A1 CHG Vet2 2015 O estudo da célula e dos tecidos

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O estudo da célula e dos tecidos
A 1: Métodos de estudo
Disciplina: MOF 001
Turma: Veterinária 2
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Manter ambientes propícios para as reações ...
As membranas biológicas são constituídas de fosfolípides com proteínas associadas, 
Suas particularidades irão determinar o transporte seletivo de materiais e a interação da célula com o meio. 
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Organelas com membranas
As membranas das organelas são semelhantes à plasmática
Algumas bactérias desenvolveram mecanismos de geração de energia associados à membrana celular.
Cloroplastos e mitocôndrias são organelas provavelmente derivadas dessas bactérias.
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A Vida como um Processo
Do ponto de vista fisiológico, biossintético e reprodutivo, 
a célula é uma unidade funcional 
mantida pela relação entre seus componentes. 
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O Estudo das células
– O liquidificador: componentes bioquímicos 
Mas como se organizam esses componentes?
As células vivas : microscopia de contraste de fase, microscopia intravital
As células mortas: tecidos fixados, corados, microscopia de luz ou eletrônica
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Etapas da Histologia de Rotina
Fixação:
Evita autólise, mantém estrutura 
Formol, paraformaldeído, Bouin
Desidratação
Desidratação em série alcoólica crescente
Diafanização
Inclusão: apoio
parafina, resina
Microtomia:
cortes de 4-7mm
Rehidratação: 
em série alcoólica decrescente
Coloração:
Histológica
Histoquímica
Desidratação 
série alcoólica
Montagem
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Aumento x Resolução
Aumento:
Aumento da lente ocular x aumento da lente objetiva
A = Ocular x Objetiva
Limite de Resolução:
Depende do comprimento de onda
LR = kl 
Abertura Numérica
MO l= 0,55mm R~ 0,2mm
ME l= 0,005mm R~ ~0,0001mm
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http://www.udel.edu/Biology/Wags/histopage/histopage.htm
 
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Seqüência de etapas
Preparação do material para estudo 
aos microscópios de luz e eletrônicos
8. Coloração
9. Montagem
Remoção do órgão
 ou parte dele
Fragmentação do órgão 
em porções menores
Fixação
Desidratação
Inclusão
a. Em parafina para a ML
b. Em plástico para a ME
Microtomia
a. Com navalha de aço para a ML
b. Com navalha de vidro ou diamante 
 para a ME
Colocação do corte
a. Sobre lâminas de vidro para a ML
b. Sobre grades e redes metálicas
 para a ME
Coleta de Material 
Consiste na obtenção do fragmento de órgão 
a ser estudado
O órgão é retirado do animal anestesiado e recortado em fatias 
de no máximo 3 mm de espessura.
Deixar o fragmento coletado no líquido fixador, por tempo determinado, de acordo com a solução utilizada.
Os líquidos fixadores variam desde uma substância química isolada, como o álcool, o formol, até as misturas fixadoras, como o Bouin. 
Fixação
Processo que se destina a “matar” as células, procurando manter sua estrutura preservada, o mais próximo possível do que seria no animal vivo.
Desidratação - O material é imerso em vários banhos de álcool, em ordem crescente de concentração, até o álcool absoluto.
Diafanização – O material é imerso em xilol, para clareamento.
Imersão em parafina – O material é mantido em parafina líquida, a 58 graus (em estufa), por tempo determinado.
Inclusão
A inclusão consiste em colocar o corte em fôrma, cobrindo-o com parafina líquida, que se fundirá à temperatura ambiente. Antes de incluir é necessário desidratar a peça, diafanizá-la e mergulhá-la em parafina líquida.
O bloco de parafina contendo o fragmento é colocado no suporte do micrótomo; após regular a espessura dos cortes em micrômetros, são retiradas fitas de parafina contendo o material. 
Microtomia
Consiste na obtenção de cortes finos, que serão corados para observação
A colocação da fita de parafina em “banho-maria” a 40oC distende os cortes, que são recolhidos em lâminas de vidro.
Consiste em mergulhar a lâmina contendo o corte no(s) corante(s), de acordo com o que se deseja corar;
Na montagem, uma gota de resina é colocada sobre a lamínula e esta é pressionada sobre a lâmina, protegendo o corte histológico.
Coloração e Montagem
Corantes
Microscopia
Observação de células e tecidos ao microscópio 
A lâmina deve ser colocada na platina do microscópio, com a lamínula voltada para a objetiva. 
O foco deve ser ajustado para cada lente objetiva, utilizando-se os parafusos macro ou micrométrico. 
 Planos de observação das células
(Dependentes do corte)
(Cedido pela Profa. Gleydes G. Parreira)
Microscopia Eletrônica
 Microscópio Eletrônico de Transmissão
 Microscópio Eletrônico de Varredura
MET
Desenho esquemático do interior do tubo eletrônico
Preparação de material para observação ao ME
 Glutaraldeído e
 Tetróxido de ósmio
Fixação
Inclusão
A inclusão de material biológico para observação ao ME é feita em resinas como epon, araldite.
Ultra-microtomia
O micrótomo deve ser regulado para obtenção de cortes semi-finos e finos.
 Cortes semi-finos
 Telinhas contendo os cortes finos
Coloração/Contrastação
 Imagem observada
 Micrografia eletrônica de núcleo celular