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MEIOS DE CULTURA
Meio de cultura é um conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o crescimento bacteriano em condições de laboratório.
Além da composição química, deverão ser considerados aspectos físicos relativos a temperatura, aeração e tempo, que constituem as principais variáveis que interferem diretamente no crescimento bacteriano.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DOS MEIOS DE CULTURA
 Fonte de Carbono e Nitrogênio: A partir dessa fonte a bactéria pode sintetizar compostos orgânicos.
 Fonte de Energia: Geralmente é uma substância que, após oxidação ou fermentação, fornece a energia que é utilizada para atividades biossintéticas, sendo armazenada em forma de ATP.
 Sais Minerais: São requeridos em quantidades mínimas e, normalmente, existem na própria água utilizada no preparo do meio.
 Fatores de Crescimento: São substâncias complexas, indispensáveis, que alguns microrganismos não conseguem sintetizar e, devem ser adicionados ao meio básico.
Condições físicas: pH, osmolaridade, umidade, aeração e temperatura.
Esterilização: É essencial que o meio de cultura esteja estéril antes de sua utilização. O método de esterilização utilizado, deve ser selecionado de modo que os nutrientes do meio não sejam destruídos ou alterados.
Diante disso, é importante e necessário reforçar que para um bom desempenho no setor de microbiologia, os meios de cultura são ferramentas essenciais e, deverão ser sempre observados os seguintes tópicos:
Teste de esterilidade: Esse teste deve ser feito com todos os meios distribuídos em placas após esterilização. O procedimento empregado é a incubação, por 24 horas, de pelo menos uma parte representativa de cada partida de meio. A presença de crescimento bacteriano indica contaminação ocorrida em alguma etapa durante os processos de: preparação, esterilização, distribuição ou estocagem.
Aspecto do meio: Quando cada partida é preparada, deve ser feito um exame visual da transparência e cor do meio. A menos que contenha componentes insolúveis, a presença de turbidez ou precipitado torna o meio insatisfatório para uso para uso. Se a cor difere de uma partida prévia, o pH deve ser verificado à temperatura ambiente, podendo variar apenas dentro de uma faixa de aproximadamente 0,2 unidades, comparada àquela especificada pelo fabricante. A correção, se necessária, é feita com adição de álcalis (NaOH) ou ácido (HCL) em soluções diluídas.
Teste de Funcionamento: O controle de crescimento e propriedades diferenciais e seletivas deve ser feito para cada nova partida do meio, ou sempre que houver suspeita de alteração. Para isso, utilizam-se culturas padronizadas de características conhecidas.
MEIOS DE CULTURA DE ROTINA
FINALIDADE E FUNCIONAMENTO
A maioria das amostras clínicas enviadas ao Laboratório de Microbiologia podem conter uma grande diversidade de espécies de bactérias, por isso devem ser utilizados meios que possibilitem o crescimento para análise daqueles organismos de importância etiológica nos diversos processos infecciosos. Para proceder a uma seleção racional, o microbiologista deve conhecer a composição química dos meios de cultura, assim como sua finalidade e a concentração relativa de cada composto ou reativo incluído.
Os meios de cultura utilizados em rotina podem ser adquiridos prontos na forma desidratada, e seu preparo em laboratório é uma tarefa relativamente simples. Outra alternativa cada vez mais aceita, é a aquisição de meios de cultura em placas de Petri de plástico descartáveis e prontas para uso, permitindo eliminar várias etapas do trabalho em laboratório de microbiologia. Entre as vantagens podemos enumerar:
Padronização de algumas etapas de trabalho.
Diminuição do volume de trabalho e o tempo gasto nos procedimentos de lavagem e esterilização de vidraria.
Eliminação dos estoques dos meios desidratados e outros.
Alguns compostos ou substâncias fazem parte da composição química dos meios, sendo, portanto, importantes para formulação dos mesmos. 
Hidrolisados de Proteínas: peptonas, infusão de carne, triptona, caseína, etc.
Hidratos de Carbono: dissacarídeos, hexoses, etc. A substância mais comumente adicionada aos meios de cultura como fonte de energia para aumentar a taxa de crescimento é a glicose.
Substâncias Tampão: fosfatos monossódicos, dissódicos e potássicos balanceados. É importante que o pH do meio esteja próximo ao ponto necessário ao crescimento dos microrganismos.	
Substâncias Enriquecedoras: sangue, soro, suplementos vitamínicos, extrato de carne, extrato de leveduras, etc.
Substâncias Inibidoras: corantes, substâncias químicas, antibióticos, etc. Agentes químicos tornam o meio seletivo para determinadas bactérias. Os agentes seletivos devem ser adicionados em concentrações específicas para suprimir ou inibir o crescimento de organismos indesejáveis a partir de uma amostra polimicrobiana.
Indicadores de pH: vermelho de fenol, vermelho neutro, púrpura de bromocresol, fucsina, azul de bromotimol, etc. A adição de substâncias coradas com propriedades indicadoras, é importante para detectar a degradação de substratos incorporados ao meio. Tais substâncias devem mudar rapidamente a cor a partir de um valor crítico de pH. 
Outros componentes: agar-agar como agente solidificante, tiossulfato como fonte de enxofre, etc.
Na grande maioria dos meios, o agar tem função de conferir ao meio a solidificação, possibilitando a obtenção de colônias isoladas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
QUANTO A UTILIZAÇÃO
Podem ser classificados em:
Meio de Enriquecimento:
São meios, geralmente, líquidos de composição química rica em nutrientes, com finalidade de permitir que as bactérias contidas em uma amostra clínica aumentem de número, possibilitando um melhor isolamento. São exemplos desse tipo de meio: Caldo Brain Heart Infusion (BHI), Caldo Tetrationato (além de enriquecimento, é também um meio seletivo).
Meio de Transporte:
 Consiste em um meio isento de nutrientes, contendo um agente redutor (Tioglicolato ou Cisteína) e uma substância com poder de tamponamento (Fosfatos). Estes meios, geralmente, mantém um pH favorável, previne a desidratação de secreções durante o transporte e evita a oxidação ou a autodestruição enzimática dos patógenos presentes. São exemplos: Meio de Stuart, Meio de Cary Blair e Caldo Tioglicolato.
 
Meio Seletivo:
A finalidade desse tipo de meio é selecionar as espécies que se deseja isolar e, impedir o desenvolvimento de outros germes. Isso é conseguido pela adição de substancias inibidoras como corantes, antibióticos ou outros inibidores. São exemplos: Agar Manitol Salgado, Agar SS. 
 Meio Diferencial:
Possibilita a distinção entre vários gêneros e espécies de microrganismos por possuir, em sua composição, substâncias que permitem uma diferenciação visual presuntiva, evidenciada por mudança de coloração ou na morfologia das colônias. A maioria dos meios diferenciais é também seletiva, possuindo assim, vários tipos de agentes inibidores de crescimento. São exemplos: Agar MacConkey, Agar Manitol Salgado, Agar Eosin Metilene Blue
Meio Indicador:
 É utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das bactérias, auxiliando assim, sua identificação. O tipo mais simples de meio indicador é aquele usado no estudo de reações de fermentação ou utilização de certos compostos. São incorporados ao meio um carboidrato e uma substância indicadora. A partir da mudança de coloração, detecta-se a positividade da reação pela produção de compostos finais de pH definido. São exemplos: Agar Triple Sugar Iron (TSI), Agar Citrato de Simmons.
QUANTO AO ESTADO FÍSICO
Os meios podem ser considerados:
Líquidos ou Caldos: Permitem o crescimento indiscriminado de todas as bactérias existentes na amostra, produzindo turvação característica. 
Sólidos: Adquirem esse aspecto pela incorporação de agar (1,0 a 1,5%) e possibilitam o crescimento de colônias isoladas, com obtenção de crescimento puro de amostras bacterianas
Semi-sólido:É obtido pela adição de menor quantidade de agar (0,5%), sendo usado principalmente, para determinar a mobilidade bacteriana.
SELEÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
A escolha dos meios de cultura, para processamento inicial das amostras clínicas provenientes de uma determinada área do organismo, é muito importante e está primariamente condicionada à flora presuntivamente patogênico para esse local. 
Em geral é usado mais de um tipo de meio no sentido de fornecer condições de crescimento a todos os patógenos possíveis de estarem presentes, sendo esse fato determinado, via de regra, pela origem das amostras e pelo tipo de agente infeccioso, suspeito de estar causando a infecção e que deve, portanto, ser pesquisado. 
Para cada caso em particular, existem os meios utilizados rotineiramente na semeadura primária, que podem ser substituídos em algumas ocasiões, de acordo com o esquema adotado por cada profissional ou serviço de microbiologia. Como por ex: utilização do agar macConkey em lugar do Agar EMB.
PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
O procedimento mais utilizado, atualmente, é a aquisição de meios pré-fabricados e fornecidos de forma desidratada. Nesse caso, o preparo consiste apenas na pesagem criteriosa da quantidade necessária ao volume desejado, seguido de dissolução e esterilização, conforme orientação do fabricante, impressa na embalagem.
A autoclavação é o método mais eficaz de esterilização dos meios de cultura, utilizando-se a temperatura de 121º e uma atmosfera de pressão durante 15 a 20 minutos.
CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO
A principal condição de incubação é a temperatura em que o microrganismo se desenvolve. A maioria dos patógenos requer uma temperatura ótima para crescimento entre 35 a 37ºC.
Além desse requisito, é importante que a atmosfera da estufa contenha alguma umidade. Outro aspecto importante, são as condições de aeração, que pode ser feita através de jarras especiais, em que através de reações químicas, são geradas as condições de anaerobiose necessárias ao desenvolvimento de determinados microrganismos. Ex: ” Jarras Gaspak”.
Existem bactérias que não exigem anaerobiose total e são estimuladas, utilizando-se o método da vela
 (“Candle jar”).
 “Jarra gaspak”
MEIOS DE CULTURA DE ROTINA
Agar- sangue
Finalidade: 
É um meio altamente nutritivo utilizado para a maioria dos germes causadores de infecção, principalmente para isolamento e identificação de patógenos exigentes e para determinação da atividade hemolítica de algumas bactérias, particularmente, estreptococos.
Funcionamento:
A base nutritiva oferece ótimas condições de crescimento aos microrganismos presentes. O pH do meio em torno de 6,8 é favorável para a conservação dos eritrócitos e para formação de halos claros de hemólise. A verificação da capacidade hemolítica é importante na escolha dos testes complementares e diferenciais do gênero Streptococcus.
Agar MacConkey
Finalidade: É um meio diferencial para o isolamento de enterobactérias e outros bacilos gram negativos entéricos, a partir de fezes, urinas alimentos e amostras ambientais.
Funcionamento: Os típicos fermentadores de lactose formam colônias róseo-avermelhadas, rodeadas de uma zona turva, produzida pela precipitação de sais biliares. Os fermentadores fracos da lactose podem formar colônias ligeiramente rosadas e as amostras não fermentadoras de lactose são incolores ou transparentes. Os sais biliares e o cristal violeta inibem o desenvolvimento de bactérias Gram positivas. A lactose é o único carboidrato presente no meio. O vermelho neutro funciona como indicador, produzindo uma viragem em pH abaixo de 6,8. Desse modo, as colônias têm diversas tonalidades de vermelho, de acordo com a quantidade de ácidos produzida.
AGAR CLED (BROLACIN)
Finalidade: É um meio de cultura não seletivo, idealizado para utilização em uroculturas. Esse meio permite também a diferenciação de colônias lactose negativa, bem como a identificação presuntiva de alguns microrganismos.
Funcionamento: Pela ação dos microrganismos, a lactose existente no meio é degradada com produção de ácido, provocando uma viragem do indicador azul de bromotimol para amarelo. As bactérias não fermentadoras da lactose desenvolvem colônias de coloração azul. Sendo o meio deficiente em eletrólitos, não possibilita a formação do véu característico de amostras de Proteus, produzindo colônias isoladas. 
AGAR MANITOL SALGADO
Finalidade: É um meio seletivo para o isolamento e identificação de estafilococos patogênicos, a partir de amostras clínicas, alimentos e outros materiais.
Funcionamento: A elevada concentração de sal (NaCl ) 7,5% suprime o crescimento de outras bactérias deixando crescer apenas o gênero Staphylococcus. A degradação do manitol com formação de ácido será correlacionada com a patogenicidade do gênero em questão e serve como indicador presuntivo da presença de” Staphylococcus aureus”. O vermelho de fenol funciona como indicador de pH. Uma viragem do vermelho original do meio para amarelo indica degradação do manitol com formação de ácido
PLACAS COM AGAR MANITOL SALGADO
AGAR CHOCOLATE
Finalidade: É um meio enriquecido e não seletivo para o 
cultivo de bactérias delicadas e exigentes. Uma variante do ágar sangue
Funcionamento: Contém glóbulos vermelhos lisados (rompidos) para liberar hemina, NAD e hematina que dão a coloração marrom característica. É feito com uma base e sangue de cavalo, carneiro ou coelho aquecidas suavemente até 56 ° C. Permite o cultivo de Haemophylus, Neisseria, Branhamella e Moraxella
AGAR CHOCOLATE MODIFICADO
TAYER MARTIN MODIFICADO (TTM)
Finalidade: Ágar Chocolate Modificado é um meio de cultura, destinado ao isolamento e cultivo de diversos microrganismos, dentre eles os fastidiosos como Neisseria spp. e Haemophilus spp., microrganismos de difícil crescimento em meios simples.
Funcionamento: É um meio rico e superior a outros
 meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neissérias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados.
Agar Thayer Martin Modificado
CALDO BHI (BRAIN HEART INFUSION)
Finalidade: É um meio nutriente, recomendado para a maioria das amostras clínicas.
Funcionamento: É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose. O caldo BHI é um meio líquido nutriente. A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextrose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação.
AGAR MULLER HINTON
Finalidade: É um meio utilizado padronizado para testes de sensibilidade aos antimicrobianos, e recomendado na execução do método de difusão pela técnica Kirby-Bauer.
Funcionamento: A base nutritiva desse meio oferece boas condições de desenvolvimento, para praticamente todos os tipos de bactérias, sendo por isso recomendado para a realização do antibiograma. Por outro lado, o meio é totalmente desprovido de ácido para- amino- benzoico e seus análogos, que são antagonistas das sulfonamidas e outras drogas antimicrobianas.
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
Pesar o pó, seguindo o protocolo indicado, e adicionar separadamente à água destilada, tomando-se o cuidado de homogeneizar a cada componente adicionado. Os meios de cultura mais utilizados em laboratórios de microbiologia estão disponíveis comercialmente, já na forma desidratada. Nestes casos, pesar a quantidade de mistura especificada na embalagem do produto e acrescentar à água destilada.
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇAO BIOQUÍMICA
O diagnóstico laboratorial de bactérias gram negativos(enterobacterias) , gram positivos e bactérias não fermentadoras de glicose, se baseia principalmente na identificação através de provas bioquímicas. Para a realização de uma completa diferenciação bioquímica das espécies pertencentes à familia Enterobacteriaceae seriam necessárias dezenas de provas. No entanto, ressalta-seque normalmente utilizam-se procedimentos direcionados, principalmente para os patógenos mais importantes do trato gastrintestinal, e não é necessária a utilização de inúmeras provas para todas as culturas em estudo.
 Para os trabalhos de rotina em laboratórios clínicos, utiliza-se apenas uma série simplificada, com sistemas ou meios que podem variar de acordo com a estrutura de cada serviço em microbiologia ou
mesmo com a experiência dos profissionais responsáveis por esse setor. Existe disponível no mercado, uma quantidade considerável de meios de cultura, conjuntos de provas bioquímicas e sistemas de identificação como opção de escolha, incluindo sistemas automatizados de identificação rápida das bactérias.
Com finalidade de identificar as amostras após leitura das provas bioquímicas, utilizam-se tabelas apropriadas, constando do perfil de respostas bioquímicas dos principais gêneros, obtendo-se a identificação até o nível de espécie.
A confirmação da presença de patógenos, no trato gastrintestinal, deverá ser feita através de provas sorológicas específicas.
SISTEMA DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA
EPM/ MIO/ CITRATO
Existem várias outras opções de meios de identificação bioquímica de enterobactérias, que evoluiram desde métodos simples de bacteriologia clássica de leitura visual, até sistemas sofisticados para leitura através de aparelhos de automação , nos quais, independente do grau de avanco técnico, o aspecto comum é a presença de reações bioquímicas que conduzem à formação de compostos finais de pH definido acoplados a um sistema indicador eficiente
 O sistema utilizado pelo fabricante, e denominado “KIT PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS” é composto de 5 tubos.
Esse conjunto oferece para os usuários, um sistema numérico para facilitar a identificação de enterobactérias. As onze reações bioquímicas do “minikit para enterobactérias” foram agrupadas em quatro conjuntos de provas. O resultado de cada um desses conjuntos produz um número de quatro dígitos, que identifica uma espécie bacteriana. 
Quando a reação da cepa investigada é positiva (+) colocar o número correspondente. Ex: INDOL (+) = 6. Se a reação for negativa (-) colocar o valor 0. 
 No exemplo acima, obteve-se o valor 9 9 9 3 que corresponde à bactéria Escherichia coli. Para a identificação das amostras após a leitura das provas bioquímicas, é utilizada uma tabela apropriada, constando do perfil de respostas bioquímicas dos principais gêneros.
Quando no número encontrado existir mais de uma espécie bacteriana ou, quando o resultado obtido corresponder a um número não existente na tabela, deverão ser realizadas provas bioquímicas complementares
MEIO EPM (ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA): É o meio de Rugai modificado. Permite a leitura:
LTD (desaminação do L- Triptofano) evidenciado pela cor verde garrafa no ápice do tubo.
Glicose: pela coloração amarela na base do tubo.
Produção de gás a partir da glicose: Evidenciado pelo arrebentamento do meio ou pela presença de bolhas.
Produção de gás sulfídrico: Pela presença da cor negra.
Em resumo: LTD, GLICOSE, GÁS, H2S.
Meio de Lisina Descarboxilase: Permite a leitura da descarboxilação da lisina. A cor amarela relata reação negativa e, qualquer cor diferente de amarelo é considerada positivo. Selar com óleo mineral estéril. 
 Meio MIO: Fornece a leitura de Motilidade, Descarboxilação da Ornitina e Indol.
Motilidade: observada pela turvação do meio. Crescimento somente na picada, prova negativa.
Ornitina: Cor amarela, prova negativa. E, cor diferente, prova positiva.
Indol: Para leitura do indol, adiciona-se REATIVO DE KOVACS. A formação de um halo vermelho indica reação positiva.
Meio de Citrato de Simmons: Responsável pela leitura de citrato. Demonstra a utilização do substrato como fonte de energia, sendo considerado reação positiva quando a cor final do meio é azul.
Meio de Rhamnose: Permite a verificação da fermentação ou não desse açúcar. O meio apresenta cor verde e, se a coloração final for amarela significa prova positiva, ou seja, fermentação de Rhamnose. Selar com óleo mineral estéril.
ALGUNS MEIOS DE CULTURA PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS
Para identificação e diferenciação do gênero Staphylococcus:
Agar Manitol Salgado
Finalidade:
 É um meio seletivo para o isolamento e identificação presuntiva de estafilococos patogênicos, a partir de amostras clínicas, alimentos e outros materiais.
Funcionamento:
 A elevada concentração de (NaCl 7,5%) suprime o crescimento de outras bactérias, deixando crescer apenas o gênero Staphylococcus. A degradação do manitol com formação de ácido está correlacionada com a patogenicidade do gênero em questão e serve como indicador presuntivo da presença de Staphylococcus aureus. O vermelho de fenol funciona como indicador de pH. Uma viragem do vermelho original do meio para amarelo indica degradação do manitol com formação de ácido.
Agar Dnase
Finalidade: É um meio utilizado principalmente na caracterização de estafilococos coagulase positivos.
Funcionamento: As colônias formadoras de Dnase hidrolisam em seu redor, o ácido desoxirribonucleico (DNA) contido no meio de cultura. Após a incubação, adiciona-se uma solução de ácido clorídrico (HCL) 1 N, o que provoca uma precipitação do DNA contido no meio, aparecendo zonas mais claras em volta das colônias. É recomendado também, a adição de uma solução de azul de ortotoluidina ao meio, aparecendo zonas de coloração rósea em torno das colônias produtoras de Dnase.
Para identificação de Enterococos:
Agar Bile Esculina
Finalidade: É um meio utilizado para verificar a hidrólise da esculina e tolerância à bile, que são consideradas características constantes dos estreptococos do grupo D.
Funcionamento: Os estreptococos do grupo D podem multiplicar-se livremente nesse meio, por não serem inibidos por sais biliares. Desse modo, produzem a hidrólise do glicosídeo esculina, convertendo-se em glicose e esculeteína.
 A esculeteína reage com os íons férricos contidos no meio, produzindo um complexo de coloração escura característica, que evidencia a positividade da prova.
 Agar Bile Esculina
Meio de Tolerância ao Sal (MTS)
Finalidade: É um meio para diferenciação definitiva dos enterococos (Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium) daqueles identificados como não enterococos
 Funcionamento: O meio utilizado nessa prova contém glicose e uma substância indicadora, de modo que o crescimento com Fermentação da glicose, produz turvação e acidificação do meio com mudança do sistema indicador.
Um dos meios recomendados para utilização é “Hearth Infusion” com 6,5% de cloreto de sódio e como indicador, é recomendado a púrpura de bromocresol. O crescimento com consequente turvação e mudança de coloração do meio, adquirindo uma coloração amarela (conforme o indicador utilizado) indica positividade classificando a amostra como enterococo, desde que a prova da bile esculina seja também positiva.