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16/08/2014 1 Profa. Vera Lúcia dos Santos Fisiologia e metabolismo bacteriano Depto de Microbiologia-ICB/UFMG Nutrição bacteriana Conhecer as exigências nutricionais e ambientais dos microrganismos Como estudar microrganismos no laboratório? Cultivo “in vitro” Composição química de uma célula bacteriana (E. coli) Componentes água proteínas lipídeos LPS peptidioglicano glicogênio DNA RNA metabólitos íons inorgânicos % Massa úmida 70 15 2 1 0,7 1 1 5 3 0,3 Tipos diferentes 1 2000 4 1 1 1 1 500 350 20 Cultivo de bactérias no laboratório Macronutrientes Funções Carbono g Constituintes de carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos Oxigênio Hidrogênio Nitrogênio Enxofre Fósforo mg Potássio (K+) Atividade enzimática Cálcio Resistência ao calor do endosporo Magnésio (MG2+) Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza ribossomos e membranas Ferro (Fe2+/Fe3+) Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de proteínas transportadores de elétrons Micronutrientes μg Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr cofatores de enzimas geralmente não é preciso adicionar: presentes na água; Água desmineralizada: adicionar solução elementos traço. Fatores de crescimento Compostos orgânicos específicos, necessários em quantidades muito pequenas devido à incapacidade das células de os sintetizarem. Fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados para o crescimento in vitro dos microrganismos. 1) Aminoácidos - fundamentais para a síntese protéica 2) Purinas e pirimidinas - fundamentais na composição dos ácidos nucléicos 3) Vitaminas - fazem parte de co-fatores enzimáticos Principais tipos nutricionais dos microrganismos Classificação dos meios quanto ao estado físico Podem ser líquidos (sem agar), semisólidos ou sólidos. Líquido: obtenção de biomassa e de metabólitos em reatores Sólido: permite a obtenção de cultura pura - caracterizar um agente infeccioso 16/08/2014 2 Caracterização Classificação quanto à composição Meios sintéticos ou definidos composição química exata é conhecida Meios Complexos composição química exata não é conhecida Úteis para cultura de microrganismos com requerimentos nutricionais complexos ou desconhecidos. Hidrolisados de proteínas preparadas por digestão proteolítica parcial de carne, caseína, soja ou gelatina), extrato de carne ou extrato de levedura. Quanto a finalidade Meios diferenciais permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o. Produção de enzimas DNAse - adição substrato e verificação halo hidrólise • Agar sangue: Meio complexo, enriquecido, não seletivo • Meio diferencial porque permite verificar a existência ou não de hemólise – colônias envolvidas por zonas claras devido a lise de células vermelhas. • Streptococcus pyogenes. Meios de enriquecimento São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse. Ex: caldo de selenito de sódio- permite enriquecimento de Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações alimentares. Meios de cultura seletivos Permitem apenas o crescimento de certas espécies de bactéria. Ex: Meio de McConkey (peptona, lactose, NaCl, sais biliares e vermelho de metila como indicador de pH). Meio diferencial para fermentação de lactose - Bactérias que fermentam áçúcares produzem ácidos que reagem com vermelho de metila formando colônias rosas, colônias não fermentadoras permanecem incolores. Seletivo para bacilos gram – (bactérias de origem intestinal, enterobactérias) - Contém sais biliares e corantes que inibem o crecimento de bactérias gram +. Efeitos ambientais no crescimento microbiano - Importância: biomassa e controle 16/08/2014 3 Fatores físicos que afetam o crescimento de bactérias pH Procariotos que vivem em pH extremos parecem manter um pH interno próximo do neutro bombeando prótons para fora da célula Neutrófilos: crescem na faixa de pH entre 5 a 8 Acidófilos: crescem melhor em valores <5 Alcalófilos: crescem melhor em valores >7 pH Temperatura Temperatura ótima de crescimento psicrófilas (12 a 17°C) psicrotróficas (20 a 30°C) mesófilas (28 a 37°C) termófilas (50 a 90°C) termófilas extremas (>80°C) Efeito da temperatura Afeta a taxa de crescimento por afetar a taxa das reações enzimáticas celulares Temperatura pode afetar os padrões metabólicos, requerimentos nutricionais e a composição celular. Vida é conhecida na faixa de 0° a 130°C Atmosfera gasosa O2 e CO2, são os gases principais que afetam o crescimento De acordo com resposta ao O2, os microrganismos são classificados em: AERÓBIOS Estritos (obrigatórios): necessitam de O2 (respiração aeróbica) Microaerófilo: necessitam de O2 em níveis menores que atmosfera (respiração aeróbica) ANAERÓBIOS Aerotolerantes: não necessitam de O2mas podem tolerar sua presença (fermentação) Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor na sua presença (fermentação, respiração aeróbica) Estritos (obrigatórios): não toleram O2 (letal) (fermentação, respiração anaeróbica) Por que o O2 é tóxico para os anaeróbios? O2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiração Processos celulares geram formas reativas de O2 - são oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares Formas tóxicas do oxigênio células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para manter sua integridade 16/08/2014 4 Enzimas que inativam o O2 tóxico Caracterização de microrganismos quanto ao metabolismo de O2 (a) Aeróbio obrigatório (catalase e superóxido dismutase) (b) Anaeróbio (catalase e superóxido dismutase ausentes na maioria) (c) Aeróbio facultativo ((catalase e superóxido dismutase) (d) Microaerófilo (necessitam de baixos teores de O2) (pequenas quantidades de catalase e superóxido dismutase) (e) Aerotolerante (suportam a presença de O2, apesar de não o utilizarem) (superóxido dismutase) Meio gelatinoso com indicador redox: resarzurina Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido uso de agentes redutores nos meios de cultura Ex: tioglicolato de sódio, que reage com oxigênio, formando água remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO2; Cultivo de anaeróbios Métodos de produção de ambiente anaeróbio Uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) -Jarra de anaerobiose: adicionadas de bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio que reagem com a água liberando hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládio usada para anaeróbios aerotolerantes Cultivo de anaeróbios Métodos de produção de ambiente anaeróbio Câmara de anaerobiose Transporte de anaeróbios Embalagem formadora de anaerobiose Inserção de swab no interior do meio de cultura pré-reduzido ideal para amostras de saliva e placa dental Para amostras teciduais 16/08/2014 5 Disponibilidadede água Água deve estar disponível para o metabolismo e crescimento (90% da célula) A disponibilidade de água é geralmente expressa em termos físicos como a atividade de água (fração molar do total de moléculas de água que estão disponíveis). • Os solutos diminuem a entropia e a água é menos livre para escapar do líquido, assim a pressão de vapor é reduzida: aw diminui < 1 - Maioria das bactérias 0.91 - Maioria das leveduras 0.88 - Maioria dos fungos 0.80 - Bactérias halófilas 0.75 - Fungos xerófilos 0.65 - Leveduras osmofílicas 0.60 As células podem estar em um meio: Isotônico - Não há movimento de água para dentro ou para fora da célula Hipertônico - concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula - plasmólise Hipotônico - a concentração de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar e se romper Pressão Osmótica - força com a qual a água se move através da membrana citoplasmática a partir de uma solução de baixa concentração de soluto para uma contendo alta concentração de soluto (osmose). Efeito da concentração do íon sódio no crescimento de microrganismos 1-15% de NaCl 15ª 30% de NaCl Os efeitos osmóticos são de maior importância em ambientes salinos. Em relação a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem ser Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. Para microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação, o termo crescimento refere-se a um aumento do número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio. Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo. Crescimento microbiano Crescimento celular e fissão binária •As bactérias dividem-se em duas por fissão binária e aumentam o seu número de forma geométrica em que a sua população duplica a cada tempo de geração (Crescimento exponencial) •Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. Tempo de geração varia de acordo com sua constituição genética e condições do meio Escherichia coli se divide a cada 20 minutos em caldo em laboratório e a cada 2- 3 dias no colon. 16/08/2014 6 Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica: A – Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem. B – Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica. C – Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte D – Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas Curva de crescimento bacteriano Métodos para medida de crescimento microbiano Contagem do número de microrganismos - Direta: ao microscópio ótico - Indireta: contagem em placa, membrana filtrante e incubação. Contagem do número de células Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (câmara de Neubauer ). - Vantagens: é o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de microrganismos. - Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos microrganismos. - Desvantagem: não permite distinguir as células vivas das células mortas. CÂMARA DE NEUBAUER Ao microscópio – aumento de 400X Contagem em placas O número original de microrganismos na amostra (UFC/mL) pode ser calculado a partir do número de colônias formado e da diluição feita. MËTODO DE DILUIÇÕES SUCESSIVAS CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO Sistema de filtragem Células bacterianas na superfície da membrana (poros) A membrana filtrante foi colocada sobre o meio de cultura e a placa foi incubada. ↓ Determinação da massa celular Direto: pesagem Indireto: determinação do contéudo de N, P e C e turbidimetria Determinação do peso seco - Método que inclui centrifugação, lavagem, secagem num forno e pesagem. - Desvantagens: baixa sensibilidade e necessidade de grandes quantidades de massa orgânica. 16/08/2014 7 Medição da massa celular Turbidimetria - Baseia-se no fato de as células microbianas dispersarem a luz. A quantidade de luz detectada é proporcional à concentração de células presentes. - Quando a concentração bacteriana atinge 10 milhões de células por ml o meio aparece ligeiramente turvo. O aumento da concentração celular conduz ao aumento da turvação e menos luz é transmitida através do meio. A luz detectada pode ser medida num espectofotómetro. - Vantagens: é um método rápido e sensível. - Desvantagem: não permite descriminar entre as células vivas e mortas Profa. Vera Lúcia dos Santos Metabolismo bacteriano Depto de Microbiologia-ICB/UFMG Metabolismo Bacteriano Operar os mecanismos de transporte: armazenamento de nutrientes e excreção de produtos de escória. Mobilidade: atividade do flagelo Divisão celular Oxidação é a remoção de e- de um átomo ou molécula, (em geral acompanhada da perda de H+) Redução é quando a molécula ganha um ou mais e- (ou H+). São reações em que elétrons se movem de um doador, o agente redutor, para um receptor de elétrons, o agente oxidante. Reações de oxidação e redução (oxirredução ou redox) Cada vez que um substrato é oxidado, um outro é simultaneamente reduzido. B reduzida A oxidada Energia das ligações A energia liberada das reações de oxidação-redução tem de ser conservada para as funções celulares. A energia é armazenada na forma de compostos com ligações fosfato de alta energia; estes compostos funcionam depois como a fonte de energia para a célula executar reações que necessitam de energia. Duplas redox e potencial de redução (E´o ) Forma oxidada/forma reduzida Maior tendência de doar elétrons Maior tendência de receber elétrons 16/08/2014 8 É o processo mais comum de degradação da glucose (C H O) em duas moléculas menores, com três átomos de carbono, o ácido pirúvico (C H O). Funciona na presença ou ausência de O2. É encontrada nos maiores grupos de microrganismos Glicólise Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ 2 piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+ Via glicolítica Produção de gliceraldeído 3-P Estágio I: Reações preparatórias Via de Embden-Meyerhof (glicólise) 2 piruvato + 2ATP + 2NADH2 Metabolismo Heterotrófico (oxidação de carboidratos) Respiração aeróbia: aceptor final de elétrons – O2 Respiração anaeróbia: aceptor final de elétrons diferente do O2 Etapa s Reoxidação do NADH durantea Fermentação Na ausência de oxigênio, acumula-se o NADH produzido na glicólise uma vez que não é oxidado a NAD+ na CTE porque não há aceptor de elétrons. Isto pode implicar na paralisação da glicólise. • Alternativa: usar o próprio piruvato, ou um dos seus derivados, como aceptor de elétrons e de hidrogênios na reoxidação do NADH a NAD+. • Este processo de obtenção de energia, no qual moléculas orgânicas funcionam tanto como aceptores e doadores de elétrons, é denominado fermentação. Principais vias de fermentação Açúcares Glicólise Etanol Lactato Succinato CO2 Hidrogênio Formato Etanol 2,3-Butanodiol Formato Lactato Acetoína CO2 Hidrogênio Lactato Etanol CO2 Propionato CO2 Acetato Hidrogênio Butirato Butanol Isopropanol Acetona CO2 Escherichia Salmonella Enterobacter Propionibacterium Saccharomyces Lactobacillus Streptococcus Bacillus Clostridium Fermentação mista Fermentação Lática Fermentação Alcoólica Fermentação Propiônica Fermentação Butírica Fermentação mista Via das Pentose fosfato Bacillus subtilis, Escherichia coli, Leuconostoc menseterius e Enterococcus faecalis Gerar poder redutor e ribose (5C) Crescer na presença de compostos de 5C Via glicolítica 16/08/2014 9 Entner-Doudoroff Degradação de açúcares ácidos (glucônico, glucorônico, galacturônico) Bactérias Gram -, incluindo Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium (ausente em Gram +). Fermentativa: Zymomonas (2 CO2 + 1 ATP + 2 etanol ) Produção de Tequila, destilado obtido da fermentação do cactus Maguey no Mexico • Ocorre na matriz mitocondrial (eucarioto), citoplasma (procarioto) • O ciclo é funcional em muitas bactérias aérobicas, protozoários e maioria das algas e fungos. • A E. coli não usa este ciclo completo em condições anaeróbicas ou quando a concentração de glicose é alta. Respiração aeróbia/Ciclo de Krebs Alta produção de energia: piruvato é oxidado aerobicamente a CO2. O ácido cítrico sofre descarboxilações e desidrogenações, resultando em vários compostos intermediários. No final do processo, o ácido oxaloacético é regenerado e devolvido ao citoplasma. Nesse processo, cada acetil-CoA degradado libera três moléculas de NADH e uma molécula de FADH, duas moléculas de CO, e uma molécula de ATP Ciclo de Krebs Ocorre nas cristas mitocondriais (eucarioto) e na membrana citoplasmática bacteriana. As moléculas de hidrogênio transportadas pelo NADH e FADH (glicólise e o ciclo de Krebs) serão transportadas por uma série de transportadores até o oxigênio, formando moléculas de água, liberando energia para a produção de ATP Potencial de membrana, designado por Peter Mitchell de força próton motora (FMP) Quando os prótons são produzidos e excretados para fora da célula, durante os processos de oxido-redução da CTE, acumulam-se no exterior da célula, pois as membranas são impermeáveis a eles. Por ocorrer na presença do oxigênio, a fosforilação é denominada oxidativa. Cadeia Respiratória Fosforilação oxidativa QUIMIOSMOSE - mecanismo de síntese de ATP, utilizando o potencial quimio-elétrico da membrana citoplasmática gerado pela cadeia de transporte de elétrons. A síntese de ATP é mediado pelo sistema F1F0ATPase ou ATP sintetase. Na bactéria, a ATP sintetase está localizada na superfície interna da membrana citoplasmática. O Ciclo de Krebs e o anabolismo (Ile, Thr, Asn, Met, Lys) (Gln, Arg, Pro) 16/08/2014 10 Se um intermediário do ciclo de Krebs for utilizado para a biossíntese, ele deve ser reposto vias anapleróticas O oxaloacetato é renovado pela carboxilação do piruvato. O Ciclo de Krebs e as vias anapleróticas PEP + CO2 Oxaloacetato + P1 (maioria das bactérias – E. coli) PEP carboxilase O Ciclo do glioxilato Em plantas e em algumas bactérias, existe uma modificação do ciclo do ácido cítrico para produzir ácidos dicarboxílicos de 4C e, eventualmente glicose a partir de compostos de 2C A via alternativa contorna duas descarboxilações do CK Isocitrato liase: cliva o isocitrato produzindo succinato e glioxilato. O glioxilato condensa com o acetil- coA para formar malato pela enzima malato sintase. Metabolismo oxidativo de Proteínas São grandes para atravessarem membranas, assim são hidrolisadas em seus aminoácidos constituintes pelas enzimas proteases e peptidases. São convertidos a outras substâncias que possam entrar no ciclo de Krebs. Desaminação: remoção do grupo amino (convertido ao íon amônio NH4+ - excretado da célula) e ácidos orgânicos (ciclo de Krebs). Descarboxilação: remoção de COOH. Desidrogenação: remoção de OH G li c ó li s e Glicose Diidroxiacetona – P Gliceraldeído 3P Ácido pirúvico Acetil-coA Ciclo de Krebs Carboidratos Proteínas CTE e quimiosmose água O2 CO2 Aminoácidos Catabolismo de lipídeos Lipídeos são constituídos de ácidos graxos e glicerol Lipases: enzimas extracelulares que quebram os lipídeos em ácido graxo e glicerol, que são metabolizados separadamente. Lipídeos Glicerol Ácidos graxos B- oxidação G li c ó li s e Glicose Diidroxiacetona – P Gliceraldeído 3P Ácido pirúvico Acetil-coA Ciclo de Krebs Carboidratos Proteínas CTE e quimiosmose água O2 CO2 Aminoácidos Respiração anaeróbica A respiração anaeróbica é menos eficiente que a respiração aeróbica mas mais eficiente do que a fermentação. A menor eficiência em relação à respiração aeróbica deve-se à menor diferença de potencial de redução entre um doador de e- como o NADH e os receptores (nitrato) em comparação com o NADH e o O2. Respiração Anaeróbica O aceptor final de elétrons é uma Molécula Inorgânica diferente do O2 (incluem NO3,NO2, SO4 -2 e fumarato) O rendimento total de ATP é menor que na respiração aeróbica. Respiração Anaeróbica glucose + 3NO3 - + 3H2O → 6HCO3 - + 3NH4 +, ΔG0' = -1796 kJ glucose + 3SO4 2- + 3H+ → 6HCO3 - + 3SH-, ΔG0' = -453 kJ glucose + 12S + 12H2O → 6HCO3 - + 12HS- + 18H+, ΔG0' = -333 kJ 16/08/2014 11 Predomínio de bactérias anaeróbias 1. Bactérias (Fibrobacter succinogenes e Ruminococcus albus) e protozoários celulolíticos – celobiose e glicose livre 2. Glicose é fermentada: ácidos graxos voláteis (acético, propiônico, butírico, CO2 e metano) 3. Dieta rica em amido: Predomínio de bactérias amilolíticas: Ruminobacter amylophilus e Succinomonas amylolytica 4. Rica em feno e leguminosas: predomínio de bacteria pectinolítica- Lachnospira multiparus Fonte de energia Síntese de aminoácidos e vitaminas Metanogênicos Digestão da celulose mediada por uma cadeia alimentar microbiana de múltiplas etapas B oxidação Sintropismo Caso especial de cooperação simbiótica entre dois tipos diferentes metabolicamente de bactérias as quais dependem uma da outra para a degradação de um certo tipo de substrato por razões energéticas. Proposto para descrever a cooperação íntima de bactérias oxidantes de ácidos graxos fermentadoras com metanogênicos oxidantes do H2 1- Bactérias fermentativas hidrolíticas 2-Fermentadores 1ariosprodutoras de H2, acetato e CO2 3-Fermentadores secundários- consumidoras de H2 -Bactérias homo-acetogenicas -Bactérias metanogênicas redutoras de CO2 -Bactérias metanogênicas que descarboxilam o acetato (acetotróficas) e convertem CO2 e H2 em metano (Hidrogenotróficas) Sintropia= bactérias produtoras de H2 com um parceiro consumidor de H2 Sintropismo Anabolismo Generalizações sobre as vias biossintéticas: – As vias biossintéticas começam com a síntese das unidades estruturais necessárias para a produção de substâncias mais complexas; – As unidades estruturais são então ativadas, usualmente com a energia das moléculas de ATP. Essa energia é necessária para estabelecer as ligações covalentes que subsequentemente irão ligar as unidades estruturais. – As unidades estruturais ativadas são unidas uma à outra para formar substâncias complexas que se tornam parte estrutural ou funcional da célula. Biossíntese de polissacarídeos
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