AULA 6 - Imunofenotipagem OK!

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Aula 6- imunofenotipagem
Citometria de fluxo nada mais é do que um canal onde eu passo uma célula por dentro dele e eu vou analisar essa célula. No entanto o que vamos estudar aqui é um negoço chamado imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo é uma ferramenta e a imunofenotipagem é um exame que eu posso fazer por citometria. Só pra vocês terem uma idéia um hemograma se faz por citometria de fluxo, sendo que no hemograma, os aparelhos atuais que se faz hemograma, eles apenas estudam o tamanho da célula e a complexidade da célula e ai me diz se é neutrofilo, se é linfócito, se é granulócito e assim vai... Na citometria de fluxo o que eu tenho capacidade de fazer? Eu posso contar células, eu posso dizer se meu paciente tem 12.000 leucócitos. Segundo, eu vou analisar em que parâmetros? No hemograma eu só consigo fazer parâmetros físicos (tamanho e granulosidade), num aparelho que faz imunofenotipagem eu consigo fazer isso aqui aponta no slide (fluorescência). Então eu estudo a célula pelo tamanho, pela granulosidade e pela fluorescência. E o que é a fluorescência? É justamente... eu vou marcar essa célula com anticorpos monoclonais específicos para cada CD, para cada proteína que existe numa célula e eu vou descobrir se essa célula é mieloide ou linfoide, jovem ou adulta e ai eu posso chegar num diagnóstico, outra coisa importante é eu poder individualizar a célula. Pq quando um paciente está com leucemia ele pode está com um pleno diagnóstico... você tá la no plantão o paciente chega com um cansaço, tem anemia, defesa baixa e ai você pede um hemograma do cidadão e aparece lá no hemograma: paciente apresentando 50% de células mononucleares atípicas com característica de células blásticas, isso ai vocês tem que correr pra que o paciente vá logo pra uma unidade especifica fazer o tratamento. Então se ele tem 50% de células mononucleares (que na minha cabeça eu penso é blasto, é célula jovem)então eu poso dizer que esse paciente tá com uma leucemia. Os outros 50% no sangue periférico ainda é granulócito, monócito... de células ainda maduras, então eu posso, eu consigo individualizar essa população (de células) e saber que blasto é esse. Pq se eu for analisar os linfócitos eu vou dizer que é linfócito, se eu for analisar granulócitos vou dizer que é granulócito... então,citometria me da essa capacidade de todo o conjunto de células que eu tenho lá circulando seja em medula ou sangue periférico, eu vou individualizar o que eu acho que é a célula maligna, eu digo (erroneamente) que vou estudar o clone maligno. A citometria permite dizer quanto de célula eu tenho e que tipo de célula é, é isso o resumo da aula, é isso que nós vamos estudar. Isso aqui nada mais é do que uma solução que o citômetro passa para poder analisar a célula (mostrando slide). A história do laser... o laser vai e bate na célula, então por esse laser eu consigo identificar o tamanho, a granulosidadade e fluorescência.
	A citometria é um analise multiparametrica das células, pq eu consigo com o laser diagnosticar isso aqui (mostra algo no quadro)... quando a célula é puxada pelo citômetro ela vai passar neste... ela vai passar em um determinado local onde todas as células vão passando e ai o laser vem e bate nessa célula e ai vamos imaginar que aqui eu tenho o que eu chamo lá de interposto, quando não tem célula todo o laser que vem é emitido aqui, todo ele vai chegar neste local, deste detector, então quando eu tenho 100% de laser no meu detector eu não tenho célula, quando passou a primeira célula esse espaço todinho aqui não chegou lá, formou uma sombra, neste espaço daqui pra cá não chega laser, então o que é que isso aqui me dá? O tamanho da célula.Existe outra coisa, eu tenho detectores aqui e tenho detectores aqui, chegou o laser bateu no centro da célula, a célula tem grânulos, a célula temnúcleo mais complexo. Bate na célula e vem pra cá, então isso daqui é detectado. Aqui eu analisar não só a granulosidade mais a complexidade da célula.
	Pronto, com isso aqui é o primeiro dado que a fluxocitometria me dá, e ai ela consegue separar uma celulazinha menorzinha, um nucleozinho bem feitinho que não tem grânulos, que célula é essa? É um linfócito! Uma célula maior, mais complexa com grânulos é um granulócito. Ele me diz exatamente como cada célula está e ai eu vou analisar, depois que ele me diz isso é que eu vou dizer: Ah! È uma célula grande, uma célula pequena... Porque você pode me solicitardizendo: Não, eu quero uma imunofenotipagem para linfócitos. Você ta querendo saber se eu tenho uma quantidade correta de células b, células t e dentro das células t eu quero saber quais são os linfócitos t que eu tenho lá. Quais são os linfócitos t que nós temos? CD8 e CD4. Então o que é que todo mundo tem que saber aqui? Em relação a CD4 e CD8 certo? 
	Então vocês podem pedir uma subpopulação de linfócitos e ai eu vou estudar CD3, CD19, CD4 e CD8 e o mais complexozinho eu vou ver C656. Então eu vou saber quanto de célula b eu tenho, quanto de células t eu tenho no geral e dentro das células t eu vou ver quantas são CD4 e quantas são CD8. Quem é que tem mais circulando em um paciente normal? Celulas b e t,entre elas as t e dentro da t? (resposta de uma aluna, não da para entender)E ainda tenho outra célula, a célula LK. Então estude sobre população linfocitária, é assim que você solicita e eu dou uma geral nos linfócitos. Um dos parâmetros para avaliar a imunidade do paciente não é assim? 
	Como é que vocês avaliam isso ai, vocês não, eu ou qualquer outro laboratório. Na membrana ou internamente (parede de núcleo, citoplasma...) eu tenho marcadores, um dos marcadores que é específico para célula, por exemplo o CD2 e o CD3 são específicos para células deles e CD4 do linfócito é o que? (pequena parte inaudível, varias pessoas falando ao mesmo tempo).
Professor passa alguns slides que julga não serem necessários!
Explicando um slide: Passou a célula, se lembram que eu disse? Ele diz de isso aqui é complexo, me diz que isso aqui é sujeira, os linfócitos estão aqui, os monócitos estão aqui... Então isso não é hemograma, existem laboratórios que mandam o histograma para você. Quando vocês olharem o histograma, cada um manda de um determinado jeito, vocês já pagaram estatística? Nãoo! Pronto, vocês vão pagar e na aula de estatística o que é um histograma certo? Isso eu chamo de histograma ta? 
Ai mostrou, a primeira análise ta aqui assim, o comportamento dessa suspensão desse sangue desse paciente que você passou dessa medula, é assim. Ai eu operador, você doutora, eu quero estudar seu linfócito ai eu venho aqui e faço um quadrado ou um retângulo ou um losango, enfim. Quando a célula passar La no fluxo de células, naquele momento ela analisou o tamanho e também analisou os anticorpos monoclonais presentes. Ai eu digo: Ei desta população eu quero saber quanto eu tenho de CD4, quanto eu tenho de CD8, quanto eu tenho de CD19 e ele me da o percentual. Antes eu tive que passar em um aparelho de (palavra inaudível) para saber quanto eu tinha de linfócitos, ele me dando o percentual disso ai eu digo a vocês. Entenderam? Eu tenho tantos CD4, tantos CD8... Abaixo de 200 né? Se eu tiver abaixo de 200 CD4 minha imunidade ta bem comprometida. 
	A grosso modo, olhado aqui, no primeiro quadrante lá o que é que vocês conseguem ver? Isso daqui é todo sujo? Isso aqui ó é o que? Celulazinha pequena, sem grânulos isso aqui é linfócito. Isso aqui não é linfócito não, isso aqui é a posição que o linfócito tem que ta, certo? Aqui é a posição onde o monócito tem que ta e aqui é a posição onde o granulócito tem que está. 
Eu olhando isso daqui, eu já digo se esse paciente ou é uma criança, porque está aparecendo aí muito nitidamente que eu tenho muito mais linfócitos do que granulócitos. Se for um adulto, esse paciente tem alguma doença, ou uma linfocitose, ou alguma coisa reativa reativa, ou ele tem uma doença. Neste cara aqui, eu ia lá, ia ver, ia verificar isso daqui. Vamos para o próximo!
Olha a diferença do gráfico anterior para esse.Eu estou dizendo gráfico porque (faixa sem clareza para transcrição). Então vocês viram que está diferente esse gráfico aqui do outro. E o que ele quis dizer? Conseguiram identificar ou não? Tinha isso daqui lá no outro? Então esse paciente tem mais granulócitos do que o paciente anterior. Então esse daí, olha, ele está me pedindo para estudar o que? O que é isso pessoal? Vocês não estão falando não e eu estou aqui e quero ouvir vocês falarem. Sem falar eu não consigo raciocinar. O que diabo é CD3, pessoal? 
Resposta de aluno: É um linfócito.
Professor: Que tipo de linfócito? Então diga, linfócito T.
Eu peguei, separei para estudar o linfócito. Esse exame aqui é estudar o linfócito. Eu quero saber aqui quanto de linfócito eu tenho. Quanto de linfócito eu tenho, célula T CD4. Eu cheguei lá e coloquei, no meio do (palavra sem clareza para transcrição). Eu coloquei o anticorpo monoclonal, eu coloquei o CD3, coloquei o anti-CD3, coloquei o anti-CD4, coloquei o anti-CD8, coloquei tudo, coloquei tudinho. Faço uma reação química, e se tiver presente, se existir, ele vai se acoplar, porque aqui eu tenho o CD3, não é? O anti vai se acoplar aqui. Se acoplando aqui, se acoplando, ficando ligado, quando eu passar a citometria, ele vai me dizer se tem ou se não tem, depende da fluorescência. Pronto, então ele chegou para mim e, diante desses linfócitos todos, ele me mostrou esse gráfico. Isso daqui é aquele gráfico, pessoal. Isso daqui é o zero, tudo que eu tiver pro lado de cá é positivo e tudo que eu tiver pro lado de cá é negativo; tudo que eu tiver acima desse zero é positivo e tudo que eu tiver abaixo desse zero é negativo. Então de todos aqueles meus linfócitos que eu tenho, uma pequena porção aqui de CD3 positivo e CD4 negativo, tenho outra porção aqui que é o CD3 e CD4 positivo.
Aluno vai ao quadro para explicar o gráfico...
(Parte inaudível que o professor comenta com o aluno sobre o que ele vai explicar)
Parte explicativa no quadro: O que tiver pra cá é positivo (CD3) e o que tiver do lado de cá vai ser negativo para CD3. Pra cá positivo para CD4 e negativo para CD4. Essa célula aqui vai ser postiva para CD3 e negativa pra CD4, então ela vai ser TCD8. 
Professor: Perfeito, isso é um raciocínio que podíamos pensar se eu tivesse estudando e eu não tivesse no meu laboratório CD8, eu podia chegar nesse raciocínio, mas eu imagino que a célula que é CD3 mas não é CD4, eu tenho ainda duas opções NK e CD8, mas a percentagem de NK é sempre muito baixa
Perfeito! Valeu querida! Hahahahahaha... Vamos lá! Vamos pro próximo slide, que aí você já fica... 
Themis: Bárbara, deixa só eu fazer um parêntese! Gente os CDs é como se fosse a identidade da célula. Então desde a célula mais imatura, que é a stemcell que tá lá na medula ela é um CD, o CD34. A célula vai ganhando e perdendo essas identidades. O linfócito (o linfócito T) é CD3, ele é CD3-CD4, CD3-CD8. O linfócito tem essa identidade de ser CD3 e CD4, CD3 e CD8, por exemplo. Então aí a gente sabe que tem um CD3, só que você tá me pedindo como médica a contagem de CD4 ou de CD8, né isso?! então tem que separar dentro dos CD3 quem é só CD4 ou só CD8. É isso que o gráfico "mostra".
Eu quero saber se todo mundo entendeu a história desse gráfico?! Porque é simples, mas... Ah! Vamos lá! Termine aí!
Aluno explicando: Aqui você vai ser CD3 positivo e CD4 positivo.
Aí com isso eu provo que isso é o seu percentual de CD4 e o nome é? Helper. Agora eu quero que você me mostre só o CD4 puro. Aí! Ninguém tá vendo, mas tem uns pontinhos. Essas são células que só são CD4+ e CD3-. Não são linfócitos. Sabe que células é essa? Isso é monócito (mas num diga que disse não!!!). Agora todas as minhas análises vão ser assim, eu vou jogar um anticorpo pra um lado e outro pro outro e vou brincar de mais/menos ( +/-). Ou eu posso tirar um anticorpo daqui e jogar tamanho ou granulosidade, e assim por diante. Já eu vou lhe ensinar. 
Aluno:É que nesse primeiro aí, nesse e no anterior, você disse que tinha mais granulócito, né?! Mas você num tá sabendo por aí não, né?! Porque aí num dá pra ver não. Tem uma célula aí. 
Professor: Tem uma célula?
Aluno: Ahhh é cada pontinho desse?
Prof.: Cada pontinho é uma célula.
Aluno: Ahh, não é área que ele ocupa?!
Prof.: Não!!! Cada pontinho é uma célula. Eu sugo, eu conto 10.000 células. Isso para uma análise de perfil imunológico, mas pra leucemia eu já passo pra 15.000 células. Quando eu tô fazendo contagem de stemcell pra transplante de medula óssea eu trabalho com 500.000 células. É muito pontinho!! E eu vou já falar as contas pra vocês.
Aluno: Esse que é negativo tanto pra Cd4 quanto pra CD3 é o que? Sujeira? 
Prof.: Perfeito! Sujeira. Sujeira dos linfócitos, tá?! Mas o "debris" que a gente chama, que é sujeira, sujeira mesmo, resto de núcleo, resto de células, ela fica aqui, óh!! Isso aqui é chamado "debris"! Isso aquinão é sujeira não! Alguém sabe o que é isso? É a célula que eu circulei que não é CD4, nem CD3, nem CD8. Qual é essa célula então? Pode ser o CD19. Não marcou pra 4 nem pra 3, mas pode marcar pra 19. No próximo gráfico que eu disser: me diga a percentagem pra CD19. Aí esse bichinho aqui que era negativo pra CD3 passa pra cá. 
Isso aí não é a forma esquemática, é a forma que o citômetro dá pra gente, tá?! Aqui vocês veem o "debris" que a gente chama de sujeira, linfócito, monócito e granulócito. Só analisando aqui dá pra notar que eu tenho mais linfócito que granulócito? Conseguiu ver?! Pronto! Linfócito, monócito e granulócito. É assim que se comporta uma criança, vamos dizer de uma ano, normal. Mas isso aqui também pode ser um paciente com LMC, viu?! Mais linfócito que granulócito. Pode ser uma linfocitose reacional, por isso que tenho que fazer os outros marcadores. 
Olha aí a diferença, esse paciente já não é separado por células. Então isso aqui quando eu olho, eu já tenho noção de que eu tenho um clone maligno aqui. Dá pra imaginar? Agora, isso me ajudou porque antes de fazer o estudo na citometria, eu primeiro olhei a lâmina. A gente fez o mielograma ou olhou a lâmina do sangue periférico e já identificou ali qual era o tipo de célula que eu achava que era maligna. Se tava com muito blasto, com muito monócito. Aí eu posso tá diante de uma leucemia mielomocítica ou de uma monoclueose. Uma monoclueose se comporta desse jeito, sendo que quando você vai colocar os marcadores isso não é um monócito, é um linfócito e que não tem marcadores de malignidade. Tá vendo com é diferente?! Todo processo da citometria, da imunofenotipagem, comeca nesse primeiro gráfico. 
Themis falou, mas vou falar de novo. A primeira célula que é formada na medula óssea, da linhagem hematológica, é a stemcell. Essa célula vai dar origem a todas as outras células. Dependendo do comprometimento dela, do microambiente, dependendo das citocinas que vão induzir ela a ser linfócito, a ser granulócito, a ser monócito, a ser plaqueta, a ser hemácia e assim por diante.
	Ela nasce com... do mesmo modo que a criança quando ela nasce, ela tem aquele primeiro documento “Declaração de nascidos vivos”, depois de 5 dias ela tem certidão de nascimento, depois de determinado tempo ela já tem identidade; depois CPF; daqui uns dias não usa mais certidão de nascimento, usa de casamento. Uma hora usa o CPF, outra hora CRM, não é assim? Imaginem que a célula é do mesmo jeito, ela nasce com uma determinada proteína, algumas continuam pro resto da vida, outras só irão ter com determinado tempo... Vão perdendo e vai adquirindo, por isso que a gente consegue dizer exatamente qual é o estágio e qual é o tipo de célula. 
	A célula, quanto mais imatura, ela tem um negócio que a gente chama de densidade antigênica, quanto mais CDs uma célula tiver... Uma célula ela é CD3 positiva, à medida que ela envelhece ela tem mais CD3. Esta célula aqui tem CD3, mas ela é mais jovem do que essa. Se a densidade antigênica de um determinado marcador for maior, ela é mais madura (quanto mais a direita no gráfico, maior densidade antigênica, mais madura). Então, isso vai me ajudare muito quando eu quiser descobrir qual o estágio de maturação da célula, pra eu dizer exatamente qual é a leucemia que eu estou diante.
	Se eu disser pra vocês que este anticorpo aqui é um CD3 e aqui também é CD3, eu poderia dizer, facilmente, que aqui eu estava diante de células T imaturas e aqui de células T maduras. Então meu clone maligno seria este daqui. 
	P – Inaudível
	R – Não esse aí é o controle, tudo em citrometria a gente trabalha com controle, esse aqui não tem nada. Tudo pra frente dele é positivo com controle negativo. Seria StemCell se eu marcasse CD45 ou CD34.
	Para que serve citometria de fluxo? 
Diagnosticar e acompanhar leucemia e linfomas;
Diagnosticar e acompanhar mieloma múltiplo;
Serve pra identificar se uma célula na corrente sanguínea não é hematopoiética. Às vezes existe uma invasão de células pro sangue de outro câncer. E lá eu vejo que não tem nenhum marcador hematopoiético, então isso é uma metástase ou outra coisa;
Diagnosticar hemoglobinúria paroxística noturna;
Estudo de doença residual mínima que é... Eu faço o primeiro ciclo da quimioterapia e eu quero saber se acabaram ou não acabaram as células malignas, que aí eu vou ver como vou me comportar podendo mudar o modo de tratamento; 
Identificar, hoje, se uma célula é resistente ou não a um determinado tratamento. Hoje já tem proteína na célula que o medicamento entra e ela coloca pra fora;
Avaliar os pacientes de HIV, para monitorarmos eles, para identificarmos possíveis imunodeficiências que não seja a AIDS;
Transplante de medula óssea é feita por citometria de fluxo, ou seja, a tagem de células necessárias para eu implantar, primeiro eu tenho que fazer a contagem e dizer que naquela bolsa eu tenho StemCell suficiente;
Identificar determinado parasita... etc.
P – Professor e a parte do transplante (inaudível)
R -Olha só, existem três modos de fazer transplante de medula óssea: 
Um doador dando pra outra pessoa, isso se chama transplante homólogo, no qual eu tiro a própria medula óssea, coloco numa peneira e já transplanto no paciente. Neste caso nós não contamos (as células), nesse caso o paciente está dentro do centro cirúrgico (inaudível);
O outro modo é transplantar StemCell, porque o fundo no fundo, você não quer a medula, você quer StemCell, você não quer líquido, você quer célula. Aí existem dois modos:
Transplante autólogo: você doa para você mesmo.
Transplante alogenéico: de um doador para um receptor
Se eu tiver doador dando pra receptor, se eu encontrar compatibilidade, se fizero exame de HLA e der compatibilidade, vamos fazer transplante alogenéico, se eu não tiver a saída é fazer um transplante autólogo. (Inaudível) o que é que se faz? Se trata o paciente, trata com doses de quimioterapia boa, mata temporariamente aquele câncer. Então, hoje ele está bom, hoje ele não tem doença, mas sabe-se pelo histórico dele que ele vai recair. Então, que é que se faz, no momento em que ele está em fase de “cura”, a gente dá uma substância tanto (inaudível)... O que é que se faz, você dá um remédio chamado granulokine, você dá 5 dias de granulokine direto e no quinto dia você colhe o sangue do paciente, numa máquina que também tem o poder de saber se a célula é grande ou pequena. O que é que esse granulokine vai fazer? Ele vai estimular que StemCell saia da medula óssea e vá para o sangue, que é muito melhor se fazer uma doação de sangue, do que uma doação de medula óssea.
...e você fica lá, do mesmo jeito que você doa plaquetas, você doa medula, é um aparelho exatamente igual e nesse caso vai separar só a stemcell. Quando eu termino de fazer essa coleta, eu tenho que ter uma quantidade mínima de stemcell pra eu infundir no paciente receptor, e aí eu vou contar quanto de stemcell eu tenho dentro daquela bolsa, aí eu faço *parte inaudível* quinto, sexto dia, o sétimo dia já caiu; paciente doador bom, no primeiro dia eu consigo coletar todas as células desse paciente, eu preciso de 3,5 trilhões (ou bilhões, não entendi direito) de células
Aluno: como é o nome?
Prof.: Alogeneico. Você doadora vai doar pra sua irmã, parente certo? Ou você mesmo pode doar pra você...esqueça, você tá doente, tem uma leucemia e tendo em vista os marcadores no momento do diagnóstico a gente sabe que ela vai recair ou já recaiu, e aí é interessante que você guarde medula óssea, no momento que você está livre da doença, colhe-se um pouco de stemcell, guarda e depois faz o transplante em você mesma. Quem vai decidir isso é o hematologista, certo? Mas onde é que a citometria de fluxo entra? Entra para contar a quantidade de stemcell que eu tenho que ter, no mínimo, para poder infundir em você, e depois você faz como se fosse uma doação de sangue.
Aluno: aí esse granulokine é a pessoa doando para ela mesma?
Prof.: sim, a única função do granulokine é ele estimular que a célula tronco, que a stemcell, saia de dentro da medula óssea a e vá pro sangue periférico e você colha stemcell pelo sangue periférico.
Aluno: mas aí pode ser a própria pessoa ou um doador, não é?
Prof.: sim, isso é um modelo de doação, você pode doar fazendo coleta de stemcell pelo sangue periférico. 
Aluno: no autotransplante você vai tirar stemcells do sangue periférico e depois você vai colocar essas células aonde? Porque que você vai tirar pra depois colocar de novo?
Prof.: você tirou hoje, guardou hoje, você está bem...você teve uma doença e essa doença a única saída é transplante de medula óssea, não tem outro jeito. Aí foi feito o primeiro ciclo que quimioterapia e você ficou bem, quando você ficou bem, você usa granulokine, que estimula a stemcell BOA (teoricamente nós matamos as células malignas específicas, então teoricamente você está bem), ela vai pro sangue periférico, colhe e deixa guardado, congelado.
Aluno: professor, quanto tempo pode ficar congelado?
Prof.: a bolsa, comprovado, que passou mais tempo congelado e deu certo foi uma bolsa de cordão umbilical
*Parte inaudível * 
Calma, calma, vocês não compreenderam, quando eu colocar essa stemcell no sangue periférico e elas não forem colhidas, ela volta pra medula por que o local de vida da stemcellé na medula, eu coloco no sangue e ela volta pra medula, vai repopularizar. No dia do transplante você fica com 0,5 de leucócitos; você fica numa bolha, um local onde você não pode pegar nenhuma infecção, porque você recebe uma dose cavalar de quimioterápico e vai a zero de leucócitos, você mata sua medula. Quando a stemcell chega n sangue periférico ela corre de volta pra medula...
P: Inaudível
R: Antes não depois, é quando você está bem. Você tomou o quimioterápico, teoricamente você está bem, ai vai e colhe. 
Quem for fazer hemato, vocês vão ver na lâmina e vão distinguir isso aqui só no olho. Agora tem casos que... Eu sei o que é um blasto mielóide e um linfoide. Mas a gente precisa dar mais parâmetro para o médico, para que com a farmacologia você dê um tratamento mais direto. 
Por que hoje se vive mais de leucemia? Por que o diagnóstico ta melhor e o tratamento ta melhor. No momento que eu digo que a sua leucemia é mielóide eu tenho CD13, e já inventaram medicamento que só vai pro CD13. Tendo maior sobrevida. Hoje eu consigo subtipar a leucemia. Antigamente era leucemia aguda e crônica. Depois foi leucemia aguda mieloblastica, leucemia aguda linfoblástica e leucemia crônica linfoblástica {?}. Qual é o objetivo? Especificar mais a doença, para individualizar mais o tratamento. Diminuir toxicidade. 
Isso aí é um painel de uma pequena quantidade de anticorpos que eu faço para todas as leucemias. Mesmo que eu olhe, mesmo que ele tenha clínica de uma determinada leucemia, nós temos que colocar os marcadores de várias leucemias. Por exemplo: paciente tem 14 anos, ta com hemorragia gengival ta cheio de monócitos. Isso é característico de uma leucemia monocítica. Eu não osso só colocar marcador para leucemia mielóde, eu também tenho que colocar marcador para linfoide. Eu tenho que excluir as outras leucemias. Até por que eu posso está diante de leucemias bifenotípicas e leucemiasmistas. 
Para eu provar que uma célula é leucócito esse cara tem que ter um CD45 positivo. Para eu dizer que é um monócito eu tenho que ter 14 positivo. Para eu dizer que é uma célula imatura ele tem que ter o 34 positivo. Pra dizer que é da linhagem mielóide ele tem que ter o 33 e o 13 positivo. Para eu dizer que é da linhagem linfoide B ele tem que ta diante de um CD 20, 19, 22 e 23. Se for da linhagem T ele pode ter um 4, um 8, um 7, um 5. O CD é um marcador de leucemias do tipo B. Ele é interessante para crianças que tem leucemias do tipo B. E quando esse CD 10 está presente a resposta ao tratamento é excelente. Quando ele ta negativo já não é muito boa. 
O que é o HDLADL, é um HLA que está presente em todos os leucócitos no entanto é ausente na leucemia promielocítica. A leucemia promielocítica é uma leucemia que mata nas 24 horas de diagnóstico e saindo dela é a melhor que tem sobrevida. Ela tem muito promielócito. O promielócito tem muitos grânulos, esses grânulos podem se romper e o paciente morre por hemorragia. Coagulação intravascular disseminada.A steam-cell não está comprometida com nada. Quando ela começa a andar, começa amadurecer, aí começa os anticorpos, por exemplo.
Primeiro chega lá tudinho, CD34, vai para linhagem mielóide aí adquire CD13. Esse painel é o menor painel que eu posso fazer. Então esse resultado vai para vocês. Vocês vão olhar quais CDs são positivos. Ai vocês tem que dizer se é leucemia mielóide, se é leucemia linfoide.
Isso é aqui de novo mostrando aquele gráfico anterior ... 20% de CD8 e 45% de CD4.
Isso aqui é a classificação da leucemia que a gente faz só com o mielograma. No olho, eu só consigo dizer isso aqui. Eu digo no olho se uma leucemia é M1, M2, M3. Mas quando chega na leucemia aguda, linfoide aguda .. eu não consigo dizer se é leucemia linfoide de linfócito T ou B. A clínica do paciente é quem ajuda a realizar esse diagnóstico. Só no olho, você não pode identificar. Você só pode provar se é linfócito B ou T através da imunofenotipagem. 
A gente diz apenas pela experiência .. criança de 1 ano fazendo uma leucemia com uma grande quantidade de linfócitos, 95% é uma LAB comum. Mas provar se aquele linfócito é B ou T, só por imunofenotipagem. 
Aqui outro resultado ...por que isso é uma LMA? 
Primeiro parâmetro que a gente ver na citometria de fluxo é a complexidade, tamanho. Aí ele me deu esse gráfico ...primeiro parâmetro: CD45 cruza com CD14. O que é que foi positivo aqui e o que foi negativo aqui? O negativo para 14 descarta monócito .. eu já tiro duas leucemias, a M4 e a M5. O positivo foi o 45 .. o 45 é neutrófilo, e por isso estamos diante de uma célula da linhagem hematopoiética. Tem outra coisa nesse 45 que você pode dizer também .. vocês estão vendo dois clones aqui? Células aqui e células aqui? Vocês estão vendo que o 34 só tem um clone? Tudo de 34 tem o mesmo tamanho, a mesma quantidade de antígeno, e aqui: vocês conseguem compreender que aqui eu tenho um tipo de célula 45 e aqui outro tipo de célula 45? Volta lá para onde eu falei sobre densidade antigênica. Eu tenho uma população de células que são CD45 Low e outra população de células que são CD45 High. Aí eu tenho mais células low, no outro gráfico. Imagine que tiramos uma célula daí: a medida que a célula vem mais para cá, ela terá uma maior densidade antigênica, então eu vou tirar só uma célula daqui. Essa célula aqui ela terá um, dois, três, quatro CD 45. Aí eu peguei essa outra e, por que ela esta aqui? Porque ela adquiriu mais proteína na sua membrana, ela tem mais proteínas. E aqui eu tenho dois tipos de célula. Uma com menor densidade antigênica CD 45. Olhem só, isso aqui está 10² e isso 10³. É a que tem maior densidade antigênica. Então, é fácil para eu dizer que aqui é uma célula mais imatura e aqui é minha célula mais madura. Essa célula mais madura é linfócito normal. Porque quando eu estou diante de uma leucemia, eu tenho [ou não tenho (áudio travando muito)] células de circulações normais, isso são os linfócitos. E, isso aqui, é o meu plano maligno. Isso me dar mais poder que quando eu tenho células jovens. 
	A questão da prova é essa:é um gráfico aí vocês irão dizer positivo high (alta densidade) e positivo low (baixa densidade) e qual a leucemia. Tanto é que, quando eu vou separar as “StemCells”, eu quero as StemCells CD 45 Low, porque ela é mais imatura, menos comprometida. 
	A leucemia mielóide crônica tem todos os tipos de células, então você não irá ver. Mas se eu estiver diante de uma leucemia, eu já sei que essa leucemia aqui é aguda. 
	Você me perguntou o seguinte: “se eu poderia estar diante de uma leucemia, se eu podia estar com um clone maligno de alta densidade.”. Olha lá em cima... L, M, A. O que é LMA? Leucemia Mielóide Aguda. Qual a diferença da aguda para a crônica? A aguda são células jovens e as crônicas são de células maduras. Estaríamos nós fazendo um diagnostico com uma CD 45 High, eu poderia estar maligno sabe quando? Se eu estivesse diante de uma leucemia mielóide crônica. Aí é High. Se for aguda é low. 
	Se eu estou tirando de uma célula mais imatura, a densidade antigênica é menor. Se eu estou diante de uma célula mais madura, a densidade antigênica é maior. Vamos fazer um comparativo! Quem tem mais cabelo pelo corpo sou eu ou minha criança? Claro que sou eu. Então, se eu tiver uma doença de criança, haverá muitas crianças com pouco cabelo. Se eu tiver uma doença de adulto. Por exemplo, se eu disser “É uma festa de criança”, então é uma festa aguda. Então teremos um bocado de criança com pouco cabelo. Vamos imaginar que os cabelos sejam as proteínas. Então se eu disser: “é uma festa de jovens”, então eu terei mais adulto lá, assim terei mais cabelo, festa crônica. Isso só vai apresentar no CD 45, porque no CD 45 ele irá marcar tudo. Ele irá marcar o que é leucócito, linfócitos e assim em diante. Eu vou estudar aqui o marcador 34 de imaturidade, tudo isso aqui marcou isso aqui, CD 34 positivo. Quando eu marquei o CD 34 positivo, eu vi que isso aí é uma leucemia aguda. Então estou diante de uma leucemia, mostrado pelo CD 45, que ela é aguda e que ela não é monocítica, porque o CD 14 deu negativo. 
Ai eu botei outro marcador aqui, o marcador 13 e deu positivo, então eu já to muito próximo então de fechar o diagnostico de (inaudível), mas so um marcador pra dizer que é mieloide pouco, então botei outro o 33. 2 marcadores positivos para linhagem mieloide e um para imaturidade e assim eu fechei o diagnostico para leucemia mieloide aguda M1, pq o t4 deu muito alto. Então vou pro cd10 negativo que é marcador de leucemia B, fui pro 22 negativo também para leucemia B, vim aqui para cel T, ai vcs dizem tem um pouquinho ali ainda, ai eu digo tem sim, mas é o limite de cel maduras circulando. E o meu marcador é 20 %, acima de 20 é positivo, abaixo de 20 é negativo. Alguns marcadores são 15. Isso é negativo para cd3, mas é positivo para hladr,(inaudível) assim tirei m1, tirei m0 pq se deu 13 e 33 positivo não é m0. Então estou diante de uma leucemia mieloide aguda do tipo m1 ou m2. Ai olha a lâmina e fecha o diagnostico lá. Esse cd7 aqui deu positivo, isso aqui é um marcador (áudio falha).O melhor fabricante de monoclonais é uma empresa (inaudível). Quando eu boto no laudo eu digo cd45 marcador leucocitário, cd19 marcador de células b. Vá você que estava prestando atenção. E só para lembrar primeiro a gente analisou a célula a célula que tava aqui era essa: blastos, núcleos e mieloides. Já viu que o primeiro gráfico é diferente. Aluna: cd45 presente, ne? Leucócitos. Cd13 positivo - linha mieloide, mas também tem que olhar o 33, né? Esse tbm deu positivo. Então é leucemia mieloide, com 13 e 33 positivo. Ai 34 deu negativo. Prof: Veja bem, se vc estiver diante de uma leucemia mieloide com o 34 negativo, isso quer dizer uma leucemia mais avançada,ta? Mais diferenciada. Pq o 34 não é imaturidade? Então não é a criancinha, mas já é um menino de 5 anos de idade. Na mieloide eu tenho a m0 que não tem diferenciação nenhuma, depois eu tenho a m1 e depoiseu tenho a m2. A m2 já é leucemia mieloide aguda com diferenciação. A m1 é com mínima diferenciação. No 2º eu disse 34 negativo com 13 positivo é uma leucemia, é uma célulamais que madura do tipo mieloide , e ai podemos esta diante de uma m3. Temos a m1, a m2 e a m3, a m3 é a promielocitica, é uma muito diferenciada. Ai eu disse a vocês que na m3 o hladr tem que ser negativo, então com hladr positivo eu excluo m3. Percebam que isso é um jogo de anticorpos. Aluna: Então ai fecha m2? Prof: fechou. Mas, eu poderia ter ai uma m4, uma mielomonocitica. Mas pq não é m4? Pq cd14 foi negativo. Cd14 é marcado de monócito e a m4 não é a mielomonocitica, então se eu tivesse ai com o 14 positivo, eu estaria com m4, a mielomonocitica. Desse jeito é somieloide m2. Pode ser uma mista? Ainda pode, e por isso vc ainda precisa ir nos marcadores linfoides. A mista em raríssimas vezes eu vi. A mista é você ter duas leucemias, você tem a mieloide e linfoide. (inaudível) é quando na célula eu tenho (inaudível) linfoides e mieloides. (áudio falha)
Já exclui uma grande parte da linfóide,4 e 8, 8 negativo, 4 negativo, 7 negativo, 22 negativo, então excluiu tudo o que era linfóide e ficou sendo uma leucemia, mielóide aguda tipo M2. Essa é a célula, olhe a diferença para aquela, os grânulos, a anterior não tinha grânulos, essa aqui já tem grânulos. Próximo, isso é a M3, tá? É um tipo de M3, isso aqui pessoal é um núcleo e cheio de grânulos, é granulo que não acaba mais! Olha só, a M3 é característica com muito granulo. Existe uma variação de M3 sem granulo ta?
- Essa classificação em M2, M3... tem a ver com a malignidade?
-Está relacionado ao grau de maturação (INAUDIVEL POR 5 SEGUNDOS) , por exemplo, você está diante de um ELDAP (não tenho certeza se é isso) com (INAUDIVEL) em uma criança, essa é uma leucemia (INAUDIVEL), fácil de tratar, mas se essa leucemia estiver no adulto é ruim tratar. Do mesmo jeito, a leucemia mieloide aguda no adulto é mais fácil de tratar, já na criança é mais difícil. Então é o diagnóstico, junto com a idade e o perfil da leucemia e também os dados clínicos.
-pergunta inaudível
-São comportamentos diferentes... não! Isso na verdade é por conta da morfologia da célula, mas com os estudos sabe-se que um tipo de célula é pior de tratar.
-pergunta inaudível
-Não, a aguda é muito pior, se eu tiver uma leucemia... Não, a aguda é muito pior. Se trata hoje... (parte do áudio ficou prejudicada com as conversas paralelas) a agudavocê faz um exame hoje ta doente, faz amanha tá lá em cima! 
-Tudo o que eu tenho aqui agora são diagnósticos, e aí vocês vão brincar, vocês querem ver mais um ou já entenderam todos?
-queremos mais um!
-Olhe esse aqui, vocês já viram que a localização já é diferente? Onde está? Está mais aqui em cima, e eu disse a vocês, quem é que fica mais aqui em cima? Monócitos! Quanto eu chego aqui ó, 45x14 dá positivo, então eita, eu to diante de duas só, M4 ou m5, ou seja, ou a monocitica ou a mielomonocitica, só ter elas duas, não podem ter outras, aí porque eu fechei em M4? Porque o 13 e o 33 deram positivos, então, mielóide como monócitos, mielomonocitica, olhe: 33 e 13, com 14. Chegar uma hora e eu perguntei: poderia ser monócito? Só se o 14 desse positivo. 34 negativo, porque? Porque a mielomonocitica ela é mais madura, todo o restante de linfóide negativo. Olhe a leucemia boa de identificar é muito fácil, mas tem umas meu filho, que você enlouquece e roda o Brasil todinho e não acha o resultado.
-Aí é bom casar com a biomol NE?
-Aí hoje a gente já tem os marcadores moleculares que podem fechar,ta certo? Duvidas?
-Próximo, pronto, pra terminar uma linfóide! LLA, se lembra desse antigênico que eu falei? Olhe, 45 mais baixo, a célula imatura ta mais aqui, porque aqui eu ainda tenho linfócito maduro, e o linfócito maduro é este. Aí 45 positivo, 34 positivo... vocês estão tão dispersos, é o cansaço né?...olhe, essa aqui é mais madura e essa aqui é mais imatura, isso aqui deve ser a doença, tudo deve ta, eu só consigo fechar quando terminar tudo. Ei e esse 34 positivo? Aguda!! Aí eu tenho aguda onde eu não tenho 13 e não tenho 33. Aí aqui pode complicar um pouquinho, eu tenho tanto positividade para 3 quanto para 19, mas aqui deve estar em torno de 25 e aqui de 60%, então a minha doença que está aqui que é B, e esses 25% de 3 está aqui que ainda é do linfócito... tudo isso a gente tem que botar na cabeça porque depois... Se eu quiser dar um diagnóstico errado eu dou, temos que ter muito cuidado quando estivermos estudando, tem que saber separar o mamão, o melão, o abacaxi desta salada de fruta...
Tem que saber separar um mamão, um melão, um abacaxi, dessa salada de fruta que é essa imunofenotipagem, porque se eu quiser estudar isso aqui, eu estudo e digo com 100% de certeza, digo que é leucemia aguda. Então, ela é B, marcou B aqui, marcou B aqui e marcou 22 aqui... É porque eu podia ter botado aqui os valores... Marcou B aqui que é 22, marcou o 10 e marcou D.E. Então, aqui eu fecho em LLAB ~palavra inaudível~ positivo comum. E assim vai...
E tratamento eles já vão ver alguma coisa? “tratamento não!” Pronto, isso aqui é só a imunologia da leucemia, o que eu quis mostrar para vocês é como se monta, como se dá o diagnóstico imunológico da leucemia, junto com isso tem que ter a morfologia...
Eu acho que acabou... pulo, pulo, pulo (vendo slide)... Mostra aqui para eles, as crônicas! Olha aqui a “porrada” de crônica que existe! Cada uma é uma coisa diferente e é mais outra “paulada” de coisa... Então, é muita coisa para a gente está decorando... Isso aqui, pessoal, é no dia-a-dia, não se decora não, aos poucos vai aprendendo...