucher, leprose, cirrose biliar Aspartato aminotransferase Tecidos danificados (coração, fígado, rim) Colinesterase Exposição a organofosfatos Creatinina quinase Problemas cardíacos/musculares Gama glutamiltransferase Problemas hepáticos Lactato desidrogenase Infarto do miocárdio, câncer de testículo Renina Hiperaldoteronismo PERSPECTIVAS O desenvolvimento de aplicações de enzimas como medicamentos e em diagnósticos tem sido considerável nos últimos anos, refletindo amagnitude da potencialidade des- tes catalisadores biológicos. Este é um setor comperspectiva de crescimento acentuado impulsionado pelos avanços embiologiamolecular, genômica, proteômica e engenha- ria de proteínas. O crescente conhecimento das doenças emnívelmolecular permite o desenvolvimento de terapiasmais específicas, portantomais eficientes emenos sujeitas a efeitos colaterais, e diagnósticosmais precisos. Adicionalmente, com os conhecimen- tos adquiridos, é teoricamente possível expressar qualquer proteína ouenzima de inte- resse, proveniente de qualquer fonte, em célulasmicrobianas, vegetais ou animais, pos- sibilitando a produção de enzimas com rendimentos e custos mais convenientes. É es- perada também uma grande contribuição das novas estratégias de formulação, como CAPÍTULO 13 � ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNÓSTICOS 325 1ª prova por exemplo, a conjugação commoléculas como polietilenoglicol e o uso de sistemas de transporte/direcionamento, como os lipossomas, para aprimorar o uso terapêutico das enzimas. Grandes avanços também são esperados no campo de proteínas artificiais com atividade catalítica. Novos usos terapêuticos e em diagnósticos, ainda em fase de pesquisa, represen- tam umpotencial que pode repercutir demaneira aindamais significativa nomercado mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilhão de dólares por ano. REFERÊNCIAS ABUCHOWSKI, A.; DAVIS, F. F. Soluble polymer-enzyme adducts. In: HOLCENBERG, J.; ROBERTS, G. (eds.). Enzymes as Drugs. Chap. 13, New York: John Wiley & Sons. AGUIAR,C.; CORVO,M.L.; CRUZ,M. E.M.;MARTINS,M.B. F. Synthesis and characterization of chemi- cally modified catalase. Livro de Actas do III Congresso de Libertação Controlada deMedicamentos, 190-1, 1998. AYESH, B.; MATOUK, I.; OHANA, P.; SUGHAYER, M. A.; BIRMAN, T.; AYESH, S.; SCHNEIDER, T.; DE GROOT.; N.; HOCHBERG. A. Inhibition of tumor growth by DT-A expressed under the control of IGF2 P3 and P4 promoter sequences. Molecular Therapy, 7 (4):535-41, 2003. BANGHAM, A. D.; STANDISH, M. 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