Avaliação Genotóxica Toxicologia Teste do micronúcleo

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AVALIAÇÃO DO POTENCIAL EFEITO 
GENOTÓXICO DE SUBSTÂNCIAS 
QUÍMICAS. 
TESTE DO MICRONÚCLEO 
INTRODUÇÃO 
SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS (NATURAIS OU 
SINTÉTICAS – MEDICAMENTOS, PESTICIDAS) 
 
 
RISCO TÓXICO AOS SERES HUMANOS 
ALTERAÇÃO DO MATERIAL DO GENÉTICO – 
POTENCIAL GENOTÓXICO 
CARCINOGÊNESE 
 
UMA BREVE REVISÃO 
Mutação é toda a alteração permanente do 
material genético de uma célula, que não 
resulta de recombinação ou da segregação 
normal dos cromossomos. 
 
Quando não é letal para a própria célula, ela 
pode propagar-se pelo corpo em crescimento 
(mutação somática) ou transmitir-se às 
gerações seguintes (mutação germinativa). 
 
INTRODUÇÃO 
A mutagênese (Genética Toxicológica) avalia os 
efeitos genotóxicos em potencial, uma vez que são 
considerados pré-requisitos importantes para o 
desenvolvimento de efeitos adversos à saúde, como 
o câncer. 
 
Quando não é letal para a própria célula, ela pode 
propagar-se pelo corpo em crescimento (mutação 
somática) ou transmitir-se às gerações seguintes 
(mutação germinativa). 
 
INTRODUÇÃO 
• Mutagênicos: agem sobre o desenvolvimento=> redução no índice 
mitótico => comprometimento no desenv. e cresc. do organismo. 
• impacto significativo sobre o “pool” gênico de uma população 
Alterações citogenéticas específicas x teratogênese 
 
Genotóxicos: 
• defeitos hereditários -mutações em células germinativas 
•efeitos teratogênicos 
•mutações pontuais, deleções, translocações e aneuploidia; 
•quebra da dupla fita de DNA, 
•aberrações cromossômicas, 
•formação de micronúcleo, 
•intercâmbio de cromátides irmãs. 
TESTES GENOTÓXICOS 
Os métodos + comumente usados para avaliar 
genotoxicidade e danos citotóxicos => 
contagem de micronúcleos (MN) e 
fragmentação de DNA - detectados em 
diferentes tipos de células pelo ensaio 
cometa. 
 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Os micronúcleos são estruturas constituídas por 
material genético cromatínico contido por um 
1998, envoltório nuclear, menores que o núcleo 
principal e resultam de fragmentos 
cromossômicos que se comportam 
independentemente dos outros cromossomos 
do cariótipo durante a divisão celular. 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Eles aparecem ao redor do necessidade de se 
utilizar o teste do micronúcleo na envoltório 
nuclear ou no citoplasma de células expostas a 
agentes genotóxicos e podem ser detectados em 
células esfoliativas dos epitélios utilizados como 
importante parâmetro para análise e avaliação 
do potencial genotóxico desses agentes. 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Portanto, a determinação da taxa de 
micronucleação, mediante análise microscópica, 
tem proporcionado uma forma simples e rápida 
na estimativa da presença de alterações 
cromossômicas. 
Os micronúcleos: 
•fragmentos cromossômicos acêntricos 
cromossomos com atraso 
durante a anáfase 
•originam-se de 
 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Testes Material Tempo Observações 
MN 
Sangue 
Medula Óssea 
Células da Mucosa Oral 
Células vegetais 
CHO, etc 
48 - 96 horas 
Avalia a capacidade de indução 
de danos cromossômicos 
estruturais e/ou numéricos 
MT 
TCI 
Sangue 
72 horas 
IPC 
48 - 72 horas 
IM 
MN = Micronúcleo; MT = Metáfases; TCI = Troca entre Cromátides Irmãs; IPC = Índice de Proliferação Celular; IM = Índice Mitótico. 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Vantagens do teste do micronúcleo: 
 
 - Mais simples; 
 - Treinamentos mais curtos; 
 - Mais rápido; 
 - Requer menos custo; 
 - Maior poder estatístico; 
 
 
 Teste do MN Metodologia 
Obtenção de 
células 
Lavagem por 
centrifugação 
com salina 
0,9%/10min 
Fixação do 
sedimento: 
Lavagem por 3x 
solução ácido 
acético:etanol (1:3) 
e permanecer nela 
24 h 
Lâminas previamente 
geladas 
Hidrólise com HCl 
5N/30min, lavadas água 
corrente, secas e coradas 
com reação de Feulgen 
1h30 min e contracoradas 
com FastGreen 1min 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
A determinação da freqüência dos micronúcleos e 
de outras alterações nucleares é realizada através 
da contagem de 1.000 células por lâmina, mediante 
objetiva de imersão em microscópio óptico comum 
segundo os seguintes critérios: 
a) tamanho menor que 1/3 do núcleo 
b) mesmo plano de foco do núcleo 
c) padrão da estrutura e coloração da cromatina 
idênticos ao núcleo 
d) nenhuma ligação com o núcleo. 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Célula binucleada Célula binucleada com 1MN 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Célula binucleada com 2MN’s Célula binucleada com 3 MN’s 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Célula binucleada com mais de 3MN’s 
O teste do micronúcleo 
em estudos 
epidemiológicos pode 
aumentar o 
conhecimento a respeito 
do potencial genotóxico 
de agentes químicos 
naturais, sintéticos, 
ambientais e elucidar 
mecanismos da ação 
carcinogênica. 
TESTE DO MICRONÚCLEO (MN) 
Tratamento estatístico: 
- frequência de MNs 
- idade 
- hábitos 
- ingestão de bebidas alcoólicas 
- exposição ao agente tóxico (tempo e 
frequência) 
 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
ANÁLISE CARIÓTIPO: 
 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
ANÁLISE DA ANÁFASE: 
 
 NORMAL ANORMAL 
Allium cepa 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
TESTE COMETA: 
Outra técnica útil para biomonitoramento GENOTÓXICO. 
 
 
 Processo rápido, simples e sensível => vários tipos de 
células 
 Possibilidade de medir a integridade do DNA em nível 
celular. 
 Pode detectar baixos níveis de danos de DNA 
 Exige um pequeno número de células por amostra, 
 Flexível 
 Curto período de tempo necessário para concluir um estudo 
 
 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
TESTE COMETA: 
 
 Células com danos no DNA 
produzem aumento da 
migração de fragmentos de 
DNA do núcleo 
"cauda de cometa". 
• A visualização de mobilidade dos fragmentos de DNA => modo 
conveniente e sensível de detectar quebra de DNA nas células. 
• O nível de base de danos no DNA varia => espécie x tipo de células; isto 
influenciará a sensibilidade do ensaio 
sangue coletado é diluído 
em solução fisiológica 
Depositar 10 L da suspensão 
celular preparada com 120 L 
de agarose de baixo ponto de 
fusão a 37º C sobre lâminas 
pré-gelatinizadas. 
 20’ em geladeira cobertas com 
lamínulas. 
 
solução de lise - 1h 
tampão NaOH com EDTA 
(pH ~13), por 20 minutos 
em corrente de 
eletroforese, no escuro 
neutralizadas com Tris, por 15 minutos e fixadas em etanol absoluto por 10 
minutos. 
METODOLOGIA - COMETA 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
 
 
A análise => microscópio de fluorescência, em objetiva de 40x. 
OUTROS TESTES GENOTÓXICOS 
TESTE COMETA: 
 
 
EXERCÍCIOS 
1- LER O ARTIGO 1 E 2 – DESCREVA A METODOLOGOGIA 
UTILIZADA NOS ENSAIOS GENOTÓXICOS UTILIZADOS E O 
FUNDAMENTO DA MESMA; 
 
2-QUAL A IMPORTÂNCIA DOS ENSAIOS GENOTÓXICOS? 
 
3-QUAIS OS CRITÉRIOS PARA ANÁLISE DO TESTE DE MN? 
 
4-QUAIS OS MATERIAIS PODEM SER UTILIZADOS PARA O 
TESTE MN E COMETA? 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
SILVA, CLAÚDIO C. Mutagênese. UCG. 2008. 
 
DA SILVA. M I. a.; OLIVEIRA, M. T. V. A. Técnicas 
Citoquímicas aplicadas às alterações biológicas 
em resposta a agressões ambientais. UNESP. 
Pós-graduação Genética. 
 
KEHDY, F. S. G. Avaliação dos efeitos 
genotóxicos da exposição ocupacional a 
pesticidas sobre agentes sanitários da Fundação 
Nacional de Saúde do Estado de Minas Gerais. 
UFMG.