3 Técnicas biofísicas de análise

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Técnicas biofísicas 
de análise
UFRJ – FACULDADE DE FARMÁCIA 
Depto de Análises Clínicas e Toxicológicas
FFW112 - Biofísica
Professores: Mario Gandra e Aloa Machado
Prof. Mario Gandra
 
Tópicos
• Diferenças entre moléculas
• Técnicas de separação (extração e purificação)
• Técnicas de análise (identificação e quantificação)
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Conteúdo da aula
 
A era molecular
• Estudamos....
• porções do corpo;
• tecidos;
• células;
• moléculas!;
• sistemas fisiológicos integrados...
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Introdução
 
Como se distingue as coisas?
• Como diferenciar substâncias?
• Como diferenciar qualquer coisa?
• Como eu separo mulheres e homens nesta sala?
• O que me permite identificá-los e diferenciá-los?
• DIFERENÇAS..... Té
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Introdução
 
E como identificar e diferenciar moléculas?
• Quais são as diferenças entre as moléculas? (agora)
• Como manipular isso? (próximo slide)
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Introdução
Suas idéias
• 
Minhas idéias
• 
Minhas idéias
• Tamanho
• Peso
• Carga
• pI
• Densidade
• Estrutura
• Polaridade
• Afinidade
 
Como manipular essas diferenças?
• Aparelhos
• Técnicas
• Emprego da física (ou da química)
• Separar e caracterizar por diferenças
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Introdução
 
Cromatografia
• Cromatografia, um dos melhores métodos de purificação
• O russo Mikhail Semyonovich Tswet inventou a cromatografia para 
separar pigmentos de plantas (1901)
• Diferença de afinidade das substâncias da mistura com a fase 
estacionéria e a fase móvel
• Líquida (solúveis?), gasosa (voláteis), em papel (pequenas), TLC (CCD) 
(rápida)
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Técnicas de separação (purificação)
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
 
Tamanho
• Diferente de separar por massa
• Separar por massa é quase impossível!
• Cromatografia de filtração em gel
• Fase estacionária é filtro tridimensional
• Quanto menor a molécula, mais entra em poros, maior o percurso Té
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Técnicas de separação (purificação)
 
Tamanho
• Diálise
• Membrana porosa
• Difusão para um meio menos concentrado
• Conceitos de difusão e osmose
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Técnicas de separação (purificação)
 
Densidade
• Centrifugação em gradiente: separação dos componentes celulares por 
densidade
• Núcleo, mitocôndria, retículos, Golgi, fragmentos de membrana
• Proteína transmembrana: usar detergente para solubilizar e manter em 
tampão misto
• Ultracentrifugação é aconselhada para frações de baixa densidade
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Técnicas de separação (purificação)
 
Carga/polaridade
• Cromatografia de troca iônica
• Fase estacionária polar 
(carregada?)
• Atração magnética, interação 
iônica
• Diferença de afinidade 
magnética (FE e FM)
• Eluição natural ou forçada
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Técnicas de separação (purificação)
 
apolaridade
• Cromatografia de fase reversa
• Fase estacionária hidrofóbica
• Usar tampão polar para interação
• Usar tampão apolar para eluição
• É reversa porque o procedimento é oposto ao 
da cromatografia de troca iônica
• Ideal para substâncias com domínios 
hidrofóbicos
• Muitos usado para purificar proteínas
• Usado para produzir mapas peptídicos 
(HPLC)
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Técnicas de separação (purificação)
 
Tamanho
• Agora tem que ter precisão analítica
• Eletroforese para proteínas
• Gel de poliacrilamida
• Igualar cargas
• Mesma densidade de carga negativa
• Migração para polo positivo
• Maiores migram mais lentamente
• Determinação do peso molecular com muita 
precisão!
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Técnicas de análise
 
Tamanho/carga
• Focalização isoelétrica e gel bidimensional
• Campo elétrico em gel com anfólitos: gradiente de pH
• Proteínas param ao atingirem pI (carga = 0)
• Separação por pI (bom para aminoácidos também!)
• Eletroforese bidimensional: pI + peso molecular
• Como?
• Eletroforese usando gel “pós focalização”
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Técnicas de análise
 
Tamanho
• Eletroforese para ácidos nucleicos
• Gel de agarose
• Não precisa igualar cargas
• Revelação com sonda radioativa
• Autorradiografia Té
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Técnicas de análise
 
Espectrofotometria de absorção
• Usar espectro radiante para inspecionar sistemas biológicos (soluções);
• Princípio básico:
 Luz / RIV / RUV  absorção  qualidade e quantidade componentes
• Faixa utilizada: 200 a 1000 nm
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Técnicas de análise
 
Espectrofotometria de absorção
• Espectrofotometria
• Absorção de luz
• Visível, ultravioleta ou infravermelho
• Absorção por grupamentos químicos específicos
• Avaliação semiquantitativa Té
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Técnicas de análise
 
Espectrofotometria de emissão
• Fotometria de chama
• Usada exclusivamente para cátions
• Na+, K+, Ca++, etc
• Queima gera emissão de cor específica
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Técnicas de análise
 
Espectrofotometria de emissão
• Fluorimetria
• Excitação com UV
• Compostos orgânicos preservados
• Usada para determinação de substâncias fluorescentes: vitaminas, 
neurotransmissores, proteínas...
• Alteração de estrutura
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Técnicas de análise
 
Estrutura
• Cristalografia de raio x
• Raio X da proteína
• Requer cristalização prévia
• Técnica essencial para a determinação da estrutura tridimensional do DNA Té
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Técnicas de análise
 
Detecção atômica
• Difração de raio x
• Incidência de raio x em material
• Emissão de fóton característico
• Detecção desse fóton (eV)
• Identificação do elemento Té
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Técnicas de análise
 
Espectrometria de massas
• Análise fina
• Separa por massa/carga
• Espectro complexo por causa das diferenças dos isótopos
• Entretanto, muita precisão
• Atualmente, aplicação moléculas grandes, pequenas, orgânicas, 
inorgânicas, etc
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Técnicas de análise
 
apolaridade
• Cromatografia em fase gasosa
• Para amostras voláteis
• Fase móvel = gás
• Fase estacionária = líquido
• (Cromatografia gás-líquido)
• Análise de 
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Técnicas de separação (purificação)
 
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FIM
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