Apostila de Microbiologia

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Universidade Federal de São Paulo ─ 
Campus Diadema 
UC: Microbiologia Básica 
 
 
 
 
 
 
 
 
ROTEIROS E TÉCNICAS UTILIZADAS EM AULAS 
PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA BÁSICA 
 
 
Docentes 
Profa. Dra. Cristina Viana Niero 
Profa. Dra. Karen Spadari Ferreira 
Profa. Dra. Renata Pascon 
Prof. Dr. Wagner Luiz Batista 
 
Discentes 
Camila Lopes Ramagnoli 
Natalia Maria da Silva 
 
 
2015 
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SUMARIO 
Normas de segurança para as aulas práticas de microbiologia................................................ 3 
Preparo de materiais utilizados em laboratório de microbiologia ............................................. 5 
 Preparo de vidrarias .................................................................................................................... 5 
 Esterilização ............................................................................................................................... 6 
Procedimentos assépticos ........................................................................................................... 7 
Flambagem de alças de platina ................................................................................................... 7 
Flambagem de tubos e frascos.................................................................................................... 8 
Manuseio de pipetas ................................................................................................................... 9 
Preparação de lâminas ............................................................................................................... 10 
 Esfregaços de culturas a partir de meio líquido ......................................................................... 10 
 Esfregaços de culturas a partir de meio sólido .......................................................................... 11 
 Manuseio do microscópio ......................................................................................................... 12 
Coloração de Gram ..................................................................................................................... 14 
Coloração de Ziehl-Neelsen ....................................................................................................... 17 
Preparo de meios de cultura ...................................................................................................... 19 
 Meios de cultura ........................................................................................................................ 21 
Técnicas de semeadura .............................................................................................................. 23 
Técnica de contagem de bactérias pelo método das diluições em placa ............................... 26 
Teste de hemólise em ágar-sangue ........................................................................................... 27 
Teste de motilidade .................................................................................................................... 29 
Teste da catalase ........................................................................................................................ 30 
Teste do tioglicolato ................................................................................................................... 31 
Antibiograma ............................................................................................................................... 32 
Prova do tubo germinativo ......................................................................................................... 34 
Microcultivo em lâmina .............................................................................................................. 35 
Colóquios das aulas práticas ..................................................................................................... 36 
 Roteiro nº 1 ............................................................................................................................... 36 
 Roteiro nº 2 ............................................................................................................................... 40 
 Roteiro nº 3 ............................................................................................................................... 43 
 Roteiro nº 4 ............................................................................................................................... 45 
 
 
 
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NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE 
MICROBIOLOGIA 
 
O pequeno tamanho dos microrganismos e a necessidade de trabalhar com culturas que 
contêm muitos milhões de células requerem o conhecimento de procedimentos especiais de 
segurança. Existem quatro níveis de segurança, classificados de acordo com os fatores de risco 
envolvidos. Muitos são os fatores de risco, e entre eles podemos citar: 
• Tipos de atividade prática; 
• Tipos e fontes dos microrganismos; 
• Condições do laboratório; 
• Maturidade do estudante e experiência dos professores e técnicos (no caso de 
laboratórios de ensino). 
Um risco importante é a geração de aerossóis, gotículas de água contendo células 
vegetativas ou esporos de microrganismos, liberadas para o ar. Essas partículas, muito pequenas, 
podem ser facilmente levadas por correntes de ar e, ao serem inaladas, vão diretamente para os 
pulmões. Muitas das medidas de segurança adotadas são para minimizar o risco de formação de 
aerossóis. 
O trabalho com segurança, no laboratório de Microbiologia, exige o uso apropriado de 
equipamentos de proteção e de técnicas microbiológicas adequadas: 
• Equipamentos de Proteção Individual (EPI): luvas, aventais, gorros, pró-pés, máscaras, 
óculos; 
• Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC): cabine de segurança biológica (localizada em 
ponto de pouco tráfego e distante das portas): existem vários tipos de cabine, dependendo do 
grau de segurança necessário; extintores de incêndio, chuveiro de segurança e lava-olhos; 
• Todas as atividades devem ser realizadas de acordo com as condições conhecidas como 
GMLP (Good Microbiological Laboratory Practice), de forma a evitar a disseminação dos 
microrganismos, proteger os operadores da possibilidade de infecção e o experimento prático de 
contaminações com microrganismos do exterior. Uma das atividades mais importantes para 
manter a área física em condições adequadas é a limpeza geral do laboratório, com cuidado 
especial para as superfícies e com o lixo produzido. 
Você que está iniciando seus estudos em Microbiologia deve ler, atentamente, as normas abaixo, 
tantas vezes quanto necessário, para segui-las rigorosamente: 
 
1. Todo trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de 
EPI: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara 
facial; luvas; sapatos fechados. 
2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem. 
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3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele. 
4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, etc. na bancada de trabalho 
– eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação. 
5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen, que deverá estar acesa durante a maior 
parte do tempo. 
6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% 
ou outra similar (verifique se o bico de Bunsen está aceso). 
7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter 
certeza sobre o que fazer, a cada passo. 
8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material 
necessário – não pegarmais material que o necessário nem material indevido. 
9. Todo o material deve ser devidamente identificado. 
10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas. 
11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de 
contaminação das mesmas. 
12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou 
imprevisto. 
13. Colocar materiais contaminados recipientes próprios, existentes nos 
laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias. 
14. Deixar as Placas de Petri tampadas sobre a bancada. 
15. Deixar as lâminas fornecidas para visualização sobre as bancadas. 
16. Deixar os tubos com culturas nas estantes. 
17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de 
papel fino para retirar o óleo de imersão. 
18. Quando terminar de trabalhar com culturas, esterilizar alças e fios de platina; 
retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos em água corrente e depois 
com álcool 70% ou similar; deixar secar ao ar. 
19. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado 
deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado. 
20. Retirar todo o EPI quando sair do laboratório. 
 
As técnicas especiais de manuseio seguro serão explicadas e demonstradas pelo 
professor no momento apropriado, mas convém lembrar que é necessário um cuidado especial 
para manipular e/ou transportar materiais contendo microrganismos (em caixas ou bandejas, 
mantendo o material em pé para evitar derramamento ou vazamento acidental). 
Lembre que você poderá manusear alguns microrganismos potencialmente patogênicos. 
 
 
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PREPARO DE MATERIAIS UTILIZADOS EM LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA 
 
1. Preparo de vidrarias 
1.1 Tubos, balões, erlenmeyers e outros 
Os tubos de ensaio devem ser tamponados com algodão hidrófobo; alternativamente 
podem ser tampados com roscas que devem resistir à autoclavação. 
Os frascos maiores devem ser tamponados com um tampão mais firme, constituído de 
algodão hidrófobo, gaze e papel alumínio. 
 
1.2 Pipetas 
As pipetas devem ser providas de algodão na extremidade destinada à aspiração. 
Podem ser acondicionadas uma a uma, embrulhadas em papel ou em recipientes 
metálicos adequados, que comportam várias pipetas, no caso de laboratórios com uma rotina 
mais intensa. O volume deve ser anotado no papel quando embaladas individualmente ou no 
recipiente. 
 
1.3 Placas de Petri 
Existem no comércio placas plásticas esterilizadas e descartáveis. Entretanto, podem ser 
utilizadas placas de vidro, que devem ser lavadas e em seguida esterilizadas embrulhadas em 
papel, a fim de se manterem estéreis durante o armazenamento. Se as placas forem utilizadas 
imediatamente, não há necessidade de embrulhar. 
 
2. Esterilização 
No caso de tubos e balões contendo meios de cultura, a esterilização deve ser feita em 
autoclave, sob pressão (115-120ºC durante 20-30 minutos ou condições equivalentes; o tempo 
também depende da quantidade e disposição dos frascos dentro da autoclave). O material deve 
ser coberto com papel impermeável (alumínio, por exemplo) para evitar o umedecimento dos 
tampões. 
Componentes termolábeis de meios de cultura (alguns açúcares, antibióticos, uréia, etc.) 
são esterilizados separadamente, por filtração e depois adicionados ao meio-base, este 
esterilizado em autoclave. 
A vidraria seca pode ser esterilizada em forno de Pasteur, a 170-180ºC durante 1,5 horas 
ou 160ºC por 2 horas (o tempo deve ser contado após a temperatura ser alcançada). 
No caso de tubos vazios com rosca, que não suportam altas temperaturas em calor seco, 
podem ser autoclavados com a tampa semi-rosqueada (para o vapor de água penetrar dentro do 
tubo) ou envolvidos em papel grau cirúrgico e depois secos em estufa. 
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Em qualquer caso, deve-se, periodicamente, validar o processo de esterilização. Para isso, 
existem indicadores, como, por exemplo, tiras de papel impregnadas com esporos bacterianos, 
que devem ser submetidas ao processo de esterilização e depois cultivadas para verificar se os 
esporos foram eliminados. 
 
 
PROCEDIMENTOS ASSÉPTICOS 
 
Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no 
laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: 
• Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários 
estejam o mais próximo possível do operador, e deve ser realizado o mais rapidamente possível; 
• Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o 
trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar; 
• Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente; ele deve ser 
mantido aberto ao redor do bico de Bunsen, na posição mais horizontal possível e deve ter sua 
“boca” novamente flambada antes de ser fechado. Quando você flamba o tubo, o calor cria uma 
corrente de convecção, que força o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes; 
• Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados 
sobre nenhuma superfície; devem permanecer na mão do operador, entre o dedo mínimo e a 
palma da mão durante todo o procedimento; 
• Durante as manipulações, as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem 
entrar em contato com o ar o menor tempo possível; 
• As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com 
frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não 
estéreis como, por exemplo, panos, superfície da bancada, paredes externas de placas ou tubos, 
etc. 
 
1. Flambagem de alças de platina 
Para transportar o material a ser semeado ou repicado utilizamos, na grande maioria das 
vezes, um fio de níquel-cromo com a ponta dobrada em alça, capaz de carregar líquidos, a alça 
de níquel-cromo. Ela deve ser devidamente flambada e esfriada antes de cada operação. Segura-
se a alça perto de sua parte superior, como se faz com um lápis (dedo polegar, indicador e 
médio), num ângulo próximo à posição vertical. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para 
segurar os tampões dos tubos. Preferencialmente trabalhar com alças descartáveis. 
Existem alças calibradas, que carregam um volume conhecido do material, podendo ser 
usadas em determinações quantitativas. Algumas vezes usamos o fio de níquel-cromo sem dobrar 
a ponta, o estilete. 
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Chamamos de flambagem o aquecimento gradual da ponta da alça, pois depois do uso em 
culturas, o aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de 
aerossóis. Deve-se proceder da seguinte maneira: 
1) Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama - essa é a região "fria" da 
chama; 
2) Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama, acima do cone 
azul claro, mantendo-a até que fique completamente vermelha; 
3) Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"); 
4) Esfriar a alça no ar, mantendo-a na mão, sem colocá-la em nenhum local (para que ela 
não se contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um 
tubo ou placa de Petri (regiões estéreis); 
5) Usar imediatamente; 
6) Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. 
 
Observação: para que a alça carregue o líquido é necessário que o círculo exterior esteja 
bem fechado; se necessário, use um alicate. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Técnica de flambagem de alças. 
 
2. Flambagem de tubos efrascos 
1) Afrouxe o tampão do frasco ou tubo, para que ele saia facilmente; 
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2) Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita, 
mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão, rode o frasco e não 
o tampão - o tampão fica fixo); 
3) Passe a boca do tubo para frente e para trás, dentro da chama do bico de Bunsen 
enquanto isso, não se esqueça, o tampão fica preso na mão do operador; 
4) Depois de usar, antes de fechar, repita a operação acima; 
5) Feche o tubo, recolocando o tampão, rodando o tubo e não o tampão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Técnica de flambagem de tubos e frascos. 
 
3. Manuseio de pipetas 
1) As pipetas calibradas ou de Pasteur, com algodão na ponta, previamente esterilizadas, 
acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas 
na frente do bico de Bunsen; 
2) Segurá-las pela região do bocal, como um lápis, colocando o aspirador e mantendo o 
dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido; 
3) Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos; 
4) A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante, imediatamente 
após o uso, para ser transportada. 
 
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4. Cadeia asséptica 
 
 
 
 
 
 
PREPARAÇÃO DE LÂMINAS 
 
1. Preparação de lâminas fixadas 
1.1 Esfregaços de culturas a partir de meio líquido 
1) Identificar a lâmina com lápis dermatográfico; 
2) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem à frente dele; 
3) Segurar a alça de níquel-cromo entre o polegar e o indicador da mão direita, como 
um lápis, se você for destro; 
4) Flambar a alça ao rubro; 
5) Segurar o tubo com a mão esquerda, retirar o tampão de algodão (ou outro qualquer) 
do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mínimo (dedo do bacteriologista); rodar o frasco 
e não o tampão - o tampão fica fixo, alojado entre o dedo mínimo e a palma da mão direita; 
6) Flambar a boca do tubo; 
7) Esfriar a alça no ar, ao lado do bico de Bunsen ou nas paredes internas do tubo; 
8) Introduzir a alça fria dentro do meio de cultura; 
9) Tomar uma alçada da cultura, flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampão e 
descansar o tubo fechado na estante (cuidado para não encostar na boca do tubo, que deverá 
estar quente); 
10) Depositar a alçada sobre a lâmina limpa; esfregar, espalhando bem o material de modo 
que ele ocupe uma grande área da lâmina. 
11) Se necessário, repetir a operação, para colocar mais alçadas na lâmina; 
12) Deixar a lâmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar nela 
(para evitar superaquecimento e formação de aerossóis); 
13) Quando toda água tiver evaporado, fixar o material à lâmina, passando-a três vezes 
na chama do bico de Bunsen (usar uma pinça para segurar a lâmina). Um aquecimento excessivo 
distorce a morfologia das bactérias. 
 
Observação: se for uma cultura pouco turva, não convém espalhar muito, minimizando a 
probabilidade do número de microrganismos ficar menor do que o exigido pela sensibilidade do 
método. 
Esterilização 
Uso Descontaminação (121ºC/15’) Lavagem 
Secagem Acondicionamento 
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Figura 3: Técnica de esfregaços de culturas a partir de meio líquido. 
 
1.2 Esfregaços de culturas a partir de meio sólido 
1) Identificar a lâmina com lápis dermatográfico; 
2) Depositar uma alçada de solução fisiológica ou água destilada na lâmina; 
3) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem à frente dele; 
4) Segurar a alça de níquel-cromo entre o polegar e o indicador; 
5) Flambar a alça ao rubro; 
6) Com um movimento do punho da mão esquerda abrir a placa (a placa está sobre a 
mesa de trabalho, com a tampa apoiada), levantando a base (onde estão as bactérias, sobre o 
meio de cultura) até uma altura adequada; deixar aberta o menor tempo possível; 
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7) Esfriar a alça na parte interna da tampa da placa de cultura; 
8) Tomar uma pequena amostra do crescimento bacteriano, tocando a porção superior de 
uma colônia, levemente, com a alça estéril, de modo a não arrastar o meio de cultura – para fazer 
lâminas finas; 
9) Tampar novamente a placa (toda esta operação é feita ao redor da chama do bico de 
Bunsen); 
10) Se a cultura estiver em tubo, desenroscar a tampa do tubo ou retirar o tampão de 
algodão do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mínimo (dedo do bacteriologista); a 
tampa ou o tampão ficam alojados entre o dedo mínimo e a palma da mão; resfriar a alça nas 
paredes do tubo; introduzir a alça estéril no tubo e tomar uma pequena amostra do crescimento 
bacteriano, tocando levemente o crescimento bacteriano, de modo a não arrastar o meio de 
cultura; flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampão e descansar o tubo fechado na 
estante; 
11) Emulsionar o material na água, espalhando muito bem, usando toda a superfície da 
lâmina, de modo a fazer um esfregaço fino; 
12) Flambar a alça antes de depositá-la sobre a bancada; 
13) Deixar a lâmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar na 
chama, para evitar a formação de aerossóis; 
14) Fixar o material à lâmina seca, passando-a três vezes na chama do bico de Bunsen. 
O excesso de aquecimento pode distorcer a morfologia das bactérias 
 
Observações: 
É importante fazer lâminas finas, para que se tenha uma boa visualização. 
No preparo de lâminas de material biológico de consistência sólida, por exemplo, material 
interdental, utilizar algumas alçadas de água de torneira para obter um esfregaço homogêneo. 
Quando são preparadas lâminas para algumas colorações especiais, a fixação não pode 
ser feita pelo calor. 
 
2. Manuseio do microscópio 
1) Manuseie o microscópio com cuidado; 
2) Limpe as lentes com lenço de papel - o papel toalha não deve ser usado, pois pode 
riscar as lentes; 
3) Acenda a luz; 
4) Ajuste a distância interocular - isso é muito importante, pois se ela não estiver correta 
você verá uma imagem dupla; 
5) Coloque a lâmina; em geral, o seu centro deve ficar no meio do foco luminoso; 
6) Coloque 01 gota de óleo de imersão; 
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7) Ajuste a iluminação. A observação com objetiva de imersão é feita com muita luz, o que 
é conseguido com o diafragma totalmente aberto e o condensador o mais alto possível; 
8) No caso de observação de bactérias, o ajuste do foco é feito, na maioria das vezes, 
diretamente com a objetiva de Imersão. Nesse caso, coloque a objetiva de imersão dentro do 
óleo, encostando-a cuidadosamente na lâmina; rode o parafuso macrométrico vagarosamente, até 
que passe o foco; em seguida, volte com o parafuso micrométrico até o ajuste fino do foco. Se a 
objetiva sair do óleo, volte tudo e recomece; 
9) Alternativamente, você poderá encontrar o foco em aumentos menores e, só depois, 
colocar o óleo e encaixar a objetiva de imersão; 
10) Desça um pouco o condensador, para aumentar o contraste; 
11) Ao final dos trabalhos, tire todo o óleo da objetiva com um lenço de papel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
Em 1884, o dinamarquês Christian Gram desenvolveu um método de coloração que, até 
hoje, é fundamental na Bacteriologia. No método desenvolvido por Gram, o esfregaço bacteriano 
é tratado pelas seguintes soluções, na ordem: 
1º violetade genciana (ou cristal violeta); 
2º lugol (ou solução de iodo-iodetada); 
3º álcool ou álcool-acetona (agente descorante); 
4º fucsina ou safranina (corante de contraste); 
A importância do método de Gram reside no fato dele ser um método diferencial, o que 
permite distinguir as bactérias em dois grupos: 
- GRAM-POSITIVAS, que retêm o complexo violeta de genciana - lugol e aparecem 
coradas em azul (ou azul-arroxeado); 
- GRAM-NEGATIVAS, que são descoradas pela lavagem com álcool, e se coram 
posteriormente em vermelho, pelo corante de contraste. 
Tal divisão ocorre graças a coloração diferenciada que cada grupo apresenta de acordo 
com a composição química de sua parede celular. As Gram positivas retêm o complexo cristal 
violeta - lugol na sua grande camada de peptideoglicanos, aparecendo assim coradas em azul-
arroxeado. Já as Gram negativas não retêm o complexo mencionado por possuirem uma camada 
menor de peptideoglicanos, sendo assim descoradas pela lavagem com álcool. Com isso, elas 
posteriormente são coradas em vermelho pelo corante de contraste (fucsina). 
 
1. Método 
1.1 Preparo do esfregaço 
1) Colocar uma gota de salina sobre uma lâmina de vidro; 
2) Espalhar sobre a lâmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxílio 
de uma alça de platina ou descartável de forma a obter uma camada homogênea e pouco densa; 
3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50ºC) ou com metanol absoluto durante 1 
minuto. 
 
1.2 Coloração 
1) Cobrir toda a lâmina com a solução de cristal violeta; 
2) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 
3) Cobrir a lâmina com lugol; 
4) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 
5) Inclinar a lâmina e gotejar álcool etílico a 95% (ou álcool acetona); 
6) Lavar a lâmina rapidamente com água corrente; 
7) Cobrir com fucsina de Gram; 
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8) Aguardar 30 segundos; 
9) Lavar a lâmina e secar (sem esfregar). 
 
2. Controle de qualidade 
- Gram positivos: Staphylococcus, Streptococcus e Enterococcus. 
- Gram negativos: Escherichia coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, entre outros. 
 
3. Reagentes 
3.1 Violeta de genciana 
- Violeta de genciana 10g; 
- Ácido fênico 20g; 
- Álcool absoluto 100mL; 
- Água destilada 900mL. 
 
3.2 Álcool 95% 
Em água destilada, ou álcool comercial. 
Obs: pode-se usar mistura álcool-acetona em várias proporções. 
 
3.3 Lugol 
- Iodeto de potássio 2g; 
- Iodo 1g; 
- Água destilada 300mL. 
 
3.4 Fucsina de gram (Para uso, diluir 1/10 em água destilada) 
- Fucsina básica 1g; 
- Álcool 95% 10g; 
- Ácido fênico 5g; 
- Água destilada 100 mL. 
 
3.5 Safranina 
- Safranina 1g; 
- Álcool 1mL; 
- Água destilada 100mL. 
 
4. Funções dos reagentes 
• O calor funciona como agente fixador. 
• O ácido fênico (presente na solução de violeta de genciana) é o mordente (que facilita a 
penetração do corante). 
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• O complexo violeta de genciana-lugol funciona como corante essencial e cora 
protoplasma bacteriano. 
• O álcool é o agente diferenciador e auxilia na retirada da camada lipídica em Gram 
negativas). 
• A fucsina (ou a safranina) é o corante de contraste e cora Gram negativa. 
 
 
 
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN 
Existem bactérias que, devido à composição química de suas paredes, não se coram bem 
pelo método de Gram, necessitando de condições mais drásticas para que o corante penetre em 
seu interior. O método de Ziehl-Neelsen é baseado no fato de que certas bactérias, como os 
bacilos da tuberculose e da lepra (micobactérias), quando tratadas pela fucsina fenicada a quente 
resistem ao descoramento subsequente por álcool acidificado. Assim sendo, permanecem 
coradas em vermelho, enquanto outras bactérias não resistem e tomam a coloração de contraste. 
Esta propriedade, chamada de álcool-ácido-resistência, está relacionada a existência de certos 
lipídeos (em grande quantidade) na parede celular, os quais não permitem a extração do corante 
pelo agente diferenciador. Este método permite, portanto a classificação das bactérias em dois 
grupos: álcool-ácido resistentes (resistem a descoloração e ficam vermelhas) e não álcool-ácido 
resistentes (descoram e ficam azuis graças a posterior coloração com azul de metileno). 
 
1. Método 
1.1 Preparo do esfregaço 
1) Colocar uma gota de salina sobre uma lâmina de vidro; 
2) Espalhar sobre a lâmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxílio 
de uma alça de platina ou descartável de forma a obter uma camada homogênea e pouco densa; 
3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50ºC) ou com metanol absoluto durante 1 
minuto. 
 
1.2 Coloração 
1) Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada; 
2) Aquecer a lâmina até produzir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de 5 minutos; 
3) Lavar a lâmina em água corrente, suavemente; 
4) Colocar álcool-ácido clorídrico 3% até que não se desprenda mais corante; 
5) Lavar a lâmina com água; 
6) Cobrir o esfregaço com azul de metileno por 30 segundos; 
7) Lavar a lâmina com água; 
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8) Deixar secar e observar ao microscópio com objetiva de imersão. 
 
2. Controle de Qualidade 
- Álcool-ácido resistentes: micobactérias, rhodococcus, nocardias. 
- Não álcool-ácido resistentes: Escherichia coli, entre outros. 
 
3. Reagentes 
3.1 Fucsina de Ziehl 
- Fucsina básica 1g; 
- Álcool 95% 10mL; 
- Ácido fênico 5g; 
- Água destilada 100 mL. 
 
3.2 Álcool-ácido 
- Álcool 95% 990 mL; 
- Ácido clorídrico concentrado 10 mL. 
 
3.3 Azul de metileno 
- Azul de metileno 33,5 mL; 
- Água destilada 1000 mL. 
 
4. Funções dos reagentes 
• A fucsina fenicada é o corante específico para micobactérias. 
• O calor funciona como agente fixador. 
• A lavagem com álcool-ácido clorídrico 3% é responsável por descolorir todas as 
bactérias, exceto as micobatérias, pois o corante (fucsina fenicada) tem preferência por sua 
grande camada lipídica. 
• O corante azul de metileno é responsável por colorir as outras bactérias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
 
1. Preparo, distribuição e armazenamento dos meios de cultura 
Os meios de cultura podem ser preparados a partir da pesagem de cada um dos 
componentes separadamente (exemplo: peptona, glicose, cloreto de sódio, etc.); existem no 
comércio os meios de cultura nos quais os nutrientes já estão previamente misturados na 
proporção adequada; em alguns casos se parte da matéria prima bruta, por exemplo: carne, 
batata, etc. 
Após a pesagem dos componentes (os fabricantes ou os manuais indicam a proporção 
adequada), o meio deve ser dissolvido em água destilada, geralmente a quente (principalmente se 
forem meios sólidos, pois o ágar só se dissolve a quente). Devem, então, ser esterilizados, na 
maioria das vezes em autoclave, sob pressão (115-120ºC, por 20-30 minutos ou equivalente), 
sendo que a maneira de acondicionar o meio vai depender de como ele vai ser utilizado (em 
placas ou em tubos). 
 
1.1 Meios de cultura em tubos 
Os meios de cultura que vão ser utilizados em tubos, quer sejam sólidos, semi-sólidos ou 
líquidos são, após a dissolução dos componentes, distribuídos diretamente nos tubos; são, a 
seguir, tamponados o e o conjunto vai ser esterilizado em autoclave, sob pressão. 
Depois de autoclavados, os tubos contendo meios sólidos são deixados esfriar em pé ou 
inclinados, para que o meio solidifique na condição adequada ao uso que se destinam, em cada 
caso. 
 
1.2 Meios de cultura em placas de Petri 
Os meios de cultura que vão ser usados em placas de Petri (sempre meios sólidos) 
costumam ser preparadosem grande quantidade (de acordo com o necessário a ser usado em 
alguns dias - 15 a 20 mL por placa), em Erlenmayers ou similares; o meio é autoclavado e, ainda 
líquido, vertido nas placas estéreis, ao redor da chama do bico de Bunsen, preferencialmente 
dentro de uma capela de fluxo laminar, com todo o cuidado para evitar contaminações: 
1) Limpar e desinfetar muito bem a bancada, que deve estar completamente livre de 
objetos estranhos à operação; 
2) Segurar o frasco com a mão esquerda; remover o tampão com o dedo mínimo da mão 
direita e mantê-lo até terminar a operação; se achar melhor, pode segurar o frasco com a mão 
direita e manter o tampão com a esquerda; 
3) Flambar a boca do frasco; 
4) Com a mão que estiver segurando o tampão, abrir ligeiramente a tampa da placa de 
Petri e verter vagarosamente (evitar bolhas) o meio de cultura estéril até cobrir totalmente o fundo, 
18 
 
mas não encher muito, pois o ágar não deve tocar a tampa da placa (o volume de meio varia entre 
15 e 20 mL); fechar a placa; 
5) Empurrar, cuidadosamente, a placa com meio de cultura, fechada, para o lado, trazendo 
uma placa vazia para perto do bico de Bunsen; 
6) Flambar a boca do frasco e repetir a operação até a última placa ou o final do meio de 
cultura; 
7) Esperar solidificar, antes de mexer nas placas; 
8) Armazenar em posição invertida (a tampa da placa apoiada na superfície). 
 
1.3 Teste de esterilidade 
Os meios prontos devem ser incubados por 24h em estufa a 35°C para confirmar sua 
esterilidade. 
 
1.4 Armazenamento 
O armazenamento dos meios de cultura é feito, geralmente, em geladeira. 
Entretanto, se o material for guardado por muito tempo nessas condições (mais do que 05 
dias) ocorre evaporação da água do meio de cultura e a superfície seca, prejudica o crescimento 
dos microrganismos (principalmente os meios em placa). Por isso, prefere-se os tubos com rosca, 
ao invés dos fechados com tampões de algodão; também por isso, costuma-se manter as placas 
em sacos plásticos selados. 
Uma alternativa para o armazenamento prolongado dos meios de cultura em geladeira, é 
autoclavá-los em porções de 20 mL, em frascos com rolha de borracha e selo de alumínio 
(chamados "frascos de penicilina"). Dessa maneira, os meios podem permanecer por longos 
períodos, inclusive à temperatura ambiente. Quando houver necessidade de uso, os meios 
líquidos são simplesmente distribuídos em condições assépticas, para tubos previamente 
esterilizados em forno de Pasteur; os meios sólidos são fundidos em banho-maria fervente e 
distribuídos em tubos estéreis ou vertidos diretamente em placas de Petri previamente 
esterilizadas (a quantidade contida num frasco é a adequada para uma placa). 
Existem procedimentos especiais, no caso, por exemplo, de um dos componentes do meio 
de cultura não poder ser esterilizado por autoclavação, por não suportar altas temperaturas, 
decompondo-se. É o caso da uréia, que deve ser esterilizada por filtração e depois misturada ao 
meio de cultura básico, que contem os outros nutrientes e que foi preparado da maneira 
convencional; é o caso também do sangue, que é colhido do carneiro (ou de outro animal) em 
condições de assepsia e misturado a um meio-base, já estéril, para o preparo do ágar-sangue. 
 
 
 
 
19 
 
2. Controle de qualidade 
Além do teste de esterilidade, deve-se retirar algumas unidades de cada partida de meio 
de cultura e semeá-las com bactérias de comportamento conhecido para verificar se o meio está 
funcionando adequadamente. 
 
3. Meios de cultura 
Chama-se de meio de cultura a um conjunto de substratos ou nutrientes, nos quais os 
microrganismos são cultivados em laboratório. Dá-se o nome de cultura a qualquer crescimento 
ou cultivo de microrganismos. 
Quanto ao estado físico, os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos ou semi-sólidos: 
• Nos sólidos, o agente endurecedor é o ágar-ágar, polissacarídeo extraído de algas 
marinhas, que é utilizado em menores concentrações nos meios semi-sólidos. 
• Os meios líquidos permitem um crescimento mais abundante das bactérias, devido à sua 
fluidez (culturas para enriquecimento), porém não permitem o isolamento (separação) das 
bactérias. Este só é obtido em meio sólido, em placas, utilizando técnica adequada de semeadura 
(técnica de obtenção de colônias isoladas). 
Quanto à composição, os meios de cultura podem ser ricos ou pobres: 
• Os primeiros contêm substâncias orgânicas complexas (triptona, vitaminas, etc.) e devem 
ser utilizados para o cultivo de bactérias exigentes nutricionalmente, ou seja, com menor 
capacidade de síntese. Exemplo: ágar-sangue, ágar-chocolate, BHI (“brainheart-infusion”) etc. 
• Os meios pobres são utilizados para microrganismos menos exigentes, com maior 
capacidade de síntese, como, por exemplo, as enterobactérias e os fungos. 
A maioria dos meios de cultura contém ingredientes cuja composição química não é bem 
definida. Exemplo: peptona (proteína de carne ou de soja parcialmente digerida); triptona (maior 
grau de digestão); extrato de levedura, etc, são os meios complexos. Entretanto, existem meios 
cuja composição química é definida, chamados de meios sintéticos, que contêm aminoácidos, 
vitaminas, açúcares e sais purificados e em quantidades conhecidas. 
A maioria dos meios sintéticos é muito cara e sua utilização é restrita a ensaios de 
doseamento de aminoácidos e vitaminas através do crescimento de bactérias. 
Existem meios de cultura seletivos, que são utilizados quando se privilegia cultivar um 
determinado grupo de microrganismos, a partir de um material contaminado com vários. A 
seletividade é obtida pela adição de substâncias que inibem o crescimento dos microrganismos 
não desejados. 
 
 
 
 
 
20 
 
Exemplos: 
• EMB = “eosine - methylene - blue” - os corantes inibem o crescimento de bactérias que 
não as enterobactérias, pseudomonas e outros bacilos aparentados com estas últimas. 
• Mac Conkey = contém corantes e sais biliares e tem utilização similar ao EMB. 
• Thayer-Martin = ágar-chocolate adicionado de vancomicina, colistina e nistatina, utilizado 
para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae a partir de secreções vaginais ou uretrais. 
• Ágar-batata-dextrose = meio pobre que é utilizado acidificado (pH < 3,5) para o 
crescimento exclusivo de bolores e leveduras. 
Existem meios que são diferenciais, ou seja, permitem distinguir uma determinada 
característica dos microrganismos. Exemplo: os meios EMB e Mac Conkey, além de serem 
seletivos, são diferenciais, permitindo distinguir as bactérias lac+ (fermentadoras de lactose) das 
lac- (não fermentam lactose), que apresentam colônias com cores diferentes. 
Há ainda os meios para provas bioquímicas, cuja composição permite testar alguma 
característica metabólica da bactéria. Esses meios são utilizados na identificação de bactérias. 
Convém ressaltar que, dependendo do microrganismo que visamos cultivar, devemos 
escolher adequadamente os meios de cultura, bem como as condições de cultivo, no que diz 
respeito à temperatura, tempo e atmosfera de incubação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
TÉCNICAS DE SEMEADURA 
 
Dependendo do objetivo do nosso trabalho, utilizamos diferentes procedimentos para a 
semeadura ou inoculação de nosso material no meio de cultura. 
Podemos semear diferentes materiais: urina, fezes, sangue, pus, etc. nos laboratórios 
clínicos; água, medicamentos, alimentos, etc., nos laboratórios de controle de qualidade 
microbiológica nas indústrias e laboratórios de Saúde Pública. 
Os mesmos procedimentos são usados para transferir um microrganismo deuma cultura 
para um novo meio de cultura; esta operação costuma ser chamada de repique (o verbo é 
repicar). 
Para transportar o material a ser semeado ou repicado, utilizamos: 
- alça de níquel-cromo: deve ser devidamente flambada e esfriada (na parte interna do 
tubo ou frasco, ou na parte interna da tampa da placa). Existem alças calibradas, que carregam 
um volume conhecido do material, podendo ser usadas em determinações quantitativas. Segura-
se a alça como se faz com um lápis (dedo polegar, indicador e médio). 
- pipetas esterilizadas: utilizadas para determinações quantitativas (contagens de 
microrganismos). 
Essas operações devem ser feitas em ambiente de esterilidade, o qual pode ser obtido 
com um bico de Bunsen com a chama alta, ao redor da qual existe uma esfera livre de 
microrganismos, ou em câmaras de fluxo laminar, preferencialmente. 
Existem procedimentos básicos que visam: 
• Evitar contaminação das culturas com microrganismos do ambiente; 
• Evitar contaminação cruzada entre culturas; 
• Evitar contaminação do operador; 
• Evitar que o operador contamine as culturas. 
 
1. Manuseio de tubos 
Quando se manuseia um tubo ou outro frasco similar num laboratório de microbiologia, ele 
sempre tem algum tipo de tampão. Este deve ser removido (se for pequeno, com o dedo mínimo) 
e a boca do tubo deve ser flambada na ocasião da abertura (operação que faz com que 
microrganismos do ambiente, que porventura cheguem, morram) e na operação de fechamento 
(podemos esbarrar a alça contaminada na boca, contaminando-a, o que traz risco de 
contaminação do tampão e conseqüentemente do operador). 
 
Observações: 
Durante todo o procedimento, o tampão deve permanecer no dedo mínimo, não na 
bancada. 
22 
 
Segurar o tubo somente quando estritamente necessário. Utilize a estante para apoio, 
senão, às vezes, vai faltar mão. 
 
2. Manuseio de placas de Petri 
Quando se está utilizando alça de níquel-cromo, posicionamos a placa com a tampa 
apoiada na bancada, de modo que possamos abri-la, examiná-la e fechá-la com apenas uma das 
mãos (a outra está segurando a alça). Esse procedimento permite que a placa fique aberta o 
menor tempo possível, minimizando o risco de contaminação por microrganismos do ambiente. De 
preferência, manusear a placa em posição inclinada, na direção da chama e não na horizontal. 
Quando utilizamos pipetas para a semeadura de materiais líquidos, temos que utilizar a 
placa na posição normal na bancada, para que o líquido não escorra. Também se utiliza essa 
posição em alguns procedimentos com fungos. 
Após as placas serem semeadas, elas devem ser colocadas na estufa, para o crescimento 
dos microrganismos, em posição invertida, ou seja, a tampa apoiada. Se fizermos o contrário, 
parte da água do meio de cultura que sofre vaporização condensa na tampa, e cai sobre a cultura, 
prejudicando a técnica de semeadura utilizada. 
 
3. Técnicas de obtenção de colônias isoladas (método de esgotamento) 
O isolamento de colônias é necessário para separar os diferentes tipos bacterianos 
existentes num material; freqüentemente, cada bactéria vai apresentar um aspecto diferente de 
colônia no que diz respeito a tamanho, cor, brilho, bordas (regulares ou irregulares). Tal 
procedimento permite que se estude separadamente cada bactéria, verificando sua forma, 
propriedade tintorial, características bioquímicas e antigênicas, permitindo sua identificação. 
O mesmo procedimento é utilizado para isolar bactérias de culturas mistas. 
Para que se obtenha um bom isolamento, utilizam-se placas comuns (cerca de 10 cm de 
diâmetro) contendo meio de cultura apropriado. Placas pequenas não devem ser utilizadas, por 
não apresentarem a superfície necessária. 
 
3.1 Procedimento 
a) Tomar uma alçada do material e fazer estrias, bem próximas umas das outras, até a 
metade da placa; flambar e esfriar a alça; 
b) A partir de a), fazer outras estrias, ocupando ¼ da superfície da placa, em direção 
perpendicular; flambar e esfriar a alça; 
c) Repetir a operação, a partir de b); 
d) Incubar as placas em temperatura, atmosfera e por tempo adequado; 
e) Observar os tipos de colônias obtidos. 
Observação: eventualmente pode ser utilizado um número maior de operações. 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4: Método de esgotamento. 
 
4. Semeadura com alça de Drigalski 
A alça de Drigalski original era um bastão de vidro retorcido (de modo a formar um 
triângulo na sua extremidade), mas pode-se utilizar um fio grosso de níquel-cromo. É utilizada na 
técnica clássica de contagem de bactérias, realizadas nos laboratório clínicos e de controle de 
qualidade de alimentos, medicamentos e cosméticos. A semeadura com essa alça visa uma 
homogeneização do inóculo sobre a superfície do meio de cultura. 
 
4.1 Procedimento 
1) Com a placa em posição normal (tampa para cima), pipetar 0,1 ml do material a ser 
semeado; 
2) Flambar a alça, esfriar na parte interna da tampa, e espalhar o inóculo por toda a 
superfície da placa (manuseando a alça em todas direções); 
3) Incubar as placas na posição invertida (tampa para baixo), nas condições de tempo, 
temperatura e atmosfera adequadas; 
4) Proceder a leitura (contagem de colônias). 
 
5. Semeadura com “swab” 
É uma técnica utilizada para se obter uma semeadura homogênea do inóculo nos 
antibiogramas. 
 
5.1 Procedimento 
1) Molhar o “swab” na suspensão bacteriana; 
2) Pressionar o “swab” contra a parede do tubo, para retirar o excesso de líquido; 
3) Fazer estrias bem próximas, umas das outras, por toda a superfície da placa, em 3 
direções. 
24 
 
TÉCNICA DE CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DAS 
DILUIÇÕES EM PLACA 
1. Procedimento 
1) A partir de suspensão bacteriana de E. coli a ser contada, realizar as diluições 
sucessivas, de 10-1 até 10-5, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspensão original para o 
tubo contendo 9 mL de salina estéril. Homogeneizar. Esta é a diluição 10-1. A partir deste tubo 
repetir o procedimento para obter os tubos com as diluições 10-2, 10-3, e assim sucessivamente 
até 10-5. 
2) A partir de cada diluição, proceder à inoculação de 0,1 mL em cada placa contendo 
meio de Agar simples. 
3) Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky. 
4) Incubar as placas a 37°C durante 24h. 
 
Posteriormente, selecione uma das placas incubadas e conte o número de colônias. 
Para efeito de cálculo, considerar as placas que tenham entre 25 e 250 colônias. 
Essa escolha é feita para se obter um resultado o mais seguro possível: a contagem em 
placas com muitas colônias não é confiável, pois as colônias, muitas vezes, estão juntas. 
Em placas com contagem baixa, verificou-se que a flutuação estatística é muito grande, às 
vezes, da ordem de 10 vezes na mesma diluição. 
 
Calcule a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula: 
 
UFC = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem) 
 
UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a contagem feita referente às 
colônias e não às células presentes. 
10** é um fator de correção. 
 
Exemplo: 
Caso contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2, o cálculo final 
será: 
UFC = 105 x 10 x 10-2 = 1,05 x 105 UFC/mL 
 
 
 
 
 
25 
 
TESTE DE HEMÓLISE EM ÁGAR-SANGUE 
As bactérias podem ser diferenciadas e assim classificadas através da macro-morfologia 
de suas colônias. Uma dessas características fenotípicas é a hemólise em ágar-sangue. A 
hemólise pode ser classificada em três tipos: 
- Beta-hemólise: lise total dos eritrócitos - presença de halo transparente ao redor dascolônias semeadas; 
- Alfa hemólise: lise parcial dos eritrócitos - presença de halo esverdeado ao redor das 
colônias semeadas; 
- Gama hemólise: sem hemólise - ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos 
permanecem íntegros). 
 
1. Método 
1.1 Preparo do meio 
1) Pesar e hidratar o meio base conforme instruções do fabricante. Podem ser utilizados 
como meio base: tríptico de soja ágar (TSA), Columbia ágar, BHI ágar, Mueller Hinton ágar; 
2) Esterilizar em autoclave; 
3) Esfriar a base à +/- 50ºC; 
4) Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro ou coelho para cada 100 mL de 
base; 
5) Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas; 
6) Distribuir em placas de Petri. 
Observação: o pH deve se manter em torno de 7. 
 
1.2 Inoculação 
1) Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura por esgotamento; 
2) No final da semeadura, picar o meio com a alça introduzindo-a verticalmente ao ágar 
para verificar hemólise em profundidade; 
3) Incubar à 36ºC (+ ou - 1ºC) por 24 horas. 
 
2. Controle de qualidade 
- Hemólise beta: Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus; 
- Hemólise alfa: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae; 
- Hemólise gama: Enterococcus faecalis ou Staphylococcus epidermidis. 
 
3. Recomendações 
Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se, 
dificultando o estudo de hemólise. 
26 
 
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser 
abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de 
identificação, para não correr o risco de se trabalhar com cepas misturadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
TESTE DE MOTILIDADE 
As bactérias móveis podem conter um ou mais flagelos, sendo assim classificados em: 
- Monotríquias: único flagelo em uma das extremidades; 
- Lofotríquias: tufo de flagelos em uma ou ambas as extremidades; 
- Anfitríquias: único flagelo em cada extremidade; 
- Peritríquias: cercada de flagelos. 
 
O movimento pode então ser classificado em: 
- Positivo e polar: as bactérias apresentam movimento em flecha; 
- Positivo e peritríquio: as bactérias apresentam movimentos circulares; 
- Negativo: apenas movimento browniano. 
 
1. Método 
1) Tocar uma colônia isolada com agulha bacteriológica ou alça estéreis; 
2) Inocular a bactéria até dissolvê-la na parede do tubo contendo o meio líquido; 
3) Incubar por duas horas a 35ºC; 
4) Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e cobrir com lamínula; 
5) Examinar ao microscópio com aumento de 400X. 
 
2. Controle de qualidade 
- Pseudomonas aeruginosa apresenta movimento positivo e polar, enquanto Klebsiella sp 
apresenta movimento negativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
TESTE DA CATALASE 
O desdobramento do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é mediado pela enzima 
catalase. Quando uma pequena quantidade de um microrganismo que produz a catalase é 
introduzido em peróxido de hidrogênio, rapidamente bolhas de oxigênio, o produto gasoso da 
atividade da enzima, são produzidas. 
 
1. Método 
1) Com auxílio de uma alça ou vara de madeira estéreis, transferir uma pequena 
quantidade do crescimento bacteriano puro para superfície de uma lâmina de vidro limpa e seca. 
2) Colocar uma gota de água oxigenada a 3% em uma porção da colônia na lâmina. 
3) Observar a formação das bolhas de gás, indicando um teste positivo. 
 
2. Controle de qualidade 
Os estafilococos e os estreptococos são respectivamente controles positivo e negativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
TESTE DO TIOGLICOLATO 
As bactérias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou não de oxigênio 
para crescerem em: 
- Aeróbias estritas: crescem somente na presença do oxigênio; 
- Anaeróbias estritas: crescem somente na ausência do oxigênio (o gás é letal a essas 
bactérias); 
- Anaeróbias facultativas: o oxigênio não é essencial para o seu crescimento, porém 
crescem melhor na presença do mesmo; 
- Microaerófilas: necessitam do oxigênio para crescerem, porém em níveis menores; 
- Anaeróbias aerotolerantes: oxigênio não é letal, porém crescem melhor na ausência do 
mesmo. 
Para o teste, os tubos de tioglicolato apresentam um indicador de oxigênio, a rezazurina, 
presente somente na região superior do meio (+/- 2 cm), a qual possui coloração rósea. Sendo 
assim, a partir da análise da concentração das bactérias nas diferentes regiões do tubo é possível 
classificá-las com sua necessidade ou não do oxigênio para crescerem, como pode ser 
visualizado na figura abaixo: 
 
 
 
1. Controle de qualidade 
- Aeróbias estritas: bactérias do gênero Pseudomonas; 
-Anaeróbias estritas: Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Porphiromonas gengivallis, 
Prevotella intermedia; 
- Anaeróbias facultativas: Escherichia coli, espécies de Staphylococcus e Streptococcus e 
todas as bactérias da família Enterobacteriaceae; 
- Microaerófilas: bactérias do gênero Campylobacter; 
- Anaeróbias aerotolerantes: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophillus. 
30 
 
ANTIBIOGRAMA 
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de 
bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de 
novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A 
suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário 
ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (Minimun Inhibitory Concentration) ou MBC 
(Minimun Bactericidal Concentration). 
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em 
preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a 
bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. 
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, no qual 
discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar 
uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do 
agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas 
padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais: 
- Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um 
meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas; 
- Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-se realizar 
a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão 
de turbidez (Escala de Mac-Farland). 
 Através desse método é possível analisar pelo método de difusão a resistência de E. coli a 
alguns antibióticos. 
 
1. Materiais 
 - “Swab” estéril; 
 - cultura líquida fresca de Eschirichia coli; 
 - placas de Petri, com meio Mueller-Hinton sólido; 
 - discos de papel com antibióticos; 
 - pinças; 
 - régua. 
 
2. Procedimento 
1. Introduzir nas culturas um “swab” estéril, retirar o excesso de líquido comprimindo a 
ponta do “swab” nas paredes do tubo; 
2. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de 
Petri (meio Mueller-Hinton).Espalhar bem, de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a 
superfície do meio sólido; 
3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos); 
31 
 
4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças); 
5. Incubar em estufa a 37ºC, por 16 a 24 horas; 
6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela 
abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bactéria Discos com antibióticos 
 
Oxacilina 
OX 
(1g/mL) 
Carbemicilina 
CB 
(100g/mL) 
Kanamicina 
K (30g/mL) 
Rifampicina 
RIF 
(30g/mL) 
Sulfonamida 
SUL 
(300g/mL) 
Estreptomicina 
EST (10g/mL) 
Escherichia coli 
Leituras (mm) 
Resultados 
Padrões 
R< 10 
S> 13 
R< 13 
S> 17 
R< 12 
S> 15 
R< 16 
S> 20 
R< 12 
S> 17 
R< 11 
S> 15 
32 
 
PROVA DO TUBO GERMINATIVO 
Cepas de Candida albicans produzem tubos germinativos a partir de sua célula 
levedurifome quando adicionadas a um meio nutriente líquido e incubadas a 35ºC por 3 horas 
(similar ao estado in vivo). 
 
1. Método 
1) Suspender um pequeno inóculo das células levedurifomes de uma colônia isolada em 
0,5 mL de soro; 
2) Incubar entre 35º e 37ºC por não mais que 3 horas; 
3) Após a incubação, adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pauster em lâmina e 
cobrir com lamínula; 
4) Examinar ao microscópio a presença dos tubos germinativos. Um tubo germinativo é 
definido como um apêndice que é metade da largura e três a quatro vezes o comprimento da 
célula de levedura da qual tem origem. Na maioria dos casos, não há nenhum ponto de constrição 
na origem do tubo nas células. 
 
2. Controle de qualidade 
Candida albicans e Candida tropicalis são usadas como controle positivo e negativo 
respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
MICROCULTIVO EM LÂMINA 
1. Método 
1) Cortar um pequeno bloco de ágar apropriado que tenha sido previamente vertido em 
uma placa a uma profundidade de cerca de 2 mm. O bloco deve ser cortado com uma lâmina de 
bisturi estéril. 
2) Colocar uma lâmina estéril na superfície de uma placa contendo solução ágar 2%. 
Como alternativa, colocar um pedaço redondo de papel de filtro ou papel toalha na placa estéril, 
adicionar duas zaragatoas, e posicionar a lâmina de microscópio por cima. 
3) Adicionar o bloco de ágar na superfície da lâmina de microscópio esterilizada. 
4) Com um ângulo direito da alça em L, inocular os quatro quadrantes do ágar com o 
organismo. Aplicar uma lamínula estéril sobre a superfície do ágar. 
5) Se o filtro de papel é utilizado, adicionar uma pequena quantidade de água estéril para o 
fundo do prato de cultura. Colocar a tampa da cultura e incubar a 30ºC. 
6) Após um período de incubação apropriado, remover a lamínula (trabalhando dentro de 
um gabinete de segurança biológica) e fixar o organismo na lamínula com 1 a 2 gotas de álcool 
(esperar secar). 
7) Colocar em uma lâmina contendo uma gota de lactofenol azul algodão ou anilina. 
8) Observar ao microscópio a forma característica e o arranjo dos esporos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Disposição da lâmina. 
 
 
 
 
 
 
34 
 
COLÓQUIOS DE AULAS PRÁTICAS 
 
AULA PRÁTICA 1 
Primeira Parte 
 
Preparo de meios de cultura e vidraria utilizadas em rotina de microbiologia, esterilização e 
técnicas de manipulação asséptica 
 
Introdução 
 
 Entre os vários métodos de esterilização existentes, dois são os mais indicados para 
serem utilizados no laboratório, devido à facilidade e segurança que oferecem: 1) esterilização por 
calor úmido em autoclave e, 2) calor seco em forno Pasteur (estufa esterilizadora). Entretanto, 
para que estes métodos funcionem corretamente, deve-se considerar o binômio tempo-
temperatura, pois se o mesmo não for correto, a esterilização não ocorrerá. 
 
Objetivos 
 
Aprender a preparar e acondicionar meios de cultura e materiais de laboratório para a 
esterilização por autoclave (calor úmido); 
Aprender a forma correta de uso da estufa e da autoclave (métodos de esterilização por calor 
seco e úmido respectivamente); 
Aprender a técnica de manipulação asséptica 
 
Procedimento 
 
1 Preparo de meios de cultura e vidrarias 
a) Desinfecção do local de trabalho com álcool 70%; 
b) Preparar o meio de cultura LB sólido: 
 - 10g de peptona caseína; 
 - 5g de extrato de levedura; 
 - 10g de NaCl; 
 - 15g de ágar bacteriológico; 
 - H2O q.s.p. 1000 mL. 
(ajustar a fórmula para o volume final de 60 mL) e acondicionar o meio de cultura em Erlemmeyer 
de 250 mL. 
 
c) Acondicionar duas placas de Petri para autoclavação (seguir orientação do instrutor); 
d) Demonstração (em grupo de 10 alunos) da técnica de esterilização pelo calor úmido sob 
pressão (autoclavação) a partir do meio de cultura preparado e o material de acondcionamento; 
e) Demonstração da técnica de esterilização pelo calor seco (forno de Pasteur); 
f) Treinamento individual da técnica de flambagem de alças e agulhas de semeadura 
bacteriológica, tubos de ensaio e balões de fundo chato (seguir orientação do instrutor). 
 
2. Manipulação asséptica 
 
a) Manipulação de placas de Petri: treinar repetidas vezes a técnica de abrir e fechar uma placa 
de Petri (100 x 15mm), utilizando-se apenas uma das mãos, conforme demonstração do instrutor. 
b) Enumerar 5 tubos de ensaio (13 x 100mm) previamente esterilizados, com os números de 1 a 
5. Identificar com o número do grupo, turma e data. A partir de um tubo de ensaio (16 x 150mm) 
(Tubo “A”) contendo 10mL de caldo nutritivo previamente esterilizado transferir, assepticamente 
com o auxílio de uma pipeta de 5 mL, volumes de 5 mL, no tubo nº 1, em seguida transferir 4 mL 
do tubo nº 1 para o tubo nº 2 (com auxílio de uma pipeta de 5 mL), repetir este procedimento 
segundo esquema 1. Incubar o material (tubos de nº 1 a 5 e o tubo “A”) na estufa a 36ºC. Realizar 
a leitura após 48-72 horas de incubação e registrar os resultados na tabela 1. 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Diluições. 
 
 
c) Distribuição asséptica do meio LB ágar em placas de Petri (de acordo com a Figura 2); 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 
 
 
Tabela 1: Aspecto dos tubos após 48-72h horas. 
 Tubos (n°) Límpido Turvo 
Tubo “A” 
01 
02 
03 
04 
05 
 
Interpretação dos resultados 
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tubo “A”
Caldo nutritivo
5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL
n°01 n°02 n°03 n°04 n°05
5 mL
Tubo “A”
Caldo nutritivo
5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL
n°01 n°02 n°03 n°04 n°05
5 mL
36 
 
Segunda Parte 
 
Anti-sepsia de Mãos: Experimento de Price 
 
Introdução 
 
As mãos constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade 
de micro-organismos constituintes da microbiota normal da pele dos profissionais de saúde deve 
ser reduzida, assim como possíveis micro-organismos patogênicos presentes devem ser 
eliminados. 
 
Objetivo 
 
Verificar o grande número de micro-organismos que existe na pele. 
Observar a eficácia da lavagem das mãos e do uso de um anti-séptico na redução dos micro-
organismos da pele. 
 
Procedimentos 
Dividir o fundo da placa de Petri contendo Agar-sangue em três partes com canetapara vidro, e 
identificar a placa; 
Pegar um swab com assepsia, umedecê-lo em salina estéril e esfregar sobre a pele da palma da 
mão. A seguir, semear 1/3 da placa de Ágar-sangue com swab identificando “mãos sem lavar”; 
Lavar as mãos com detergente (sabão), vigorosamente em todas as superfícies, durante 1 
minutos. A seguir, pegar outro swab esterilizado, umedecer em salina esterilizada e esfregar na 
pele das mãos lavadas, então semear o segundo 1/3 da placa, e identificar: mãos lavadas: 
Realizar anti-sepsia das mãos pré-lavadas (1 minutos com sabão) com álcool (durante 1 minuto). 
A seguir utilizar de outro swab estéril umedecido em salina também esterilizada, esfregar nas 
palmas das mãos lavadas e desinfetadas e semear na terceira parte do meio de cultura. 
Identificar: mãos com anti-sépsia – seguir o esquema da Figura abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Esquema do experimento de Price (anti-sepsia de mãos) 
 
Incubar por 24-48 horas à 37ºC, e observar o crescimento de colônias nas três partes da placa. 
Fazer a contagem (quando possível) do número de colônias em cada uma das condições 
analisadas. 
 
Interpretação dos resultados 
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
__________________________________________ 
__________________________________________________________________ 
 
 
 
 
Terceira parte 
I – mãos 
sem lavar
II – mãos 
lavadas: 5 min
- sabão
III – mãos 
lavadas + 
álcool
Salina 
esterilizada
Swab estéril
I – mãos 
sem lavar
II – mãos 
lavadas: 5 min
- sabão
III – mãos 
lavadas + 
álcool
I – mãos 
sem lavar
II – mãos 
lavadas: 5 min
- sabão
III – mãos 
lavadas + 
álcool
Salina 
esterilizada
Swab estéril
37 
 
 
Eficácia da luz ultravioleta sobre micro-organismos 
 
Introdução 
 
A luz ultravioleta apresenta efeitos sobre micro-organismos, principalmente quando os mesmos 
encontram-se suspensos no ar. Lâmpadas de luz ultravioleta são utilizadas para controle de 
micro-organismos em ambientes hospitalares, em capelas, laboratórios (fluxo laminar) e para 
controle de micro-organismos do ar. Por outro lado, devido ao seu comprimentos de onda, não 
apresenta poder de penetração. 
 
 
Objetivos 
 
Verificar a ação da luz ultravioleta sobre os micro-organismos. 
Observar o baixo poder de penetração da luz ultravioleta 
 
 
Procedimentos 
 
Semear 2 placas de Petri contendo meio de cultura (LB), pela técnica do esgotamentos. 
Aguardar 15 minutos; 
Expor as placas à luz ultravioleta (dentro do fluxo laminar) por 2 minutos, da seguinte 
forma (Figura 4): 
Placa A: expor a placa semeada aberta à luz ultravioleta 
Placa B: expor a placa fechada à luz ultravioleta 
 
Incubar a 37ºC por 24-48h. Observar as placas semeadas na aula, observando o efeito da 
luz ultravioleta sobre a bactéria testada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – Esquema de procedimento a serem seguidos na verificação da ação da luz 
ultravioleta sobre Escherichia coli. 
 
Interpretação dos resultados 
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________ 
 
IMPORTANTE! 
Ao final de todos os procedimentos NÃO SE ESQUEÇAM de realizar a desinfecção 
da bancada com álcool a 70% e de organizar o local de trabalho. 
 
 
 
LUZ 
ULTRAVIOLETA
2 minutos
Placa aberta
Placa fechadaLUZ 
ULTRAVIOLETA
2 minutos
Placa aberta
Placa fechada
38 
 
AULA PRÁTICA 2 
 
11..11 Experimento 1: 
a) Fazer esfregaço de colônias bacterianas, corar pelo método de Gram, observar ao microscópio 
e discutir resultados com professor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
b) Com auxílio de um swab, remover células da mucosa oral e fazer um esfregaço, deixar secar e 
fixar. Em seguida corar pelo método de Gram, observar ao microscópio e discutir resultados com 
professor. 
 
 
1.2 Experimento 2: 
Você recebeu uma lâmina contendo dois esfregaços para coloração de Ziehl-Neelsen, após a 
coloração observe ao microscópio e discuta com professor. 
obs: A classificação deverá ser quanto à resistência ou não à descoloração com álcool ácido, 
sendo assim, teremos: Bactérias álcool ácido resistentes (BAAR) = vermelhas e Bactérias não 
álcool ácido resistentes = azul. 
 
 
 
1.3 Experimento 3: 
 
Observe a placa de agar sangue e descreva as características fenotípicas de cada bactéria. Nota-
se alguma diferença? Se sim, qual? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.4 Experimento 4: 
 
As bactérias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou não de oxigênio para 
crescerem em: aeróbias estritas, anaeróbias facultativas, anaeróbias aerotolerantes, anaeróbias 
estritas e microaerófilas. 
Você recebeu tubos de tioglicolato contendo cada um, um tipo de cultura bacteriana. O meio de 
cultura, no caso, possui um indicador de oxigênio, a rezazurina que está presente somente na 
região superior do meio ( 2 cm) e tem coloração rósea. Responda, com relação à exigência de 
O2 para seu metabolismo: 
Como é possível classificar as bactérias de cada tubo de acordo com a necessidade de oxigênio? 
Por quê? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
22 
33 
 
 
 
 
1111 
22 
33 
11 
11 
39 
 
1.5 Experimento 5: Teste da catalase 
A catalase é uma enzima produzida por certas bactérias e que desdobra o peróxido de hidrogênio 
em água e oxigênio livre (2 H
2
O
2 → 2 H2O + O2). 
Você recebeu uma placa contendo: 
 
 
 
 
 
 
 
Staphylococcus 
Streptococcus 
 
Com auxilio de uma alça remova uma porção da colônia bacteriana e transfira para uma lâmina de 
vidro. Em seguida, adicionar uma gota de H2O2 10 V sobre a bactéria e observar o aparecimento 
de bolhas (indica reação positiva). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Descreva o que você observou. 
Qual a finalidade da prova da catalase? 
 
Obs.: Quando a colônia é obtida de uma placa de Ágar-sangue, é essencial que o meio de cultura 
não seja removido da superfície, pois hemácias contêm catalase. 
 
 
 
1.6 Experimento 6: Motilidade 
 
As bactérias móveis podem conter um ou mais flagelos e são classificadas em: 
A - monotríquias (único flagelo em uma das extremidades); 
B - lofotríquias (dois ou mais flagelos em uma das extremidades); 
C - anfitríquias (tufo de flagelos em cada extremidade); 
D - peritríquias (cercadas de flagelos). 
 
 
Para verificar esta característica pode-se realizar experimento em meio líquido ou semi-sólido. 
 
Procedimento em meio líquido: 
- tocar uma colônia isolada com agulha bacteriológica estéril ou alça 
- inocular a bactéria até dissolvê-la na parede do tubo contendo o meio líquido 
- incubar por duas horas a 35oC 
 
aa bb 
H2O2 + Bactéria a H2O2 + Bactéria b 
40 
 
- montar gotas da suspensão bacteriana entre lâmina e lamínula 
- observar em microscopia de campo claro, em aumento de 400X, com diafragma semi-fechado. 
 
Interpretação: 
(+) POLAR (monotríquia ou lofotríquia com flagelos em uma das extremidades) – bactérias 
apresentam movimento de flecha. 
(+) PETRITRIQUIO – bactérias apresentam movimentos circulares. 
(-) apenas movimento browniano. 
 
 
Procedimento em meio semi-sólido. 
- tocar uma colônia bacteriana com agulha bacteriológica estéril e inocularo tubo contendo o meio 
- incubar 24h a 35oC 
- realizar a leitura 
 
Interpretação: 
(+) quando há crescimento ao redor do local inoculado 
(-) crescimento bacteriano apenas no local inoculado 
 
Você recebeu dois tubos, A e B com bactérias distintas, observe e responda: 
Qual bactéria apresenta movimento? 
Por esta técnica é possível classificar o tipo de movimento? 
 
41 
 
 
AULA PRÁTICA 3 
 
1.1 Experimento 1 
 
Você recebeu uma placa de ágar sangue (AS) e uma de ágar MacConkey (MC), devidamente 
identificadas. As bactérias, como qualquer célula viva, precisam de substâncias e nutrientes para 
viver e se multiplicarem. Quando os nutrientes são obtidos de um meio artificial, este é 
denominado MEIO DE CULTURA. 
a) Observar e descrever a características fenotípicas de cada bactéria. 
b) Analisar as placas quanto à presença ou ausência de crescimento. 
c) Responda qual dos meios de cultura pode ser classificado como: 
Meio enriquecido, 
Meio seletivo, 
Meio diferencial. 
Por quê? 
d) Faça a coloração de Gram e identifique as bactérias quanto à morfologia, arranjo e coloração. 
 
 
 
 
 AASS MMCC 
 
1.2 Experimento 2 
 
a) Observe os dois tubos A e B contendo meio líquido. É possível identificar em qual deles houve 
crescimento bacteriano? Por quê? 
 
b) É possível identificar se esta cultura bacteriana é uma cultura pura? Por quê? 
 
c) Observe esta mesma cultura semeada em uma placa contendo meio de cultura sólido. É 
possível responder a questão anterior? Por quê? 
 
1.3 Experimento 3 
Você recebeu um tubo com meio líquido contendo duas bactérias diferentes. Para obter colônias 
isoladas, você deverá: 
Semear as bactérias em meio ágar LB (Luria-Bertani: triptona,extrato de levedura, NaCl e Agar 
bacteriológico) pela técnica de esgotamento de acordo com a figura abaixo: 
 
 
 
 
 
1.3 Experimento 4: Antibiograma 
 
 
aa bb 
 
aa bb 
42 
 
1. Imergir um swab estéril na suspensão preparada, retirando o excesso do líquido na 
parede do tubo; 
2. Realizar a semeadura padrão até a metade da placa de Agar Mueller Hinton, girando-a 
em 6 direções, com o cuidado de que toda a superfície do Agar seja semeada; 
3. Deixá-la secar por aproximadamente 10 minutos sobre a bancada; 
4. Com o auxílio de uma pinça esterilizada, selecionar os discos a serem utilizados, 
dispondo-os e pressionando-os, cuidadosamente, na placa de Agar Mueller Hinton; 
5. Deixar a placa por 5 – 10 minutos sobre a bancada, antes de incubá-la a 35ºC, durante 
16-18 horas em aerobiose. 
6. Anotar os discos de antibióticos testados; 
7. Medir o tamanho dos halos de inibição com auxílio de uma régua, anotando em 
milímetros; 
8. Com ajuda de tabelas, interpretar os valores e resultados obtidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bactéria Discos com antibióticos 
 
Ampicilina 
AMP 
Carbenicilina 
CAR 
Gentamicina 
GEN 
Cefalotina 
CFL 
Ciprofloxacino 
CIP 
Estreptomicina 
EST 
Escherichia coli 
Leituras (mm) 
Resultados 
Padrões 
R≤ 13 
S≥17 
R≤19 
S≥ 23 
R≤ 12 
S≥ 15 
R≤ 14 
S≥ 18 
R≤ 15 
S≥ 21 
R≤11 
S≥ 15 
43 
 
AULA PRÁTICA 4 
 
 
ESTRUTURAS FÚNGICAS 
 
 
Fungos Filamentosos e Leveduras 
 
 Os fungos apresentam semelhanças com organismos do Reino Animal, tais como 
presença de quitina em sua parede celular e o armazenamento de glicogênio. Do mesmo modo, 
compartilham com as bactérias a capacidade de causar doenças infecciosas e métodos 
semelhantes de isolamento e culturas. Por outro lado, estes apresentam características próprias e 
diferenças em relação aos outros Reinos, o que permitiu seu agrupamento em um Reino distinto. 
O termo fungo provém do latim, fungus e significa cogumelo. 
 Consistem numa forma antiga de vida, com cerca de 400 milhões de anos. Juntamente 
com as bactérias, são considerados os principais responsáveis pela manutenção da estabilidade 
geoquímica da biosfera, e são distribuídos amplamente na natureza, seja em ambientes aquáticos 
como em terrestres. Crescem em ambientes com temperaturas elevadas, assim como em regiões 
com temperaturas muito baixas. A maioria das espécies cresce por extensão contínua e 
ramificações de estruturas filiformes denominadas hifas. 
 Alguns possuem valor comercial graças ao seu importante papel na fermentação de 
bebidas, alimentos, produção industrial de antibióticos e etanol. Por outro lado, estão também 
relacionados com muitas doenças em plantas, animais e seres humanos. 
 O Reino Fungi engloba organismos com morfologias distintas, uni e multicelulares, e 
podem ser classificados em leveduras: a) leveduras – fungos unicelulares microscópicos, que 
podem ser patogênicos; b) bolores – também denominados como fungos filamentosos, são 
multicelulares, constituídos de células microscópicas cilíndricas ligadas nas extremidades 
formando um filamento denominado hifa. Quando grande quantidade de hifas estão agrupadas, 
são visíveis a olho nu e denominadas de micélio. Podem ser patogênicas; e c) cogumelos, 
organismos macroscópicos, não-patogênicos. 
 A cultura de um micro-organismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em 
meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de 
uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente 
apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma 
composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus 
aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na 
cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema 
utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na 
observação das características culturais de determinado fungo, devemos ressaltar os seguintes 
aspectos: 
 
a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade 
de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos 
apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a 
superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando 
cultivadas a 35ºC. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo 
sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. 
b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão 
desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram 
franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação 
da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível 
patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se 
observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. 
c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização de uma colônia 
fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas 
quanto à textura em diversos tipos: 
44 
 
colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão, 
colônias granulosas (poeira): aquelas formadas por fungos que esporulam ou 
produzem grandes quantidades de conídios, 
colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, 
colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter 
superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não 
algodonosa, 
colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual