Busca de mutações no éxon 1 do gene KRAS em carcinoma de vesícula biliar.

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Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa 
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências 
Genômicas e Biotecnologia 
 
 
Busca de mutações no exon 1 do gene KRAS em amostras de 
carcinoma de vesícula biliar 
 
Brasília - DF 
2013 
 
Autor: José Antonio Paniagua 
Orientador: Dr. Rinaldo Wellerson Pereira 
 
 
 
 
 
 
 JOSÉ ANTONIO PANIAGUA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BUSCA DE MUTAÇÕES NO EXON 1 DO GENE KRAS EM AMOSTRAS DE 
CARCINOMA DE VESÍCULA BILIAR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Brasília 
2013 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Senso em Ciências Genômicas e 
Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, 
como requisito para obtenção do título de Mestre 
em Ciências Genômicas e Biotecnologia. 
 
Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB 
 
22/07/2013 
 
P192b Paniagua, José Antonio 
Busca de mutações no exon 1 do gene KRAS em amostras de carcinoma de vesícula 
biliar. / José Antonio Paniagua – 2013. 
93f. : il ; 30 cm 
 
Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2013. 
Orientação: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira. 
 
1. Diagnóstico molecular. 2. Mutação (Biologia). 3. Câncer. 4. Vesícula biliar. I. 
Pereira, Rinaldo Wellerson., orient. II. Título. 
 
 
 CDU 577.21:616-006.6 
Paniagua
Note
High frequency of TP53 but not K- r as gene mutations in Bolivian patients with gallbladder
 
 
FICHA DE APROVAÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À meus pais Antônio Rodrigues Paniagua e 
Dalila Azevedo Naves (in memorian). Estes 
são e serão eternamente insubistituíveis, 
inesquecíveis e incomparáveis. Suas palavras 
ecoarão por toda eternidade. Eu ainda os vejo 
em cada irmã, filho e principalmente nas 
profundezas dos espelhos, quando me coloco 
frente a estes. Eles me ensinaram a levar uma 
vida simples e com muita dignidade, me 
incentivaram a sonhar e nunca parar de buscar. 
E é assim que tenho (sobre)vivido dia após dia 
a insuperável ausência deles. Quanto orgulho e 
tanta saudades tenho em exercitar essas 
memorias para venerar vocês. De fato, estes 
devaneios me aquecem e me mantem vivo, na 
dificil arte de aceitar a falta que me fazem e, 
ainda assim seguir em frente. É incrível! Com 
o tempo percebe-se que há muito mais dos 
nossos pais em nós do que supúnhamos. 
 
 
AGRADECIMENTO 
 
 
Ao meu orientador, Dr. Rinaldo Wellerson Pereira, professor e diretor do curso de pós 
graduação da UCB/DF, que sem medir esforços muito me auxiliou, me dando tanto 
autonomia como liberdade irrestrita para executar os ensaios que gestaram este trabalho. 
 
À minha esposa e filhos, minhas sínceras e eternas desculpas pelas minhas ausências 
(mal compensadas). Ao Cleiseano, obrigado pelos incentivos. Ao meu filho, Antonio 
Rodriguês Paniagua, sinto muito por abrir mão de ser seu professor nas séries finais do Ensino 
Fundamental, quando comecei a investir neste trabalho. Às minhas queridas e inesquecíveis 
irmãs. E em especial, a irmã caçula, Solange (a fonte de minha esperança e ânimo), que a seu 
modo muito me estimulou e sempre acreditou no findar positivo desta trajetória. 
 
À Secretaria de Estado de Educação (MG) e ao programa de Pós-Graduação (DF) em 
Biologia Molecular pelo auxílio e apoio concedidos durante o meu Mestrado Acadêmico. 
 
À Profª. Drª. Rosângela Vieira de Andrade (UCB-DF), que se alegra na arte de 
pesquisar e ensinar o meu muito obrigado a esta profissional que sempre ouviu minhas 
dúvidas e me direcionou no caminho certo. 
 
Ao Prof. Dr. Robert Edward Pogue (UCB-DF), que prontamente dirimiu minhas 
dúvidas e me proporcionou as melhores sugestões, todos os momentos requeridos. 
 
Á Profª. Drª. Andréa Barreto Motoyama (Universidade de Brasília - UnB), que através 
de e-mails nunca deixou de atender a um questionamento meu sempre com muito carinho. 
 
Ao Médico Oncologista Pediátrico do Hospital da Criança de Brasília, Dr. Luis 
Henrique Toshihiro Sakamoto, que muito contribuiu com suas sugestões em relação à 
extração de DNA de tecido fixado em formol e emblocado em parafina. 
 
Á Profª. Drª. Alessandra R. Aos Prof. Dr. João A. Barbosa (UCB-DF) e Dr. Francisco 
Prosdocimi (UFRJ-RJ) minhas boas lembranças das conversas que oportunamente tivemos. 
 
Ao Biólogo (Mestre em Patologia Clínica pela Escola Paulista de Medicina-UNIFESP, 
Presidente da Sociedade Brasileira de Histotecnologia), Joaquim S. de Almeida, pelo apoio 
sem igual. Sua objetividade e franqueza muito cooperaram para a conclusão deste trabalho. 
 
Aos colegas da Plataforma de Genômica da UCB-DF, em especial a Patrícia pela sua 
prontidão e meiguice em servir sempre no seqüenciamento das amostras estudadas no 
presente trabalho. Aos meus amigos de laboratório Virgílio, Laiane Santos, Cristiane Santos, 
Larissa Lemos, Luiz Felipe, Ricardo, Felipe e Loiane, que muitas vezes trocamos idéias em 
conversas muito produtivas. Aos inesquecíveis colegas de bancadas e de “consultas”, 
Elizabeth, Clarissa, Marcela, Taina. De fato, vocês tanto me ensinaram quanto me toleraram. 
 
O meu carinho especial aos meus velhos amigos de Unaí/MG, o Prof. Vanderlei 
Martins Peres (matemática/estatística), meu ex-aluno Wilham, do curso de enfermagem, pela 
sua contribuição constante no inglês. A minha Diretora (Ensino Fundamental) a Profª. Maria 
das Graças, que sem esbarrar na lei manteve me apoiando em toda esta jornada. Enfim, a 
todos que de algum modo me ajudaram a concluir este trabalho o meu muito obrigado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
É preciso dançar sobre os abismos 
Rir de tudo e de todos 
É preciso superar o “aqui e agora” 
“Ser uma ponte e não um fim” 
É preciso conviver com incertezas 
Desconfiar, desconfiar, desconfiar 
Tudo é passível de questionamento 
Os valores, os conceitos e preceitos 
O “equilíbrio” e a loucura 
os sentimentos mais dignos, 
a ciência, a história, a religião 
Nada, absolutamente nada pode 
Ser considerado “definitivo” 
Concluir é atrofiar, estagnar, morrer... 
 
 
 IVAN PETROVITCH 
 
 
RESUMO 
 
 
Referência: Paniagua, José Antonio. Busca de mutações no gene KRAS em amostras de 
carcinoma de vesícula biliar. 2013. 93f. Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia – 
Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2013. 
 
 
O câncer de vesícula biliar (CaVB) é uma neoplasia muito agressiva, com diagnóstico 
incidental, via de regra, prognóstico desfavorável e com consequência letal. Entretanto, o 
conhecimento da evolução natural desse câncer ainda é muito imaturo, parcialmente em 
função de sua raridade, ausência de sintomatologia, escassez e contradições na literatura. Tais 
fatos, contribuem para dificultar o diagnóstico dessa doença comprometendo o êxito no 
prognóstico e no tratamento. Colecistectomias é uma (falta de) opção oferecida aos pacientes 
como preventivas oucomo curativas, em casos suspeitos ou avançados, respectivamente. 
Portanto, a cirurgia não tem como objetivo melhorar o prognóstico e sim a qualidade de vida e 
a sobrevida do paciente. Estudos populacionais têm postulado que há diversos fatores e 
marcadores de riscos associados ao CaVB. No entanto, tais fatores têm baixo ou questionável 
potencial para auxiliar no prognóstico e terapêutica. Várias classificações embasadas em 
aspectos morfofisiológicos e histológicos têm contribuído positivamente para gerir melhor o 
diagnóstico e o prognóstico do CaVB, esses esforços são justificados pelo grande volume de 
incidências e vítimas com morte. Contudo, são muito limitados quando comparados à 
evolução no diagnóstico precoce e prognóstico direcionado para outros cânceres. Acredita-se 
que a presença de macromoléculas marcadoras de oncogenicidade deverão se impor 
prioritariamente como estratégias para melhor gerir cânceres agressivos. De fato, a literatura é 
unânime em registrar que vários genes do sistema de controle do ciclo celular são encontrados 
mutados em diversos cânceres humano e estão clinicamente associados a um fenótipo de 
maior agressividade e menor sobrevida. O KRAS2B é um dos oncogenes deste sistema, capaz 
de imprimir nas células fisiologia patológica com características típicas de células malignas 
com alto potencial reprodutivo, então, a identificação precoce dos mecanismos moleculares 
subjacentes que desecadeiam a tumorigenese otimiza o prognóstico. Devido a importância do 
KRAS na homeostasia celular e sua maior incidência como oncogene em diversos tipos de 
cânceres, descrever o status mutado do exon 1 desse gene, tem sido um alvo atrativo da 
medicina molecular. Portanto, neste estudo retrospectivo, propôs-se sequenciar e avaliar o 
exon 1 do KRAS, em busca de mutações patogênicas nos sítios codantes 12 e 13, como um 
marcador molecular robusto para auxiliar no prognóstico. A fonte de DNA utilizada para estes 
testes são oriundas de 42 biópsias de CaVB primário, fixadas em formol e emblocadas em 
parafina. Foi extraído e amplificado por PCR um fragmento de 295 pb de 40,4% dessas 
amostras. Pela análise dos eletroferogramas produzidos pelos sequenciamentos nenhuma 
mutação foi detectada no exon 1 do KRAS, objeto deste estudo. Otimizar essa tecnologia do 
uso eficiente de material parafinado em patologia molecular com resultados satisfatórios tem 
sido um grande desafio. Contudo, isso não impediu a obtenção de bons sequenciamentos, 
assim como não comprometeu os resultados aqui encontrados em plena concordância com a 
baixa frequência de mutações no KRAS em CaVB reportado na literatura. 
 
 
 
Palavras-chave: Diagnóstico molecular. Mutação (Biologia). Câncer. Vesícula Biliar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
The gallbladder cancer (GBC) is a very aggressive cancer, diagnosed incidentally, as a rule, 
poor prognosis and therefore lethal. However, knowledge of the natural history of this cancer 
is still very immature, partially due to its rarity, absence of symptoms, scarcity and 
contradictions in the literature. These facts contribute to make the diagnosis of this disease 
affecting the successful outcome and treatment. Cholecystectomy is an (lack of) option 
offered to patients as a preventive or curative as in suspected cases or advanced, respectively. 
Therefore, surgery is not meant to improve the prognosis, but the quality of life and survival 
of patients. Population studies have postulated that there are several factors and risks 
associated with GBC. However, these factors have low or questionable potential to help the 
prognosis and therapy. Several classifications based on solid and histological aspects 
Morphophysiological has contributed positively to better manage the diagnosis and prognosis 
of GBC, these efforts are justified by the sheer volume of incidents and victims to death. 
However, very limited compared to developments in early diagnosis and prognosis directed to 
other cancers. It is believed that the presence of markers oncogenicity macromolecules should 
be imposed as priority strategies to better manage aggressive cancers. Today, it is known that 
KRAS2B mutations can print pathological physiology in cells with features typical of 
malignant cells with high reproductive potential. In fact, the literature is unanimous 
registering that several genes from cell-cycle control system are found mutated in many 
human cancer and are clinical phenotype associated with poorer survival. The KRAS2B is an 
oncogene part of this system which is able to print in cells a pathologic physiology with 
typical features of malignant cells with high reproductive potential, then, the early 
identification of the subjacent molecular mechanisms that trigger the tumorigenesis, optimizes 
the prognosis. Because of the importance of KRAS in cellular homeostasis and its higher 
incidence as oncogene in several types of cancers, describe the status of the mutated in exon 1 
of this gene, has been an attractive target of molecular medicine. Therefore, in this 
retrospective study, and evaluate proposed sequencing of exon 1 of KRAS in search of 
pathogenic mutations in the sites codantes 12 and 13, as a robust molecular marker to aid in 
prognosis. The source of DNA used for these tests are from 42 biopsies CaVB primary, 
formalin-fixed paraffin-embedded. It was extracted and amplified using PCR a fragment of 
295 bp 40.4% of samples. the analysis of sequencing electropherograms produced by no 
mutation was detected in exon 1 of KRAS, the object of this study. However, the analysis of 
sequencing electropherograms produced by these fragments no mutation was detected in exon 
1 of KRAS, the object of this study. Optimize this technology for the efficient use of paraffin 
material in molecular pathology with satisfactory results has been a challenge. However, this 
did not prevent obtaining good sequencing, and did not compromise the results found in full 
agreement with the low frequency of KRAS mutations in GBC, reported in the literature. 
 
 
Keywords: Molecular diagnostics. Mutation (Biology). Cancer. Gallbladder. 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
 
 
Figura 1 Incidência do carcinoma de vesícula no mundo......................................... 18 
Figura 2 Perfil molecular e genético do Câncer de Vesícula Biliar.......................... 35 
Figura 3 As mutações patogênicas somáticas mais comuns no exon 1 do KRAS..... 40 
Figura 4 Janela do banco Sanger expondo as diversas mutações no KRAS.............. 41 
Figura 5 Sequência de nucleotídeos de um fragmento contendo o exon 1do KRAS. 50 
Figura 6 Eletroforese para constatar a amplificação do exon 1 do gene KRAS2B.... 61 
Figura 7 Amostras 31A e 31B dos amplicons do KRAS.......................................... 62 
Figura 8 Bandas com baixo peso molecular em géis de agarose.............................. 63 
Figura 9 Eletroferograma parcial de uma sequência reversa do exon 1 do KRAS.... 64 
Figura 10 Fotografias de géis de agarose a 2% com DNA muito degradado............. 70 
 
Gráfico 1 Associação entre o percentual de amostras e os procedimentos 
utilizados como estratégia para estudo do exon 1 do gene KRAS........... 
 
 65 
Gráfico 2 Procedimentos utilizados como parte do estudo do exon 1 do gene 
KRAS..................................................................................................... 
 
 65LISTA DE TABELAS 
 
 
 
Tabela 1 Classificação histológica (tipos celulares) do CaVB.................................. 21 
Tabela 2 Grau Histológico de diferenciação e conteúdo glandular dos CaVB......... 22 
Tabela 3 Descrição dos primers utilizados para flanquear o exon 1 do KRAS 50 
Tabela 4 Volumes pipetados, concentração final dos reagente da solução de PCR 51 
Tabela 5 As condições da PCR para o exon 1 do gene KRAS................................... 53 
Tabela 6 Quantificação por fluorimetria de uma amostra de DNA genômico.......... 61 
Tabela 7 Estatística descritiva da influência do tempo de incubação........................ 62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 
 
A, C, G, T Adenina, Citosina, Guanina, Timina; Bases orgânicas dos nucleotídeos 
BSA Albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin) 
Ca Carcinoma 
CIS Câncer in situ 
CN Controle negativo 
CP Controle positivo 
CaVB Carcinoma de Vesícula Biliar 
CNVs Copy Number Variations 
H2OD Água destilada deionizada 
DNA Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid) 
DNAg DNA genômico 
dNTP Desoxirribonucleotídeos 5´-trifosfatados 
DP Desvio Padrão 
EDTA Ácido etilenodiamino tetra acético 
GST Gene Supressor de Tumor 
IMS Instabilidade de Microssatélites 
JADPB Junção Anômala dos Ductos Pancreato-biliar 
KCl Cloreto de potássio 
MgCl2 Cloreto de Magnésio 
ORF Janela de leitura (Opening Reading Frame) 
pb pares de bases 
PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) 
pH Potencial de hidrogênio de uma solução 
Pmol Picomol = 10
-12
 mols 
Primer Cadeia de ácidos nucleicos iniciadora da replicação 
R0 Ressecção Cirúrgica Curativa 
rpm Rotações por minuto 
SCCC Sistema de Controle do Ciclo Celular 
TAE Tris-Acetato-EDTA 
TE Tris-EDTA 
 
 
Tm Temperatura de fusão (melting temperature) 
Tris Tris (hidroximetil) aminometano 
Tris-HCl Tris Hidrocloreto 
UI Unidade Internacional 
UTR Região não traduzida (Untranslated Region) 
VB Vesícula Biliar 
mL mililitro 
 
 
 
 
LISTA DE SÍMBOLOS 
 
 
 
% Porcentagem 
°C Graus Celsius 
g Grama 
F/R F - usado para designar o primer forward e R – primer reverse 
k(p)b Kilo (pares) de bases 
µ Micro, prefixo que designa 10
-6
 
mM Milimolar 
M Molaridade 
nm Nanometro, equivalente a 1,0×10
−9
 do metro 
U Unidade 
V Volt, Unidade SI de voltagem elétrica 
< Menor 
± Mais ou menos 
- Negativo 
+ Positivo 
≤ Menor ou igual 
≈ Aproximadamente 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 17 
1.1 CARCINOMA DE VESÍCULA BILIAR ....................................................................... 17 
1.2 DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO ........................................ 20 
1.3 DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO POR IMUNOHISTOQUÍMICA EM CAVB ........ 23 
1.4 PROGNÓSTICO BASEADO EM ANÁLISE DE DNA ................................................. 34 
1.5 PROGNÓSTICO BASEADO NO STATUS MUTADO DO KRAS EM VÁRIOS 
CÂNCERES ........................................................................................................................ 35 
1.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR EM TECIDO FIXADO EM FORMOL E EMBEBIDO 
EM PARAFINA .................................................................................................................. 41 
2 OBJETIVOS........................................................................................................................ 43 
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 43 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 43 
3 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 44 
3.1 AMOSTRAS .................................................................................................................. 44 
3.2 DESPARAFINIZAÇÃO E REIDRATAÇÃO DE TECIDO FIXADO EM FORMOL .... 45 
3.3 QUANTIFICAÇÃO DE DNA........................................................................................ 48 
3.4 AMPLIFICAÇÃO POR PCR ......................................................................................... 49 
3.5 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DE PRODUTOS DE PCR....................... 53 
3.6 QUANTIFICAÇÃO EM GEL DE AGAROSE DO DNA AMPLIFICADO .................. 55 
3.7 PURIFICACÃO DOS PRODUTOS DE PCR ................................................................ 55 
3.8 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR NO SEQUENCIAMENTO ...................... 56 
3.9 SEQUENCIAMENTO DO EXON 1 DO KRAS PELO MÉTODO DE SANGER ........... 58 
3.10 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS ORIGINADAS DESTE ESTUDO ............................... 59 
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................................. 60 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 61 
5.1 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA EM AMOSTRAS DE CAVB EM FFPE 61 
5.2 AMPLIFICAÇÃO PELA PCR ....................................................................................... 62 
5.3 SEQUENCIAMENTO PELO MÉTODO DE SANGER ................................................. 64 
5.4 O GENE KRAS EM CARCINOMA DE VESÍCULA BILIAR ...................................... 72 
6 CONCLUSÃO.................................................................................................................... 75 
REFERÊNCIAS......................................................................................................................78 
17 
 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 
1.1 CARCINOMA DE VESÍCULA BILIAR 
 
Em 1777, Maximilan DeStoll com base em autópsias descreveu pela primeira vez o 
carcinoma de vesícula biliar (CaVB). No entanto, uma melhor caracterização foi publicada 
somente 200 anos depois da descrição de DeStoll (LAZCANO-PONCE et al., 2001; 
MOHAMED, et al., 2010). 
A vesícula biliar é uma víscera oca, em forma de pera, de cor azulada, com cerca de 7 
a 10 cm de comprimento e 3 a 4 cm de largura, com paredes delgadas de tecido muscular e 
fibroso, situada no leito inferior do fígado (fosseta cística), amarrada por tecido conectivo 
frouxo, rico em vasos sanguíneos e linfáticos. Está dividida anatomicamente em três regiões: 
infundíbulo ou colo livre do peritônio, corpo e fundo recoberto pelo peritônio. No colo estão 
as glândulas e o epitélio que secretam mucina. 
A vesícula biliar é um órgão hormônio-dependente (ROCHA, 2004). Sua função é 
armazenar e concentrar na região fundica, um volume de 30 a 50 ml de bilis produzida no 
figado. Ela é constituída por quatro camadas teciduais: (1) a mucosa (epitélio cilíndrico e 
colunar simples revestido por microvilosidades e a lâmina própria - tecido conjuntivo frouxo), 
(2) uma camada de músculo liso (única e delgada), (3) uma camada de tecido conjuntivo 
frouxo perimuscular que é contíguo com o tecido conjuntivo interlobular do fígado, e (4) a 
serosa, mas, não há camada subserosa (peritônio visceral) na superfície superior da VB em 
contato e adjacente ao fígado e nem a muscular da mucosa (WISTUBA; GAZDAR, 2004). 
De acordo com os achados no momento do diagnóstico, a ausência da serosa e o tecido 
perimuscular compartilhado favorece a disseminação do tumor da parededa VB para órgãos 
adjacentes e a extensão do tumor direto para o leito do fígado, principalmente pela via 
linfática (WISTUBA; GAZDAR, 2004; CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; SRIVASTAVA 
et al., 2011; DUTTA, 2012). 
O CaVB é a lesão cancerosa mais frequente da árvore biliar, e o quinto câncer mais 
frequente do trato gastrointestinal no Brasil (LAZCANO-PONCE et al., 2001; PAIS-COSTA, 
2008; TORRES; ÁLVARO; AMARAL, 2010), e em várias outras etnias (WISTUBA; 
GAZDAR 2004; SHIH et al., 2007; STANCU et al., 2007; ELDON, 2008; AGRAWAL et al., 
2010; MOHAMED et al., 2010; CZIUPKA et al., 2012). É uma neoplasia maligna com 
características de alta heterogeneidade sintomatológica não específica desde sua descoberta 
18 
 
 
 
até os nossos dias, a biologia do tumor ainda é pouco conhecida, contribuindo para a 
manutenção de sua alta letalidade (AKE, 2012a; CZIUPKA et al., 2012). 
Clinicamente o CaVB é uma neoplasia rara, assintomática, diagnosticada tardiamente 
por acidente, apresentando grande invasão loco- regional (LOBO; PRASAD; SATOSKAR, 
2012), quimio-radiorresistente (ou pouco responsiva a maioria destas terapias, salvo 
exceções) e com prognóstico geralmente desfavorável (ECKEL; SCHMID, 2007; LAI; LAU, 
2008; PARK et al., 2008; FAN et al., 2010; ZHU et al., 2010; QU et al., 2012; DUTTA, 
2012). Apesar de grande parte dos CaVB ser de difícil detecção (ZHU et al., 2010; QU et al., 
2012), a maioria são benignos (VIALLE et al., 2008; PARK et al., 2008; AKE, 2012a). 
O CaVB apresenta incidência muito variável de acordo com o gênero e a origem 
etnogeográfica (veja a figura 1). Há áreas geográficas de concentração espalhadas pelo 
mundo, o exemplo característico é o Chile, onde é altíssima a taxa de mortalidade (35/100.000 
indivíduos por ano) (LAZCANO-PONCE et al., 2001; ELDON, 2008; DUTTA, 2012). De 
modo geral, a frequência de CaVB é baixa em relação aos demais cânceres, representando 
uma parcela de 0,7 a 1,2%. No total de material de colecistectomia representam 1 a 3% 
(TORRES; ÁLVARO; AMARAL, 2010; LOBO; PRASAD; SATOSKAR, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
As maiores taxas de incidência de CaVB foram registradas na América do Sul 
(América Andina), América do Norte (índios do Novo México e índios americanos) e norte da 
Índia (WISTUBA; GAZDAR, 2004; GABBI et al., 2010; DUTTA, 2012). 
Figura 1: Incidência do carcinoma de vesícula biliar no mundo. Mulheres em áreas risco está em verde 
demonstrando os países com alta incidência (< 9 mulheres/100.000 habitantes). Moderada e alta 
incidência do CaVB é observado nas áreas em lilás, cuja incidência é em torno de 4 a 9 
mulheres/100.000 habitantes. 
Fonte: WISTUBA; GAZDAR (2004). 
19 
 
 
 
No oriente é muito frequente em alguns países do Extremo Oriente da Ásia, incluindo 
a Coréia, Japão (7/100.000), Shanghai (onde os índices de prevalência tem aumentado 
consideravelmente) e norte da Índia (21,5/100.000 para as mulheres de Delhi) 
(SRIVASTAVA et al., 2011). O CaVB é a principal causa de morte oncológica no sexo 
feminino no norte da Índia (ELDON, 2008; DUTTA, 2012). 
No ocidente este carcinoma é raro, exceto entre os índios americanos nos EUA 
(KAUSHIK, 2001; LAZCANO-PONCE et al., 2001; WISTUBA; GAZDAR, 2004; ELDON, 
2008; GOLDIN; ROA, 2009). No Chile, a prevalência é de 18,1 por 100.000 no sexo 
feminino (SRIVASTAVA et al., 2011), sendo o segundo tumor mais frequente do trato 
gastrointestinal (TGI). É encontrado em 3 a 4% dos espécimes colecistectomizados na Bolívia 
(11,3 por 100.000 em mulheres), Peru, Equador e Quito onde a taxa de incidência é 
12,9/100.000 habitantes (LAZCANO-PONCE et al., 2001; ANDIA et al., 2008; NATH; 
GULATI; SHUKLA, 2010; PAIS-COSTA, 2012). Na América do Sul, em áreas de risco, o 
Chile é o país com as maiores taxas de mortalidade por causa oncológica biliar, 
principalmente entre os ameríndios Mapuche (35 mortes por 100.000 habitantes). O número 
de óbitos - taxa bruta - por CaVB no Chile, aumenta continuamente segundo os registros. No 
sul do Chile (região de Araucánia), o CaVB faz mais vítimas femininas sucumbirem que os 
cânceres de mama, pulmão e colo uterino. Na cidade chilena de Valdivia é o segundo câncer 
mais incidente e a primeira causa de morte nas mulheres. (HENSON; ALBORES-
SAAVEDRA; CORLE, 1992; KAUSHIK, 2001; LAZCANO-PONCE et al., 2001; 
WISTUBA; GAZDAR, 2004; RIQUELME et al., 2007; ANDIA et al., 2008; ELDON, 2008; 
GARCÍA et al., 2009; ZHU et al., 2010; MULLER et al., 2011). Mesmo nos subtipos de 
CaVB (e.g. no carcinosarcoma) o sexo mais atingido também é o feminino (GABBI et al., 
2010; ZHU et al., 2010), chegando a razão de 6 ou mais mulheres para 1 homem. No Brasil, 
a proporção é de 3 mulheres para 1 homem (LAZCANO-PONCE et al., 2001; PAIS-COSTA 
et al., 2008; ISHAK et al., 2011). A frequência de CaVB é acentuada no Paquistão 
(11,3/100.000), Israel (7,5 para homens e 13,8 para mulheres para 100 mil habitantes). No 
México e no Novo México (índios americanos) o CaVB tem incidência de 8,5/100.000 
habitantes, entre todas as neoplasias, embora esta incidência tenha diminuído entre os índios 
(ANDIA et al., 2008; GABBI et al., 2010). Na América do Norte e na Austrália as taxas de 
morte por CaVB diminuem há 16 anos (LAZCANO-PONCE et al., 2001). Na Europa 
oriental, a incidência é alta na Polônia (4,8 e 23,1/100.000 habitantes, para homens e 
mulheres, respectivamente), na República Checa e Eslovakia (GOLDIN; ROA, 2009). 
20 
 
 
 
A incidência de CaVB no Brasil gira em torno de 0,8%, sendo o Rio Grande do Sul o 
estado com a maior incidência, com 3,09 de óbitos por 100.000 habitantes (LAZCANO-
PONCE et al., 2001; WISTUBA; GAZDAR, 2004). 
A maior incidência do CaVB em países subdesenvolvidos faz com que alguns autores 
sugiram a existência de uma associação entre este câncer e a pobreza (ANDIA et al., 2008). 
No entanto, a pobreza não é considerado um fator de risco robusto fora das áreas de risco. É 
notório o fato de que as mulheres africanas apresentam baixas incidência de CaVB (TORRES; 
ÁLVARO; AMARAL, 2010), embora, seja considerado raro em negros. A baixa incidência 
para o CaVB também ocorre nos caucasianos da Europa Ocidental e EUA e, para estes povos 
o CaVB é muito letal (ECKEL; SCHIMID, 2007; WOLF et al., 2010). Nos EUA são descritos 
em 5000 novos casos/ano, com 2500 mortes, sua incidência maligna no trato gastrointestinal é 
de 0,5% (ECKEL; SCHIMID, 2007; ELDON, 2008; GABBI et al., 2010) 
O diagnóstico do CaVB - CID-O C23.0 - geralmente é tardio, no intra-operatório ou, 
menos comumente no pós-operatório seguido pelo pré-operatório de doença benigna da VB. 
O diagnóstico pode ser obtido por meio de análise macroscópica da VB, mas a sugestão é a 
confirmação por exame histológico (anátomo-cirúrgico [patológico]) da peça extirpada. Para 
90% dos casos com diagnóstico precoce a sobrevida é de 10 anos (VELOSO; RODRIGUES, 
2011). Exames, fatores demográficos, fatores de risco independentes devem ser requisitados 
com o objetivo de aumentar a acurácia para o diagnóstico precoce do CaVB (AGRAWAL et 
al., 2010; AKE, 2012a; DUTTA, 2012; GIANG et al., 2012; PAIS-COSTA et al, 2012). 
Geralmente, os pacientes recebem o diagnóstico de CaVB com idade média de 73 anos 
(EDON, 2008; SHRESTHA et al., 2010; CZIUPKA et al., 2012), no Brasil essa média cai 
para 71 anos (TORRES; ÁLVARO; AMARAL, 2010; PAIS-COSTA et al, 2012). 
 
 
1.2 DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO 
 
Exames histopatológico em espécimes cirúrgicos, em material de biópsias frescos ou 
parafinados de vesícula biliar humana tem-se mostrado importante para a confirmação do 
diagnóstico do tumor (GIANG et al., 2012; PAIS-COSTA, 2012), além de prestar-se para a 
buscade fatores para a predição de prognóstico (CHAUBE et al., 2006; AKE, 2012a; DUTA, 
2012; TOLEDO et al., 2012). É indiscutível o valor agregado ao material de arquivo na 
demonstração e consensualização de princípios e normas de estudos em cânceres diversos, 
incluindo o CaVB. 
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O estudo histopatológico da VB é o padrão ouro para distinguir os casos benignos dos 
malignos, inclusive para a identificação de malignidade oculta (SHRESTHA et al., 2010; 
VELOSO; RODRIGUES, 2011; LOBO; PRASAD; SATOSKAR, 2012). 
De acordo com o relatório do Royal College of Pathologists, toda VB deve ser 
examinada histologicamente, pois a malignidade pode estar oculta mesmo quando 
características morfológicas apresentarem normais. Algumas condições benignas da vesícula 
biliar podem ser confundidas com o CaVB quando o diagnóstico histopatológico é 
desprezado. 
A adenomiomatose faz parte das lesões degenerativas benignas da VB (BOSCAK et 
al., 2006), mas pode apresentar potencial malignidade ao promover o espessamento tanto do 
epitélio da parede como da camada muscular da VB (TRIVED et al., 2008; TORRES; 
ÁLVARO; AMARAL, 2010). O exame histopatológico minucioso é um pré-requisito para 
identificação de lesões pré-neoplásicas suspeitas, para evitar que a subjetividade traga à tona o 
o letal diagnóstico falso negativo (VELOSO; RODRIGUES, 2011; GIANG et al., 2012). 
A classificação de CaVB de acordo com a histopatologia mostra que entre 80 a 90% 
dos casos são adenocarcinomas (veja a tabela 1). Nem todos os percentuais de incidência e 
seus respectivos tipos celulares de CaVB foram citados. 
 
Tabela 1: Classificação Histológica (Tipos celulares) do CaVB. 
Tipos celulares (histopatológicos) Incidência % 
1 - Adenocarcinoma 80 a 90% 
2 - Carcinoma papilar 6% 
3 - Adenocarcinoma, tipo intestinal 2,0% 
4 - Adenocarcinoma mucinoso 4 a 5% 
5 - Adenocarcinoma de células claras 0,5% 
6 - Carcinoma de pequenas células (G4) < 5% 
7 - Carcinoma adenoescamoso (G4) 3% 
8 - Carcinoma escamoso 3% 
9 - Ca com células tipo anel-de-sineto G4 (PP e baixa incidência). ________ 
10 - Carcinoma indiferenciado (G4) 6% 
11 - sarcoma 0,2% 
Fonte: Adaptado de REID; RAMOS; DONOHUE (2007). 
 
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O grau histológico está correlacionado com o prognóstico, sendo que quanto maior o 
grau pior o prognóstico. Os adenocarcinomas são classificados de acordo com os graus 
citológicos de atipias celulares. São quatro os graus de diferenciação celular (veja a tabela 2): 
carcinoma bem diferenciados, moderados, pouco diferenciados e indiferenciados ou seja, 
anaplásicos sem diferenciação (ROA et al., 2002). Entre 10 a 20% são os Carcinomas 
epiteliais suberoso que são pouco diferenciados e com 37% de sobrevida em 5 anos. O 
Carcinoma epitelial seroso apresenta 10% de sobrevida em 5 anos (ISHAK et al., 2011), 
enquanto que o Carcinoma de pequenas células apresenta uma sobrevida de 5 e 10 anos, de 8 
e 0%, respectivamente (ALBORES-SAAVEDRA et al., 2011). O adenoescamoso misto 
(glandular e mucoso, moderado e pouco diferenciado) é muito raro, representando 1 a 3,5% 
dos casos de CaVB e é caracterizado por infiltração local e metástase hepática. A duplicação 
celular do Carcinoma adenoescamoso misto é cerca de metade do tempo que aquela dos 
adenocarcinomas, com pior prognóstico (ROJAS et al., 2010; ALBORES-SAAVEDRA et al., 
2011). O Carcinoma escamoso se caracteriza por crescer lentamente e geralmente não 
apresentar metástase, mas seu prognóstico comparado ao adenocarcinoma é pior (RAI et al., 
2009). 
 
Tabela 2: Grau Histológico descritivo de diferenciação e conteúdo glandular dos CaVB. 
Grau Diferenciação Tumor Conteúdo glandular em % 
 
G1 
 
Bem 
 
adenocarcinomas 
 
+ 95% de glândulas. 
G2 Moderadamente carcinomas 50-95 % de glândulas. 
G3 Pouco carcinomas. 5-49 % de glândulas. 
G4 Indiferenciado carcinomas - 5% de glândulas 
Fonte: Adaptado de TORRES (2010). 
 
 
Está estabelecida a relação de influência do grau histológico do tumor na sobrevida 
dos pacientes após o diagnóstico: grau 1, a média de sobrevida global é de sete meses, 
enquanto, no grau 3 (e os adenocarcinomas indiferenciados) a média de sobrevida cai para 
cerca de três meses (HENSON; ABORES-SAAVEDRA; CORLE, 1992). Quanto mais 
diferenciado é o grau citológico melhor é o prognóstico, desse modo, o grau histológico e o 
estadiamento patológico TNM estão relacionados ao prognóstico. 
 
 
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1.3 DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO POR IMUNOHISTOQUÍMICA EM CAVB 
 
Até recentemente, os únicos fatores prognósticos reconhecidos para o CaVB eram: o 
tipo, o grau histológico da lesão, a invasão vascular e o estadiamento do tumor. Esses fatores 
ainda são muito utilizados, mas o advento de várias técnicas moleculares tem otmizado a 
acurácia do diagnóstico e consequentemente favorecido o prognóstico. Atualmente há uma 
corrida em busca de marcadores biológicos que possam ser validados para atuar 
complementando os parâmetros clínicos e histopatológicos norteando a apuração do 
diagnóstico diferencial em CaVB. Já fora identificadas uma gama de proteínas como 
potenciais marcadores tumorais para otimizar o prognóstico em CaVB (TORRES; ÁLVARO; 
AMARAL, 2010). No entanto, testes moleculares específicos para detectar este câncer em 
estágio precoce ainda não tem. Relevantes avanços tecnológicos e metodológicos na área de 
biologia molecular permitiram fazer uso de biópsias fixadas em formalina neutra (solução 
aquosa de formaldeído a 3,7 ou 4%, convencionalmente a 10%) e emblocadas em parafina 
(Formalin fixed parafin embebed - FFPE). As técnicas permitem análises moleculares por 
imuno-histoquímica testando vários marcadores para diagnóstico e preditores de prognóstico 
em tecidos FFPE (FOX; HARRIS, 2004; ROCHA, 2004). 
Os marcadores tumorais são macromoléculas produzidas primariamente pelo tumor ou 
pelo hospedeiro em resposta à atividade tumoral. Podem ser investigados para sua presença 
no tumor, no plasma ou em outros fluídos corporais. A lista dos marcadores tumorais é 
enorme, mas aqui limitou-se a considerar aqueles melhor estudados ou mais divulgados e 
alguns, cujo uso é melhor reportado em diagnóstico e prognóstico de CaVB. 
Biomarcadores imuno-histoquímico isolados não tem sido suficientes para estabelecer 
diagnóstico ou prognóstico em CaVB, então, é razoável constituir um rol desses marcadores 
para otimizar a precisão tanto na detecção como na mensuração da evolução deste câncer. O 
conjunto de marcadores moleculares discutidos aqui é constituído de uma seleção de 
proteínas, cuja expressão foi estudada e revisada sistematicamente em artigos recentes 
(CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; MALAGUARNERA et al., 2011; AKE, 2012b; 
MAURYA et al., 2012). 
Glicolipídeos adsorvidos no folheto externo da membrana plasmática constituindo o 
glicocálix são as mesmas moléculas de adesão endotelial expressas por células cancerosas 
frequentemente usadas para diagnóstico e resposta ao tratamento quimioterápico em CaVB, 
mas alguns também se prestam à auxiliar no prognóstico (TORRES; ÁLVARO; AMARAL, 
2010). 
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Os testes imuno-histoquímicos tradicionais são os que utilizam dos níveis de 
marcadores tumorais ou marcadores biológicos para diagnóstico sorológico associado ao 
desenvolvimento do tumor, no que se refere à invasão, metástases e prognóstico como os 
codificados pelos antígenos carboidratos: CA 19-9; CA125; CA15-3 (incluídos juntamentecom o CEA, no grupo dos epítopos na estrutura de carboidratos presentes em glicoproteínas 
ou glicolipídeos) e o CA 242. 
O antígeno CA 19-9 (glicolipídio CA 19,9, Sialyl Lewis A – SleA) é um 
tetrassacarídeo ligado à proteoglicanas na superfície da célula. Não apresenta especificidade 
por ser expressado em tecidos de diversos órgãos, mas pode facilitar a localização do tumor 
primário. Seu nível normal no plasma sanguíneo é de até 37U/ml, enquanto sua sensibilidade 
e especificidade são respectivamente, 79,4% e 79,2% (MALAGUARNERA et al., 2011). 
O antígeno carcinoembrionário (CEA) é uma imunoglobulina oncofetal glicosilada 
(como a maioria das proteínas da membrana plasmática), solúvel, específica para o cólon 
(cujo nível plasmático normal é de 5 a 10ng/ml), com função principal de promover a adesão 
entre as células hemolíticas normais. O CEA é secretado em níveis mais elevados em tumores 
gastrointestinais, portanto, auxilia no diagnóstico sendo sua superexpressão um potencial 
preditor de mau prognóstico em CaVB, (NOSHIRO et al., 2003; CHOI et al., 2004; 
MALAGUARNERA et al., 2011). Percebe-se que o CEA tem duplo papel no CaVB, como 
marcador de diagnóstico e prognóstico. Mas, numa reação negativa entre o antígeno CEA e o 
seu anticorpo é entendida como 100% de ausência do tumor, enquanto a coloração intensa no 
epitélio se traduz em 80% de probabilidade de CaVB (AGRAWAL et al., 2010). 
A sensibilidade do CA 19.9 e do CEA para CaVB é equivalente, porém a 
especificidade do primeiro é 20% maior que a do segundo (sensibilidade de 55% e 
especificidade de 99%). 
Esses imunorreativos são encontrados no soro sanguíneo, com níveis ocasionalmente 
elevados quando associados à tumores gastrointestinais. Porém, o CA 19.9 não se expressa 
em casos de lesão metaplásica antral e tumores de VB pouco diferenciados - G3 (AGRAWAL 
et al., 2010), enquanto o CEA é pouco expresso em epitélio displásico da VB (KAUSHIK, 
2001); células de tumores pouco diferenciados nem sempre secretam CEA, em contrapartida, 
os tumores moderados (G2) secretam mais CEA (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). 
Curiosamente, o CEA não é um antígeno com alta expressão em adenocarcinoma comum, 
mas é bem expresso em um tipo histológico raro de adenocarcinoma de VB, o tumor de 
células claras; um tumor de difícil diagnóstico e muito semelhante à metástase de carcinoma 
de células renais na VB (OVIEDO; LAZOS, 2004). 
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Há três padrões diferenciais de expressão de acordo com a região das células (apical, 
estromal e citoplasmática) epiteliais da mucosa da VB. O CA125 é um antígeno que tem seus 
níveis séricos aumentados em CaVB, além de ser considerado um preditor de invasão 
peritoneal que não é influenciado (mascarado) pela colecistite crônica (CHAUBE et al., 2006; 
MALAGUARNERA et al., 2011). Os níveis séricos de CA125 aumentados substancialmente 
sugere que o tumor já está num estágio avançado (T3 ou T4) e o prognóstico é ruim 
(MALAGUARNERA et al., 2011). No entanto, exames bioquímicos isolados não decidem o 
diagnóstico do câncer (SUSUMU et al., 2009), portanto, a superexpressão de CA19-9 isolada 
não é um preditor de malignidade, mas, preconiza-se que seja utilizado concomitante à outros 
marcadores bioquímicos para otmizar o prognóstico em CaVB (FONTES et al., 2012). 
Análises moleculares têm demonstrado que a perda ou diminuição da adesão celular é 
uma fase da transformação celular e está correlacionada à fenótipos malignos (invasão e 
metástase) em diversos tipos de cânceres. A importância dada hoje ao estudo de moléculas de 
adesão levaram à classificação das mesmas de acordo com suas propriedades bioquímicas e 
estruturais em: imunoglobulinas (Ig), integrinas, caderinas e selectinas (CHOI et al., 2004). 
Alterações na expressão destas proteínas (influenciadas por outras em vias metabólicas 
diferentes ou na mesma via, ou ainda, por defeito da própria proteína) tem atraído a atenção 
de pesquisadores no sentido de estudá-las como biomarcadores de prognóstico ou diagnóstico 
em diferentes tipos de cânceres. Assim, os estudos utilizam preferencialmente a detecção por 
coloração imuno-histoquímica devido à facilidade, rapidez e o baixo custo desse método 
(CHOI et al., 2004; PUHALLA et al., 2004). 
Altos níveis de expressão da glicoproteína endoglina podem ser detectados por imuno-
histoquímica utilizando anticorpos, anti-CD105 (FOX; HARRIS, 2004). Esta glicoproteína 
(hemodimérica, transmembranar com 180 kDa) é uma das mais bem estudadas devido à sua 
especificidade e superexpressão no endotélio densamente neovascularizado nas 
circunjacências do tumor, sendo um indicador de índice angiogênico, além de ser um 
componente acessório da estrutura do complexo de receptores do fator de crescimento 
transformante (TGF-β 1, fator supressor de linfócito T); o que a torna envolvida numa 
complexa via de sinalização que regula vários aspectos comuns do fenótipo celular canceroso 
(ROCHA, 2006; FONSATTI et al., 2009). 
Sabe-se que a angiogênese é fundamental para o crescimento de tumores sólidos 
quiescentes (ausência de proliferação celular), já que em estágio morfométrico entre 2 a 3 mm 
a nutrição e oxigenação tecidual por difusão simples não atende as demandas das células 
cancerosas. Diante deste princípio, alguns autores trabalhando com uma técnica (Chalkley) 
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padronizada internacionalmente, para quantificação por coloração imuno-histoquímica de 
proteínas específicas da angiogênese em áreas de altos índices de novos vasos sanguíneos, 
sugeriram a possibilidade de correlacionar a imunorreatividade com as proteínas VIIIAg, 
CD31, 34 e o 105 com o prognóstico de alguns cânceres (FOX; HARRIS, 2004). Então, a 
partir destes estudos, preconizaram o CD105 como um útil biomarcador preditor de 
prognóstico desfavorável em uma gama de cânceres de tecidos sólidos incluindo o CaVB, por 
diversos motivos como: 1) melhor pontuação em angiogênese; 2) especificidade e 
superexpressão no endotélio de novos vasos sanguíneos em torno e dentro do tumor e; 3) seu 
envolvimento com o TGF-β (ROCHA, 2006). 
A superexpressão de imunoglobulinas (Igs) em células epiteliais tem servido como 
ferramentas para prognóstico em diversos carcinomas, sendo sugestivas de estágio avançado 
via metatástica e, portanto, cotadas como um fator independente de mal prognóstico - menor 
sobrevida em CaVB (ROA et al., 2001; CHOI et al, 2011; JUNG et al 2011). As variantes de 
imunoglobulinas são produzidas em diversos epitélios e estão envolvidas no crescimento, 
comunicação celular, angiogênese, produção de citocinas, motilidade, invasão e adesividade 
dos epitélios (CHOI et al, 2004). 
Duas glicoproteínas (Ig) transmembranares CD54 (ICAM1, expressa em células 
hematopoiéticas) e a isoforma de CD44v6 (HCAMs, componente do receptor de adesão do 
ácido hialurônico), não são sintetizadas em epitélio biliar normal, a superexpressão de ambas 
(com simultânea queda de catenina e CD99) e superexpressão de CD147 e MMP2, 
imunoglobulinas foram correlacionadas à carcinomas avançados de VB (ROA et al., 2001; 
CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; CHOI et al, 2011; AKE, 2012a). Em contrapartida a 
superexpressão de CD56 e CD44s (“S” de standard, variantes da glicoproteína de superfície 
da forma padrão CD44, expressa em células malignas, correlacionadas com metástase em 
tumores sólidos) foi, respectivamente, correlacionada à adenomas da VB com pior 
prognóstico (infiltração tumoral vascular, linfática e metástase) (CHOI et al., 2004; LEE et 
al., 2008). 
A chave para a manutenção da identidade da célula epitelial é a expressão deE-
caderina e β-catenina, proteínas que são necessárias para a adesão intercelular (junção de 
aderência) ao longo das superfícies laterais de células epiteliais adjacentes. Esse sistema é 
responsável por mecanismos de crescimento e proliferação co-operadores do 
desencadeamento de eventos que favorecem a tumorigênese em CaVB, e em tantos outros 
órgãos, por suspender a adesão celular. A expressão alterada destas moléculas de adesão em 
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tumores, potencialmente afeta a adesão intercelular e favorece o risco de progressão e o 
potencial metastático do tumor. 
A perda de aderência celular é um ponto crítico e característico da desorganização do 
complexo E-caderina/catenina e está correlacionado à prognóstico ruim (quando comparado 
com a queda de apenas uma das proteínas do complexo) devido ao aumento do potencial 
metastático durante a progressão do CaVB (YANAGISAWA et al., 2001; ROA et al., 2002; 
CHOI et al., 2004; HIRATA et al., 2006). 
A E-caderina também denominada caderina epitelial (glicoproteína transmembrana de 
sete passagem, dependente de cálcio localizada na porção basolateral de todo epitélio) é a 
principal molécula de adesão, sua expressão constante em epitélios é necessária à manutenção 
e regulação da adesão intercelular e a associação às cateninas e outras proteínas presentes na 
junção aderente de células epiteliais. A E-caderina se expressando normalmente, também 
inibe a transição de célula epitelial tumoral para mesenquimal (TEM) regulando a 
diferenciação e o crescimento celular, por manter o fenótipo epitelial normal: mobilidade, 
ancoramento e orientação (ROA et al., 2002; DENADAI et al., 2006). A expressão de E-
caderina apical no epitélio normal da VB é reduzida, em comparação com o epitélio escamoso 
propício à carcinoma escamoso (AKE , 2012b). 
A expressão de β-catenina normalmente se dá em baixos níveis no citoplasma e no 
núcleo celular (CHOI et al., 2004). No estudo de Puhalla et al (2005) e Ake (2012b), a 
expressão reduzida de E-caderina foi correlacionado com CaVB invasivo de grau 4 
(indiferenciado). Há sugestão para a E-caderina ser validada como um marcador de 
prognóstico em CaVB (AKE, 2012b). 
A fosforilação da β-catenina pela enzima GSK-3β, com sua posterior degradação pelo 
sistema proteossômico da ubiquitina, é um processo regulatório da sua própria expressão, 
monitorada pela proteína do gene APC (adenomatus polyposis coli - supressor de tumor) 
complexado à GSK-3β, interação promovida pela proteína axina. Em caso de mutação com 
inativação do APC interrompe-se o complexo e o controle da expressão (pelo APC) de β-
catenina que sem se expressar torna-se estável no citoplasma (YANAGISAWA et al., 2001). 
As divisões celulares em adenomas tem se mostrado em menor número, considerando-
se uma unidade de tempo, quando comparadas às divisões em CaVB (YANAGISAWA et al., 
2001). O pool (conjunto) alterado de beta-catenina nuclear, citoplasmática ou apical também 
foi significativamente maior em adenomas do que nos subtipos histológicos de 
adenocarcinomas (papilar, tubular e intestinal) ou em displasias (YANAGISAWA et al., 
2001; CHANG et al., 2002; KIMURA et al., 2003; PUHALLA et al., 2005). Esse aumento da 
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expressão de beta-catenina foi correlacionada com menor agressividade (CHANG et al., 2002; 
PUHALLA et al., 2005). Em alterações metaplásicas, displasias de baixo grau, adenomas e 
CaVB há uma queda dos níveis de expressão de β-catenina (CHOI et al., 2004). Essa 
expressão apical diminui quando observada a sequência, epitélio normal – CIS (AKE, 2012b). 
Estes estudos, cujos resultados são autoexplicativos pela função de adesão alterada da 
β-catenina, apenas confirmam a relação quantitativa do biomarcador e o grau de invasividade 
dos carcinomas assim como, sua inalteração no epitélio hiperplásico e displásico. A redução 
de beta-catenina apical foi correlacionada ao grau histológico do tumor em moderado a pouco 
diferenciado, desse modo, suas características de marcador biológico estão associados a mau 
prognóstico (CHANG et al., 2002; KIMURA et al., 2003; PUHALLA et al., 2005). A 
superexpressão de β catenina, como um único marcador testado, pode ser imunopositiva em 
mais de 50% dos espécimes de vesículas carcinomatosas (KIMURA et al., 2003). 
A T-caderina ou H-caderina, produto do gene CDH13, é expressa em diversas células 
epiteliais e, além da função de adesão célula-célula e transdução de sinais, também é 
supressora de tumor. A redução de sua expressão devido à hipermetilação na região 
promotora do gene com consequente silenciamento do mesmo está associada à alterações 
histológicas que favorecem a invasão do CaVB para órgão adjacentes (ADACHI et al., 2009). 
A imunoexpressão de moléculas de adesão L1 em CaVB é positiva (mas, não ocorre 
em epitélio normal) e pode ser usada como um fator preditor de redução de sobrevida e 
desenvolvimento do tumor, está associada à disseminação linfática e hematogênica, 
correspondendo ao grau 3 de diferenciação celular (CHOI et al, 2011). 
A região promotora do gene MUC, contém ligação para o NF-kB (fator nuclear-Kb) 
para TNFalfa, o receptor de estrogênio e de progesterona, codifica para a proteína MUC1, a 
mais estudada entre todas as mucinas relacionadas à cânceres (LEE et al., 2012). No entanto, 
as mucinas são uma família de glicoproteínas transmembranares com 14 membros, que se 
expressam na superfície externa da membrana plasmática (esse produto também é secretado 
para o lúmem da vesícula é um órgão hormônio-dependente) de células glândulares e ductais 
de mucosas normais (SASATOMI et al., 2000). 
Aqui será revisado o papel das mucinas 1,2 e 4, por serem estas as proteínas da família 
MUC mais estudadas até o momento em CaVB (LEE et al., 2012). A expressão MUC1 
(também conhecida como pan-epitelial por se expressar nos epitélios de modo geral) aumenta 
à medida que as células epiteliais vão perdendo sua polaridade. A perda de polaridade apical-
basal, é decorrente e diretamente proporcional às variações na histologia do epitélio vesicular 
e sua expressão citoplasmática detectada por imuno-histoquímica se traduz em progressão 
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tumoral com potencial invasão e metástase linfática, está associada a mau prognóstico 
(CHANG et al., 2009; CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; MAURYA et al., 2012). 
A MUC1 não se expressa em mucosa normal, mas é frequentemente encontrada 
superexpressando em CaVB (CHANG et al., 2009; MAURYA et al., 2012). A MUC1 e 2 
expressa fracamente em vesícula biliar inflamada, mas tem sua expressão aumentada à 
medida que as lesões vão se aproximando do CIS (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; LEE 
et al., 2012). Chang et al (2009) e Maurya et al (2012), sugerem a MUC1 como: (1) um 
marcador de progressão maligna, porque a MUC1 aumenta sua expressão à medida que as 
alterações histológicas vão evoluindo rumo ao CIS e; (2) marcador de invasão associado à 
característica de expressão despolarizada da MUC1. 
A expressão de MUC2 diminui em tumores invasivos, enquanto a MUC1 está 
relacionada à proliferação de tumores invasivos com mau prognóstico, enquanto a maior 
expressão da MUC2 é associada à proliferação de tumores não invasivos com bom 
prognóstico (LEE et al., 2012). 
A expressão de MUC4 em CaVB foi correlacionada a sobrevida desfavorável, o tempo 
de expressão de MUC4 é um fator de risco independente (por si só,tem maior chance de 
desenvolver a doença) em CaVB, além de ser um bom preditor de prognóstico seria útil como 
um marcador para selecionar paciente com alto risco de desenvolver CaVB (LEE et al., 
2012). 
A cicloxigenase 2 (COX2) é encontrada superexpressa em CaVB (WATANABE et 
al., 2004; WISTUBA; GAZDAR, 2004), assim como também foram encontradas as caspases 
3, 6 e 8 (MAURYA et al., 2012). Foi demonstrado que a superexpressão da COX2 está 
correlacionado ao desenvolvimento das lesões precoces até o CaVB. Portanto, a 
superexpressão da COX2 tem potencial de um marcador biológico intermediário preditor de 
desenvolvimento do tumor (LEGAN et al., 2006; CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; 
MAURYA et al., 2012). A LOH de p53 estimula a superexpressão de COX-2, a baixa 
expressão de COX2 foi identificada na mucosa normal de VB, mas essas taxas aumentaram 
em displasias e CaVB (45 a 70%), sugerindo a expressão desde fases precoces com 
progressão à medida que a histologia diferencia em direção ao CaVB. 
A fosfoproteína TP53 selvagem (wt) é uma supressora de tumor, encontrada em pouca 
quantidade no núcleo das células e sua função é ligar-se ao DNA nuclear na interfase, 
regulando a proliferação celular, por mediar a transição celular da fase G1 para a fase de 
síntese. 
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A TP53 exerce uma função de “barreira molecular” em um ponto do ciclo celular, no 
qual ela checa e repara erros no DNA lesado e, quando esse objetivo não é alcançado ela 
direciona a célula lesada para as vias apoptóticas (AREVALO; ARIAS-STELLA; MONGE, 
2007). Esta proteína selvagem é pouco estável com uma vida média de 5 a 10 minutos 
(MAYORA; ARVELOS, 2011; AKE, 2012b). No entanto, quando mutada nas fases iniciais 
da transformação maligna (MAURYA et al., 2012), os núcleos destas células mutadas 
superexpressam a oncoproteína TP53 com uma vida média aumentada entre 5 e 20 minutos, 
podendo se estender por hora (ROCHA, 2004; WISTUBA; GAZDAR, 2004; MAYORA; 
ARVELOS, 2011; AKE, 2012b). 
A baixa expressão da TP53 coincide com a etapa de displasias, associada à colecistite 
crônica e a alta expressão coincide com o CaVB (WISTUBA; GAZDAR, 2004; AREVALO; 
ARIAS-STELLA; MONGE, 2007; CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). Essa expressão vai 
acumulando no núcleo celular, à medida que o tumor vai progredindo, portanto, correlaciona-
se com o estadiamento, tipo e o grau histológico do tumor (WISTUBA; GAZDAR, 2004; 
AGRAWAL et al., 2010; MALAGUARNERA et al., 2011). Sua máxima expressão coincide 
com CIS e carcinoma invasivo (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). Dessa forma, por 
imunohistoquímica pode-se inferir a dosagem sérica de anticorpos anti p53, como um 
marcador bioquímico em pacientes acometidos por CaVB (AKE, 2012b), emergindo então 
um marcador de progressão tumoral. No que se refere a utilização da TP53 como marcador de 
prognóstico, primeiro é necessário estabelecer qual é realmente a relação entre a sua 
superexpressão, a sobrevida e a reincidência (WISTUBA; GAZDAR, 2004; MAURYA et al., 
2012), tendo em vista que esta proteína é frequentemente encontrada mutada em CaVB 
(AREVALO, ARIAS-STELLA; MONGE, 2007; AKE, 2012b). 
O Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF), é um indutor de proliferação 
celular (via Ras/MAPK) e do extravasamento vascular. O VEGF foi identificado imuno-
histoquimicamente em quantidades significativas em colecistites crônica e, principalmente em 
adenomas e CaVB (35-75% e 38- 91%, taxas respectivas). Sua maior expressão foi observada 
em tumores avançados, portanto, suporta um tripé que correlaciona superexpressão do 
produto de VEGF, do TP53 e a progressão do tumor, com incremento de vasos sanguíneos 
requeridos para o metabolismo do tumor (DIGIOVANNI; KIGUCHI, 2008). A 
superexpressão é acompanhada de menor diferenciação histológica, tumor avançado 
relacionado à metástase (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). No entanto, nem todos 
concordam que a expressão do fator de crescimento de vasos sanguíneos deve ser utilizado 
como parâmetro para prognóstico (MAURYA et al., 2012). 
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A análise do EGFR (fator de crescimento epidermal, também conhecido como 
ERBB1, com atividade tirosina quinase ativam serina/treonina quinases citoplasmáticas) 
mutado pode ser feita via imuno-histoquímica, detectando as proteínas fosforiladas requeridas 
pela via de sinalização intracelular a jusante de MAPK e AKT (LEONE et al., 2006). O 
aumento de tecido intersticial diminui a porcentagem de positividade imunorreativa da 
proteína do EFG, enquanto aumenta a positividade da proteína do fator de crescimento 
transformante (TGF-β 1), estas proteínas foram detectadas em colecistite crônica e em CaVB 
(YUKAWA et al., 1993). A superexpressão da proteína EGFR está relacionada à metástase 
linfonodal, a proliferação celular, ao bloqueio da apoptose (LEONE et al., 2006) e sobrevida 
reduzida (CHENG et al., 2013). Essa oncoproteína fosforila substratos na via de sinalização 
para estimular mitoses, quanto maior a expressão da oncoproteína maior a agressividade do 
tumor (KAUFMAN et al., 2008), e mais desfavorável é o prognóstico. 
O marcador clássico, Ki67 é um antígeno nuclear, ativo em todas as fases do ciclo 
celular, exceto na interfase (G0), muito utilizado na clínica médica e quando expresso em 
altos níveis séricos é um indicador (marcador) de proliferação celular e agressividade em 
CaVB (MALAGUARNERA et al., 2011). A superexpressão de Ki67 (detectado por anticorpo 
em núcleos de células proliferativas) e p53 estão geralmente associadas à recidiva e menor 
sobrevivência em câncer de colo retal e outros, mas sua capacidade como preditor de 
prognóstico é baixa em CaVB (PUHALLA et al., 2004). Em CaVB escamoso foi imuno-
identificado um aumento na expressão de Ki67 em áreas proliferativas de células escamosas 
relacionado à maior número de mitoses nesse tipo histológico (ROJAS; MESSA; 
CHINCILLA, 2010; TOLEDO et al., 2012). O Ki67, foi observado mais reativo em lesões 
metaplásicas e CIS que em epitélio normal e adenomas (TOLEDO et al., 2012). A alta 
expressão de Ki67 está correlacionado a um prognóstico ruim (VARGA et al., 2004). 
As proteínas, p21
Wafl/Cip1
, p27
KIP1
 e p57
KIP2
 são inibidoras de todas as kinases 
dependentes de ciclina. São proteínas produzidas e degradadas a cada ciclo celular para se 
ligarem às CDKs e fosforilar diversos substratos fundamentais à intermediação nos vários 
pontos de checagem (checkpoints), assim, as CDKs e ciclinas modulam e conduzem a 
progressão da célula no ciclo celular (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). Fica subentendido 
que o ciclo celular é um dispositivo bioquímico compartimentalizado muito sensível às 
alterações moleculares no microambiente. Quando ocorre mutação com silenciamento da 
família WAFCIP1/KIP1 em tumores avançados leva à perda ou diminuição da expressão da 
p27. Essa redução na expressão outorga a célula vantagens proliferativas pela independência 
de sinais extra-celulares e insensibilidade à regulação interna, fazendo com que quando ambos 
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estejam mutados encontra-se uma menor sobrevida (MAURYA et al., 2012). A sobrevida de 
pacientes com expressão co-comitante de p21 e p27 está corelacionada à redução, em relação 
àqueles comimunoexpressão negativa da p21, correlacionados a maior sobrevida 
(CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). 
Os testes imunohistoquímicos em produtos proteicos do FHIT (tríade frágil do 
histidine) em CaVB, indicam que a baixa coloração em epitélio revela perda de expressão da 
proteína e, é quase ou totalmente imunorreativa, o KIP2 (dependente da proteína p57), um 
outro gene (GST) inibidor das kinases também tem sua expressão proteica depletada, a baixa 
expressão destas proteínas traduz-se em pior prognóstico (WISTUBA; GAZDAR, 2004; 
RIQUELME et al., 2007; CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; MAURYA et al., 2012). 
A superexpressão do produto do DPC4, altera a via de sinalização de TGF-β e, foi 
encontrado associado a CaVB, por suprimir o crescimento e a apoptose (WISTUBA; 
GAZDAR, 2004; MALAGUARNERA et al., 2011). Sugere-se que há uma relação entre a 
baixa expressão da proteína do TGF-β com a proliferação celular descontrolada no epitélio 
vesical. A superexpressão desta proteína não induz apoptose e nem inibe a proliferação, o que 
ocorre é a diminuição da expressão da proteína SMAD4 e do TβRII (SHEN et al., 2007). A 
expressão do TGF-β foi encontrada em maiores proporções em CaVB com metástase do que 
não metastático, além disso, a expressão elevada de TGF-β1 foi associada à progressão, 
invasão e metástase em CaVB (SHEN et al., 2007; GABBI et al., 2010). 
Danos na via de sinalização PI3K/AKT está relacionado à iniciação e progressão do 
CaVB. A superexpressão da proteína ERK 1/2 nesta via foi relacionada à lesões benignas em 
estágios iniciais. Mas essa expressão também foi correlacionado à lesões adiantadas e pouco 
diferenciadas, a invasão local, nódulos linfáticos e metástase (CHENG et al., 2013). 
A imunoexpressão da oncoproteína MYC está associada à prognóstico ruim com papel 
relevante na angiogênese, invasão e metástase (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; 
MALAGUARNERA et al., 2011; MAURYA et al., 2012). A expressão da proteína MYC 
participa das fases precoces, intermediárias e avançadas do CaVB, o percentual de 
positividade é proporcional ao dano (YUKAWA et al., 1993). 
Espera-se que a imunoexpressão das oncoproteínas do genes HER2 e BCL2 (proteínas 
que inibem a apoptose, da família homologous antagonist/killer) tenha impacto no 
crescimento tumoral. No entanto, o índice de apoptose em CaVB aumenta proporcionalmente 
ao dano tecidual em lesões pré-neoplásicas, atingindo seu maior patamar nos graus de 
diferenciação patológica 2 e 3 do CaVB (MAURYA et al., 2012). A superexpressão de 
ERBB2/HER2 (mesmo em casos em que o gene HER2 - sinônimo ERBB2 - não se 
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encontrava amplificado) foi detectada por imuno-coloração em metaplaisa intestinal e CIS 
(via displasia - CIS), na região basolateral do epitélio da VB (MAURYA et al., 2012; 
TOLEDO et al., 2012). Nesta região da membrana externa à célula medeia os sinais 
extracelulares que são internalizados e ativam a via Ras/MAPK de proliferação celular entre o 
mesênquima e o epitélio vesicular, via ERBB2, receptor transmembranar tirosina kinase. A 
proteína ERBB2 apresentou baixa expressão em carcinoma invasivo (CHAUBE et al., 2006; 
CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010; TOLEDO et al., 2012). Sua expressão imuno-
histoquímica, foi posititiva em displasia e em adenoma da VB, com (super)expressão em 
carcinoma da VB, associado a um pior prognóstico, em relação aos tecidos que não a 
expressam (WISTUBA; GAZDAR, 2004; DIGIOVANNI; KIGUCHI, 2008; CASTILLO; 
GARCÍA; ROA, 2010). Em adenoma papilar essa expressão indica ocorrência precoce no 
processo e, é encontrado em pacientes mais jovens (CHAUBE et al., 2006). 
Em um estudo recente, a ERBB2 foi identificada superexpressando em fases tardias do 
CaVB, em uma população do norte da Índia (BAITHA et al., 2012; MAURYA et al., 2012; 
TOLEDO et al., 2012). Mas, para Chaube et al (2006), a proteína ERBB2 poderia ser 
utilizada apenas como um marcador intermediário. 
O KRAS, através da via MAPK (Proteína Quinase Ativada por Mitógenos em seu 
resíduo [SER/TRE quinase]) e de suas proteínas efetoras, regula as seguintes funções 
celulares: ciclo celular, sobrevida, angiogênese, integridade do citoesqueleto, diferenciação, 
adesão e migração celular (ALBERTS et al., 2006). Devido a sua importância na homeostasia 
celular o KRAS é um dos alvos atrativos para estudos de terapia molecular do câncer devido 
principalmente a sua influência na proliferação celular e apoptose (via MAPK) alicerçado em 
seu status mutado (FRIDAY; ADJEI, 2005). Pelas vias PI3K e RAL, o KRAS regula a 
apoptose, exocitose e endocitose, respectivamente. 
Mutações ativadoras no gene KRAS são responsáveis por uma variante oncogênica da 
proteína Ras sinalizadora presente em cerca de 30 a 33% dos cânceres conhecidos 
(ALBERTS et al., 2006; FEHRENBACHER; BAR-SAGI; PHILIPS, 2009; KYRIAKIS, 
2009; RIELY; MARKS; PAO, 2009; NAGUIB, 2011). 
A proteína KRAS2B ou p21
Kras
 selvagem superexpressada pode agir como uma 
supressora de tumor induzindo a parada no ciclo celular ou derivando a célula para a apoptose 
(JANCIK et al., 2010). Muitos estudos relataram as oncoproteínas KRAS2B e TP53 em 
epitélio metaplásico e displásico (HOUSTON, 2001; KIMURA et al., 2003). 
Com técnicas de imunohistoquímica pode-se detectar e analisar quantitativamente 
tanto os adenomas quanto os carcinomas expressando normalmente as proteínas de reparo de 
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DNA (PAI; MOJTAHED et al., 2011). Estes genes estão inseridos num sistema de controle 
do bloqueio da proliferação celular patológica, mas, as informações relacionadas ao equilíbrio 
do ciclo celular em CaVB são escassas (RIQUELME et al., 2007; MAURYA et al., 2012). 
Os oncogenes Ras mutados pontualmente e ativados devido à alteração estrutural de 
sua proteína são mais sensíveis à tumorigênese (biologia do tumor) por eventos que propiciam 
a superexpressão da proteína KRAS (MCCOY; BARGMANN; WEINBERG, 1984). Através 
de estudos experimentais já demonstraram que a superexpressão dessa proteína conseguida 
por indução (utilizando ultravioleta ou radiação ionizante, choque térmico e citocinas) 
corrobora para o bloqueio do crescimento, apoptose e senescência celular, como um 
mecanismo de defesa, ou seja, tem atividade de um supressor de tumor (JANCIK et al., 2010). 
 
 
1.4 PROGNÓSTICO BASEADO EM ANÁLISE DE DNA 
 
Os primeiros conhecimentos da genética molecular das neoplasias originaram-se de 
estudos sobre tumores virais e consequentemente as descobertas dos proto-oncogenes como 
codificadores de proteínas reguladoras da apoptose, do crescimento e da diferenciação celular. 
Estas proteínas são estimuladas por ligantes externos à célula, que participam da transdução 
de sinais externos, transmitindo e amplificando estes sinais internamente e, assim regulam 
rigorosamente, os processos celulares normais sob o controle rigoroso do ciclo celular 
(WEINBERG, 2008). Estes proto-oncogenes mutados são ativados ou desativados e perdem 
sua função regulatória da homeostasia celular passando, então, a codificar proteínas 
insensíveis ao sistema de controle do ciclo celular (SCCC), que por sua vez superestimulam o 
crescimento, a proliferação celular, a perda interacional homotípica célula-célula (inibição por 
contato) e outros. São estes eventos que precedem a conversão de uma célula normal a uma 
maligna na ausência do controle apoptótico (ALBERTS et al., 2006; WEINBERG, 2008). 
Graças as amostras FFEP, os estudos (retrospectivos ou de caso) de base molecular, 
em câncer de baixa incidência,estão cada vez mais presentes (KAUFMAN et al., 2008), e têm 
demonstrado diversas alterações genéticas em cerca de 1281 genes (MAURYA et al., 2012), 
associados à carcinogênese (biologia do câncer) da VB (CASTILLO; GARCÍA; ROA, 2010). 
Atualmente, estas alterações são detectadas por diversas técnicas de biologia 
molecular, principalmente por PCR, PCR-RFLP ou PCR-Nested com sequenciamento 
automático direto ou indireto (ROA et al., 2005; LEONE e al., 2006). O estudo de alguns 
oncogenes implicados em CaVB tem sido pelo método PCR específica para a metilação do 
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promotor - MS-PCR (ROA et al., 2006; LETELIER et al., 2012). Quando se pretende analisar 
a hipermetilação em um conjunto de genes alvos pode-se realizar por amplificação multiplex 
dependente de sondas para metilação específica - MLPA (GARCIA et al., 2009). 
Alterações (deleções ou amplificações submicroscópicas) no número de segmentos de 
DNA, que variam de 1 kb a vários Mb, dispersas em cerca de 10% do genoma humano 
comparado a um genoma de referência, as denominadas CNVs (Copy Number Variations), 
parecem não ter sido investigadas ainda em CaVB (SRINVASTAVA et al., 2011). 
Estudos de instabilidade de microssatélites (MSI, microsatellites instability) em CaVB 
são raros, pouco incidentes (10% em chilenos) e inconclusivos para MSI-H (ROA et al., 
2005; RIQUELME et al., 2007; AKE , 2012b; MAURYA et al., 2012; CHENG et al., 2013). 
O perfil genético molecular em CaVB contabilizando as principais alterações de 
expressão gênica, perda de heterozigosidade e MSI foi alvo de extensa revisão bibliográfica 
(veja a figura 2). 
 
Figura 2: Perfil molecular e genético do Câncer de Vesícula Biliar. 
 
 
 
 
1.5 PROGNÓSTICO BASEADO NO STATUS MUTADO DO KRAS EM VÁRIOS 
CÂNCERES 
 
Cerca de 95% das mutações patogênicas, nos codons 12 e 13 do gene KRAS são 
identificadas em tumores malignos (LAZCANO-PONCE et al., 2001; WISTUBA; GAZDAR, 
Fonte: Adaptado de MAURYA et al., (2012). 
 
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2004; SAETTA, 2006; AUSCH et al., 2009; SEIXAS; COLLARES, 2011; SHEN et al., 
2011), é o proto-oncogene encontrado com maior incidência de mutações somáticas 
ativadoras em cânceres humanos é o KRAS (HOUSTON, 2001; HACHISUGA et al., 2005; 
MULLIN, 2005; AUNER et al., 2009). Mutações somáticas ativadoras neste proto-oncogene 
leva-o a ativação com ganho de função ou superexpressão. 
Três fenômenos genéticos são responsáveis por contribuir entre se para o 
aparecimento destes perfis ou standers mutacional por substituição de base: (a) uma das 
quatro bases é convertida em outra de acordo com as influências do meio; (b) as proteínas 
reparadoras de DNA danificadas e; (c) se o DNA mutado não é reparado resulta em alterações 
biológicas. 
A isoforma comumente mutada esporadicamente adquirida em cânceres humanos é 
oriunda do KRAS2B, donde decorrem mutações somáticas missenses nas posições codantes 
12, 13, 59 , 61, 63, 117, 119 e 146, estes aminoácidos circundam o bolso de catálise do GTP 
na proteína KRAS (FIORDALISI et al., 2003; JANCIK et al., 2010). 
De acordo com a literatura analizada, o KRAS2B está associado à diversos cânceres 
nas seguintes propoções: pâncreas (90%), colo-retal (40%), pulmão (30 a 50% dos casos), 
tireóide (50%), leucemias mielóide (30%), mama (5%) e outros como pele, bexiga, vesícula 
biliar, fígado, endométrio, colo do útero, e outros (TYNER et al., 2009; NAGUIB, 2011). 
Porém, várias outras mutações missenses (patogênicas) associadas à cânceres diversos já 
foram relatadas nas posições 146 (A146T) para câncer de colo retal e; posições incomuns 
tanto para leucemias mielóides (74, 141, 146), quanto para Síndrome Noonam (14, 34, 58, 
153, 156) outros resíduos também são trocados (TYNER et al., 2009). Mutações no exon 6 
do KRAS2B foram reportadas em indivíduos com diversas síndromes, inclusive a síndrome de 
Noonan (CARTA et al., 2006). 
Mutações missenses nos codons 12, 13 e 61 ativando o proto-oncogene KRAS e 
emergindo na via ras aberrante foram encontrados em cerca de 80-90% dos cânceres de 
pâncreas (NAGUIB, 2011). O montante de mutações no KRAS pode ser útil como uma 
ferramenta para auxiliar no diagnóstico de câncer de pâncreas (HACHISUGA et al., 2005). 
De acordo com Ogino et al (2009), estudos de base populacional tem demonstrado que 
cerca de 30% a 50% dos cânceres de colo-retal abrigam mutações pontuais nos três codons 
supracitados, e menos comumente no codon 146 das mutações relatadas para o KRAS (FENG 
et al., 2011) e, mutações nos codons 12 e 13 é sugestivo de pior prognóstico (EDKINS et al., 
2006). 
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Mutações acumuladas em diferentes vias moleculares envolvendo diversos genes, em 
particular o KRAS, num estágio adenomatoso avançado e precoce da carcinogênese em 
múltiplas etapas (FEARON; VOLGELSTEIN,1990), também está associado à progressão do 
câncer de colo-retal por transformação da mucosa retal normal em maligna, com a mutação 
mais frequente p.Gly12Val, associada a um pior prognóstico e menor sobrevida com maior 
probabilidade de recorrência (JONSSON et al., 2009; FENG et al., 2011). 
O câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC), responde por 80% dos dois 
tipos histológicos primários de câncer de pulmão. Há mais de 20 anos se sabe que no CPNPC 
os dois proto-oncogenes mais comumente encontrados mutados são os oncogenes KRAS 
(codons 12, 13 e 61) e o RFCE- receptor de fator de crescimento epidérmico (EDKINS et al., 
2006; WEINBERG, 2008). Acredita-se que as mutações no KRAS estão associadas à 
prognóstico ruim em câncer de pulmão avançado. Estudos tem reportado que a exposição ao 
tabaco é um nexo para esse câncer e mutação pontual ativadora do KRAS nos codons 12 e 13 
é incidente em cerca de 97% dos CPNPC, destes, 90% são adenocarcinomas de pulmão. 
Mutação no KRAS em células escamosas de pulmão é muito raro (RIELY; MARKS; PAO, 
2009). 
As leucemias mieloide aguda (LMA) são um grupo de doenças neoplásicas muito 
heterogêneas, com mutações cromossômicas e gênicas. A evolução de eventos mutagênicos 
até a gênese da LMA decorre de mutações nos mesmos hot spots tradiconais conhecidos com 
acréscimo para o codon 146 do KRAS (SABNIS et al., 2009). Conclui-se que esses quatro 
aminoácidos “titulares” são essenciais para a proteína KRAS gerir sua função catalítica 
normal, no entanto, mutações pontuais nestes codons estão comumente associadas às 
agressivas LMA em 25-30% dos casos esudados (EDKINS et al., 2006; AHMAD, 2009). 
O KRAS é um dos gene candidatos a mutar com ganho de função ativadora e está 
associado à 90% dos cânceres mieloproliferativos como as leucemias mielomonocíticas 
crônica e da primeira infância ou juvenil (LMMC e LMMJ) estas doenças por sinal são muito 
agressivas e letais (SABNIS et al., 2009), e não são sensíveis a quimioterapia convencional. A 
LMMJ e LMMC resulta de distúrbio na via efetora RAS/RAF/MEK/ERK com mutação no 
codon 12 (G12D), “assinatura molecular” de malignidade podendo evoluir para LMA 
(CUTTS et al., 2009; LYUBYNSKA et al., 2011). 
Em leucemia mieloide aguda (LMA), além dos hot spot tradiconais já conhecidos (nos 
codons 12G, 13G e 61Q), mutações adicionais ativadoras do KRAS, foram reportadas também 
para o codon A146 (ALA), no domínio GEF (fator de troca nucleotídeo